宮頸癌組織中HPV16 E6、E7蛋白水平與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

路 玲，張媛媛，徐 瑤，吳寶華，徐 蕾，吳海燕

(1.成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦科，四川 成都 610500；2.新疆醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院婦科，新疆 烏魯木齊 830054)

宮頸癌是全球女性最常見的生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，據(jù)統(tǒng)計(jì)2018年全球?qū)m頸癌新發(fā)病例超過56萬人，由于宮頸癌導(dǎo)致的死亡病例超過31萬人[1]。宮頸癌是我國(guó)女性發(fā)病率第二高的惡性腫瘤，早期宮頸癌由于癥狀和體征不明顯易被忽略，導(dǎo)致疾病的進(jìn)展和蔓延，晚期宮頸癌患者預(yù)后通常較差，五年生存率低于40%，嚴(yán)重威脅我國(guó)女性健康安全[2]。過去的研究已證實(shí)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與人乳頭瘤病毒(human papilloma virus，HPV)感染密切相關(guān)，目前HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV35等15種高危型HPV已被報(bào)道參與宮頸癌的發(fā)生和進(jìn)展[3]，其中又以HPV16、HPV18感染率最高，占所有高危型HPV感染的70%以上[4]。16型人乳頭瘤病毒E6蛋白(human papilloma virus type 16 E6 protein，HPV16 E6)和16型人乳頭瘤病毒E7蛋白(human papilloma virus type 16 E7 protein，HPV16 E7)均是HPV16基因編碼的蛋白質(zhì)，相關(guān)研究表明其參與宮頸癌[5]、非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)[6]的發(fā)生和進(jìn)展，但宮頸癌中HPV16 E6、HPV16 E7水平與患者臨床病理特征和預(yù)后的關(guān)系尚不完全明確，本研究通過免疫組織化學(xué)法檢測(cè)宮頸癌組織中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表達(dá)情況，旨在為宮頸癌患者的治療及預(yù)后評(píng)估提供相關(guān)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取2016年3月—2018年3月于成都醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院行宮頸癌根治術(shù)的宮頸癌患者87例，年齡25～73歲，平均(50.11±10.14)歲；采用國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Obstetrics and Gynecology，F(xiàn)IGO)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行分期，其中ⅠA期～ⅠB1期56例，ⅠB2期～ⅡA期31例；中、高分化60例，低分化27例。留取每例患者術(shù)中切除的腫瘤組織、癌旁組織(距腫瘤組織>2 cm)、正常宮頸組織標(biāo)本，每種組織標(biāo)本為一組。本研究中選取的左右組織均為宮頸癌根治術(shù)中收集到的腫瘤組織、癌旁組織以及正常組織，組織新鮮，經(jīng)甲醛固定后采用石蠟包埋保存。納入標(biāo)準(zhǔn)：①患者均初發(fā)宮頸癌，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)《宮頸癌診療規(guī)范(2018年版)》[7]；②患者身體狀況良好，能夠接受手術(shù)治療；③患者術(shù)前未接受放、化療、靶向治療及生物免疫治療；④患者未合并其他惡性腫瘤、自身免疫性疾病、精神神經(jīng)疾病。排除標(biāo)準(zhǔn)：①患者為宮頸癌復(fù)發(fā)或其他臟器腫瘤轉(zhuǎn)移；②患者合并心臟、腎臟等重要臟器功能不全；③患者術(shù)前接受過放、化療、靶向治療及生物免疫治療。采用電話、微信、電子郵件、門診等方式對(duì)患者進(jìn)行隨訪，隨訪間隔為3個(gè)月，隨訪患者死亡則停止隨訪，隨訪時(shí)間截止至2021年3月。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核并通過，所有患者及家屬均知情同意且簽署知情同意書。

1.2方法

1.2.1試劑與耗材 HPV16 E6、HPV16 E7蛋白兔抗人一抗均購(gòu)自美國(guó)SCBT公司；SP免疫組織化學(xué)法試劑盒、DAB-Kit顯色液、磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer salin，PBS)、蘇木精染液、中性樹膠均購(gòu)自北京中杉金橋生物遇險(xiǎn)公司；高性能組織病理切片、光學(xué)顯微鏡均購(gòu)自德國(guó)徠卡公司。

1.2.2免疫組織化學(xué)法檢測(cè)HPV16 E6、HPV16 E7表達(dá)水平 將病理組織切片采用二甲苯脫蠟處理，梯度乙醇水化后滴加3%過氧化氫溶液封閉15 min消除內(nèi)源酶，加入檸檬酸型抗原修復(fù)液(pH=6.0±0.1)，采用高壓抗原修復(fù)法修復(fù)抗原，冷卻后使用PBS沖洗，滴加山羊血清封閉內(nèi)源性生物素。HPV16 E6、HPV16 E7一抗均按照說明書所示進(jìn)行1∶100稀釋，與切片在4 ℃濕盒中孵育過夜，次日PBS沖洗后加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫下孵育1 h，PBS沖洗后滴加DAB-Kit顯色30 s左右，水洗終止顯色，再滴加蘇木精復(fù)染1 min，梯度酒精脫水后中性樹膠封片，顯微鏡下觀察并對(duì)染色結(jié)果進(jìn)行評(píng)分。

1.2.3結(jié)果判讀 顯微鏡下觀察HPV16 E6、HPV16 E7蛋白均表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿中，但主要在細(xì)胞核中表達(dá)。以鏡下出現(xiàn)棕黃色顆粒為蛋白陽性表達(dá)，高倍鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野并計(jì)數(shù)1 000個(gè)細(xì)胞，根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分。根據(jù)染色強(qiáng)度評(píng)分：未著色為0分、淡黃色為1分、棕黃色為2分、褐色為3分；根據(jù)陽性細(xì)胞所占比例進(jìn)行評(píng)分：<10%為0分、10%～40%為1分、40%～70%為2分，>70%為3分。以上述兩項(xiàng)得分相乘，<2分為蛋白陰性表達(dá)，2～3分為(+)，4～7分為(++)，≥8分為(+++)，已評(píng)分≥2分為蛋白陽性表達(dá)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件分析數(shù)據(jù)。計(jì)量資料比較采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，采用Kaplan-Meier生存曲線比較患者生存情況，采用COX回歸分析各項(xiàng)因素對(duì)患者預(yù)后的影響。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1不同組織中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表達(dá)情況 癌旁組織中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白陽性率高于正常組織，腫瘤組織中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白陽性率高于癌旁組織和正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表1。

表1 不同組織中HPV16 E6、E7蛋白陽性率比較

2.2HPV16 E6、HPV16 E7蛋白與臨床病理特征的關(guān)系 3中組織中HPV16 E6、HPV16 E7蛋白表達(dá)在不同的患者年齡、腫瘤組織學(xué)類型中差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但在腫瘤FIGO分期、分化程度、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、肌層浸潤(rùn)深度以及腫瘤直徑中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2，3。

表2 HPV16 E6蛋白與臨床病理特征的關(guān)系

表3 HPV16 E7蛋白與臨床病理特征的關(guān)系

2.3HPV16 E6、HPV16 E7與患者生存率的關(guān)系 截至2021年3月，宮頸癌患者87例中存活60例，死亡25例，失訪2例，患者3年生存率68.97%，所有死亡患者均死于宮頸癌復(fù)發(fā)或進(jìn)展。Kaplan-Meier生存曲線分析結(jié)果顯示前宮頸癌組織HPV16 E6及HPV16 E7蛋白陽性表達(dá)患者3年生存率低于陰性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 HPV16 E6、HPV16 E7表達(dá)與患者生存率的關(guān)系

2.4HPV16 E6、HPV16 E7與患者預(yù)后的關(guān)系 以患者預(yù)后(預(yù)后良好=0，預(yù)后不良=1)為自變量，以HPV16 E6(陰性=0，陽性=1)、HPV16 E7(陰性=0，陽性=1)、年齡(<50歲=0，>50歲=1)、FIGO分期(ⅠA～ⅠB1=0，IB2～ⅡA=1)、組織學(xué)分型(腺癌=0，鱗癌=1)、分化程度(低分化/中=0，高分化=1)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(未合并=0，合并=1)、肌層浸潤(rùn)深度(<1/2=0，≥1/2=1)、腫瘤直徑(≤4 cm=0，>4 cm=1)，多因素分析顯示，HPV16 E6陽性、HPV16 E7陽性、FIGO分期(IB2～ⅡA)、肌層浸潤(rùn)深度(≥1/2)、腫瘤直徑(>4 cm)均可作為宮頸癌患者預(yù)后不良的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P<0.05)，見表4。

表4 HPV16 E6、HPV16 E7與患者預(yù)后的多因素回歸分析

3 討 論

研究表明，宮頸癌的發(fā)生發(fā)展與HPV感染具有密切聯(lián)系，在宮頸癌組織中檢出率極高，持續(xù)HPV感染能夠引起宮頸不典型增生，是宮頸癌的常見誘因之一[8]。隨著醫(yī)學(xué)研究的進(jìn)步，到目前為止人類已分離并鑒定了超過150種HPV基因型，并根據(jù)其致癌能力的差異將HPV分為主要引起良性病變的低危型HPV(如HPV6型、11型)和能夠引起細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的高危型HPV(如HPV16型、18型)[9]。HPV是一種小型環(huán)狀DNA病毒，主要感染皮膚以及生殖器，但相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道HPV與口腔鱗癌、乳腺癌等惡性腫瘤的發(fā)生相關(guān)，但結(jié)果尚不完全明確[10-11]。

病毒蛋白HPV16 E6、E7與HPV的致癌性密切相關(guān)，研究顯示E6、E7蛋白不具備酶的活性，通過與宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白形成復(fù)合物的形式參與細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)控[11]。E6蛋白能夠與細(xì)胞內(nèi)泛素連接酶結(jié)合并改變構(gòu)象，特異性結(jié)合細(xì)胞內(nèi)p53蛋白，導(dǎo)致p53泛素化并降解[12-13]，p53是目前已知具有最強(qiáng)的抑癌基因，E6通過降解p53表達(dá)產(chǎn)物抑制抑癌基因活性，從而參與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展，具有較強(qiáng)的促腫瘤作用。而E7蛋白能夠與抑癌基因pRb產(chǎn)物特異性結(jié)合并導(dǎo)致其失活，導(dǎo)致細(xì)胞周期失控，抑制細(xì)胞凋亡過程，引起細(xì)胞過度增殖，誘導(dǎo)腫瘤疾病的產(chǎn)生[14]。相關(guān)研究表明HPV感染后E6、E7共同發(fā)揮作用，E7蛋白促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，而E6蛋白大大提高E7的致癌能力，僅E7蛋白異常表達(dá)常導(dǎo)致尖銳濕疣等良性病變的發(fā)生，而聯(lián)合E6蛋白異常表達(dá)則常導(dǎo)致惡性病變而發(fā)生。

本研究顯示宮頸癌組織中HPV16 E6、E7蛋白陽性率明顯高于癌旁組織和正常組織，且與腫瘤FIGO分期、分化程度、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況、肌層浸潤(rùn)深度以及腫瘤直徑相關(guān)，提示宮頸癌組織中HPV16 E6、E7蛋白存在過表達(dá)情況，且促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)和進(jìn)展。李芳等[15]研究顯示HPV16 E6、E7 DNA水平升高對(duì)宮頸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有預(yù)警作用，可作為反映宮頸癌淋巴結(jié)微轉(zhuǎn)移的指標(biāo)；王慧玲等[16]研究顯示抑制宮頸癌細(xì)胞中HPV16 E6、E7蛋白的表達(dá)能夠抑制宮頸癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。上述結(jié)果均反映HPV16 E6、E7蛋白過表達(dá)促進(jìn)了宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展。本研究結(jié)果顯示HPV16 E6、E7蛋白陽性的宮頸癌患者3年生存率低于陰性患者，單因素回歸分析結(jié)果顯示HPV16 E6、E7蛋白陽性表達(dá)均能夠給增加患者死亡風(fēng)險(xiǎn)，而多因素回歸分析結(jié)果顯示HPV16 E6、E7蛋白陽性表達(dá)均與患者預(yù)后不良相關(guān)，可作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)發(fā)揮臨床作用。

綜上所述，宮頸癌患者腫瘤組織中HPV16 E6、E7蛋白呈高表達(dá)，且與患者臨床病理特征和預(yù)后相關(guān)，可作為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)，可能為宮頸癌診斷和治療的提供相關(guān)靶點(diǎn)，本研究的不足之處在于研究樣本量較少，且能夠?qū)PV16 E6、E7蛋白促進(jìn)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的機(jī)制進(jìn)行研究，需要在后續(xù)研究中加以補(bǔ)足。