高效液相色譜法測定聚丙交酯乙交酯支架涂層的體外降解產(chǎn)物的含量

杜福映,張花美,吳長巖,陳 方,劉莉莉,趙長帥,彭 健,沈 永,施燕平

(1.山東省醫(yī)療器械和藥品包裝檢驗研究院,濟南 250101;2.國家藥品監(jiān)督管理局生物材料器械安全性評價重點實驗室,濟南 250101;3.山東省醫(yī)療器械生物學評價重點實驗室,濟南 250101)

藥物洗脫支架在心血管領(lǐng)域已廣泛應(yīng)用,將可降解材料應(yīng)用于藥物涂層,在緩釋藥物的同時,改善了支架的生物相容性,降低了晚期支架內(nèi)血栓的風險[1-3],成為目前的研究熱點之一。

在藥物洗脫支架的研究中,藥物釋放已受到廣泛關(guān)注[4-10]。藥物釋放機理研究表明,可降解涂層中藥物的釋放主要是通過擴散機理及聚合物降解溶蝕實現(xiàn)[8,11]。另有研究表明,可降解材料涂層可提高合金的耐腐蝕性[12-13]。此外,支架球囊擴張過程中,涂層如有剝落,則會進入血液,造成血管堵塞,危害極大[14]。聚合物的降解不僅影響藥物釋放行為,還對支架平臺的腐蝕及使用安全產(chǎn)生一定作用。因此,對涂層多聚物的降解情況進行考察具有重要意義。

目前國內(nèi)外研究多以質(zhì)量損失、相對分子質(zhì)量及其分布、力學性能及熱力學性能為研究指標來評價材料降解[15-17]。然而作為涂層覆于支架表面的聚合物量較低[本工作所用支架涂層聚丙交酯乙交酯(PLGA)量僅為0.16 mg/支架],且支架涂層降解引起質(zhì)量、相對分子質(zhì)量及熱力學性能的變化,其準確數(shù)值難以獲取。因此,建立靈敏度高、重復性好、操作簡便的測定方法已迫在眉睫。本工作旨在對一種新型可吸收鋅合金藥物洗脫冠脈支架系統(tǒng)(以下皆簡稱支架)中聚合物涂層的體外降解性能進行考察,采用高效液相色譜法(HPLC)測定降解液中乙醇酸、L-乳酸的含量,并對降解過程中支架的表觀形貌進行觀察,進而評估藥物涂層的降解情況,為支架設(shè)計、使用提供技術(shù)參考。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent1260型高效液相色譜儀;Mettler Toledo XPR2型微量電子天平;SHA-C型往返水浴振蕩器;Millipore-Q 型超純水系統(tǒng);ZEISSSIGMA 300型熱場發(fā)射掃描電子顯微鏡(SEM);BRUKER XFlas 6/60型能譜儀;Bright KAS-2000F型鉑金靶型離子濺射儀。

乙醇酸和L-乳酸標準儲備溶液:1 g·L－1,分別稱取乙醇酸和L-乳酸對照品約10 mg,用水溶解并定容至10 mL,于4 ℃保存。

混合標準溶液系列:取適量的乙醇酸和L-乳酸標準儲備溶液,用水逐級稀釋,配制成乙醇酸質(zhì)量濃度分別為1.99,9.93,19.86,39.72,59.58 mg·L－1,L-乳酸質(zhì)量濃度分別為2.92,14.60,29.20,58.39,87.59 mg·L－1的混合標準溶液系列,分別用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.8±0.2。

乙醇酸對照品的純度不小于99.0%;L-乳酸對照品的純度為90.5%;磷酸為優(yōu)級純;試驗用水為去離子水。

支架來自某公司,PLGA 的標示值為0.16 mg/支架。

1.2 儀器工作條件

XBridge Shield RP18 色譜柱(250 mm ×4.6 mm,3.5μm);柱溫40 ℃;檢測波長214 nm;進樣量20 μL;流 量0.2 mL·min－1;流動相 為20 mmol·L－1磷酸二氫鉀溶液(磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.8);等度洗脫。

1.3 試驗方法

取支架5個,將每個支架用尼龍繩穿過并懸吊于50 mL離心管中,用已預熱至37 ℃的10 mL 磷酸鹽緩沖液(PBS,pH 7.4)將所有支架浸沒。將離心管置于37℃往返恒溫水浴振蕩器中振蕩,轉(zhuǎn)速為60 r·min－1。分別在0,7,14,21,28 d時將支架取出,超純水沖洗后,吸干表面水分后置于放有10 mL PBS(pH 7.4)的離心管中,重新放回37 ℃水浴振蕩器中,直至試驗結(jié)束。取每個時間點降解液,用磷酸調(diào)節(jié)pH 至2.8±0.2,經(jīng)0.20μm 濾膜過濾后進行HPLC測定。

取各降解階段的支架樣品,用導電膠黏貼固定至SEM 樣品臺上,經(jīng)離子濺射儀噴金(鉑金)后進行形貌觀察。

2 結(jié)果與討論

2.1 支架涂層的表征

體外降解試驗開始前,對支架涂層進行表征。按照臨床使用方法,將球囊擴張后,取支架進行測定、分析。結(jié)果顯示:支架涂層的可降解材料為乙醇酸、L-乳酸的開環(huán)共聚物,乙醇酸和L-乳酸的質(zhì)量比為30∶70;重均分子量為1.5×105,數(shù)均分子量為0.9×105,分布系數(shù)為1.7(以聚苯乙烯標準品為對照);PLGA 的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度為48.2 ℃。SEM圖像顯示支架涂層完整,未有脫落現(xiàn)象的發(fā)生。

2.2 色譜行為

按儀器工作條件對乙醇酸、L-乳酸混合標準溶液進行測定,其色譜圖見圖1。

圖1 混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solution

結(jié)果表明:乙醇酸和L-乳酸的保留時間分別為14.8,18.8 min,各色譜峰無拖尾、峰形對稱完整,達到較好分離,專屬性較好;乙醇酸、L-乳酸的測定也不受其他水溶性降解產(chǎn)物干擾。在體外降解過程中,PLGA 逐漸水解為相對分子質(zhì)量更小的多聚物和寡聚物,乙醇酸、L-乳酸為其終產(chǎn)物,而相對分子質(zhì)量較大的產(chǎn)物不能溶解于降解液中,進樣前被濾去。

2.3 標準曲線、檢出限和測定下限

按照儀器工作條件對混合標準溶液系列進行測定,以乙醇酸和L-乳酸的質(zhì)量濃度為橫坐標,對應(yīng)的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果表明:乙醇酸和L-乳酸的質(zhì)量濃度在一定范圍內(nèi)與對應(yīng)的峰面積呈線性關(guān)系,線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)見表1。

根據(jù)3倍信噪比(S/N)計算方法的檢出限(3S/N),根據(jù)10 倍信噪比計算方法的測定下限(10S/N),結(jié)果見表1。

由表1 可知:乙醇酸的檢出限為0.50 mg·L－1,測定下限為2.00 mg·L－1;L-乳酸的檢出限為0.70 mg·L－1,測定下限為3.00 mg·L－1。

表1 線性參數(shù)、檢出限和測定下限Tab.1 Linearity parameters,detection limits and lower limits of determination

2.4 精密度試驗

取空白降解樣品溶液(樣品基質(zhì)為PBS)若干份,分別加入低、中、高等3 個濃度水平的乙醇酸、L-乳酸混合標準溶液,按照試驗方法進行處理,平行測定6 次,記錄峰面積,計算其相對標準偏差(RSD),結(jié)果見表2。

表2 精密度試驗結(jié)果(n＝6)Tab.2 Results of test for precision(n＝6)

由表2可知,乙醇酸的RSD 為0.12%～2.7%,L-乳酸的RSD 為0.14%～2.5%,說明方法具有較高的精密度,滿足分析要求。

2.5 回收試驗

取空白降解樣品溶液(樣品基質(zhì)為PBS)若干份,分別加入低、中、高等3 個濃度水平的乙醇酸、L-乳酸混合標準溶液,按照試驗方法進行處理、測定,計算加標回收率,結(jié)果見表3。

表3 回收試驗結(jié)果Tab.3 Results of test for recovery

由表3可知:乙醇酸的加標回收率為99.5%～118%,L-乳酸的加標回收率為91.6%～102%,說明方法具有較高的準確度,滿足分析要求。

2.6 樣品分析

2.6.1 降解液中乙醇酸、L-乳酸的測定

按儀器工作條件對降解液中乙醇酸、L-乳酸進行測定,并計算各時間點的累積量,結(jié)果見表4。

表4 降解產(chǎn)物的累積量Tab.4 Cumulative amounts of the degradation products mg

由表4可知:在降解的前7 d,降解液中乙醇酸、L-乳酸的含量低于方法的檢出限;隨后在降解液中檢出乙醇酸、L-乳酸,且累積釋放量逐漸增加,28 d內(nèi)的總量為0.902 5 mg,降解回收率約為113%,說明支架中的聚合物涂層基本完全降解。

2.6.2 支架表觀形貌的變化

采用SEM 對降解后經(jīng)干燥的支架進行觀察,如圖2所示,分別為支架降解0,7,14,21,28 d的SEM 圖。如圖2(a)所示,本工作所用支架涂層表面完整,光滑且無明顯缺陷。隨著降解進行,聚合物水解為小分子并釋放到降解液中,光滑的涂層表面逐漸出現(xiàn)微小孔隙[圖2(b)],孔隙隨后變大[圖2(c)]并連成較大的洞[圖2(d)],直至完全溶蝕至降解液中[圖2(e)]。將28 d樣品放大約1萬倍,如圖2(f)所示,聚合物涂層降解后,金屬表面形成一層薄膜,能譜分析結(jié)果顯示,除含有鋅元素(質(zhì)量分數(shù)63.6%)外,還含有碳、氧、鈉等元素,可能是鋅和鈉的碳氧化物薄膜,該膜能夠繼續(xù)保護鋅支架,防止支架過快腐蝕。

圖2 降解中的支架SEM 圖Fig.2 SEM images of the degrading stents

本工作采用HPLC 測定新型藥物洗脫支架涂層聚合物的降解產(chǎn)物乙醇酸、L-乳酸的含量,該測定方法操作簡單、靈敏度高、精密度與回收率均滿足測定要求;同時通過SEM 直觀、形象地觀察到支架降解過程中的形貌變化,達到測定、分析新型藥物洗脫支架涂層聚合物的降解產(chǎn)物乙醇酸、L-乳酸的目的,為支架設(shè)計、使用提供了技術(shù)參考。