AQP4、FASN、EphA2在腦膜瘤組織中的表達(dá)及相關(guān)性研究

李麗青，馮 景，劉東旭,劉 穎

(1.河北省保定市第二醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 保定 071051；2.河北省定州市人民醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 定州 073000；3.河北省保定腦血管病醫(yī)院神經(jīng)外科，河北 保定 071028)

腦膜瘤屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中較為常見的原發(fā)性顱內(nèi)腫瘤疾病，其發(fā)生多以良性為主，該疾病在早期無明顯的臨床癥狀，后期可因為腫瘤的變化對神經(jīng)系統(tǒng)造成壓迫而出現(xiàn)臨床癥狀，且女性的發(fā)病率高于男性[1]。臨床對于腦膜瘤的治療常以手術(shù)的方式為主要治療手段，雖然腫瘤在進(jìn)行手術(shù)中被完全切除，但也會存在5%～15%的復(fù)發(fā)率，并且復(fù)發(fā)率會隨著病情分級程度的升高而提高，對患者正常生活造成不可估量的嚴(yán)重影響[2]。因此，為了讓腦膜瘤得到及早的發(fā)現(xiàn)和治療，尋找較為有效的治療手段已成為當(dāng)下相關(guān)臨床工作者十分重要的研究任務(wù)之一。水通道蛋白4(aquaporin 4，AQP4)屬于機(jī)體內(nèi)的內(nèi)在蛋白家族成員之一，是一種選擇性的水通道內(nèi)在膜蛋白，在腦內(nèi)分布較為廣泛，能夠準(zhǔn)確反應(yīng)腦部疾病[3]。脂肪酸合成酶(fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)是催化細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶，作用于脂酸的合成和運(yùn)轉(zhuǎn)，在多種腫瘤疾病中呈現(xiàn)出異常高水平表達(dá)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4]。上皮細(xì)胞激酶 A2(epithelial kinase A2，EphA2)廣泛存在于機(jī)體大腦內(nèi)，屬于一種酪氨酸激酶受體超家族中的成員之一，在機(jī)體組織中呈現(xiàn)出低表達(dá)水平，當(dāng)出現(xiàn)腫瘤病變，會出現(xiàn)急劇上升狀態(tài)，參與腫瘤的營養(yǎng)供應(yīng)[5]。既往雖有相關(guān)研究分別對其在腦膜瘤中的相關(guān)機(jī)制進(jìn)行分析，但關(guān)于三者之間的相關(guān)性以及與該疾病的相關(guān)性研究較少。鑒于此，本研究將分析AQP4、FASN、EphA2在腦膜瘤組織中的相對表達(dá)量以及對在腦膜瘤中的相關(guān)性研究進(jìn)行分析。

1 資料與方法

1.1一般資料 隨機(jī)選取2018年1月—2021年6月在我院收進(jìn)行治療的腦膜瘤患者43例，切其腦膜瘤組織，將其分為腦膜瘤組，其中包括男性16例，女性27例，年齡26～56歲，平均(42.03±9.11)歲，依據(jù)WHO中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤分級標(biāo)準(zhǔn)[6]，對腦膜瘤進(jìn)行分級，其中Ⅰ級23例，Ⅱ級14例，Ⅲ級6例。同時選取因外傷手術(shù)而切除的腦膜組織43例，其中男性15例，女性28例。年齡23～61歲，平均(41.12±7.55)歲。

患者對本研究均知情并簽署知情同意書，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2納入標(biāo)準(zhǔn)和排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合歐洲神經(jīng)腫瘤協(xié)會對腦膜瘤的診斷和治療標(biāo)準(zhǔn)[7]；②患者術(shù)前未接受放療治療；③均為首次手術(shù)標(biāo)本；④腦膜瘤患者均為首次發(fā)?。虎菀话阗Y料齊全。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前具有放化療史；②伴有其他惡性腫瘤疾病者；③既往具有相關(guān)腦血管病史者；④進(jìn)行過相關(guān)顱腦手術(shù)者。

1.3方法

1.3.1AQP4相對表達(dá)量檢測 提取正常腦膜組織、腦膜瘤組織標(biāo)本各100 mg。采用反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法測定AQP4相對表達(dá)量，采用AQP4試劑盒(上海將來實業(yè)股份有限公司)提取血液內(nèi)RNA，進(jìn)行cDNA合成和擴(kuò)增，條件參數(shù)為預(yù)火90 ℃，預(yù)變性30 min，取出降溫至90 ℃，變性5 s，迅速降溫至58 ℃，退火20 s，溫度保持60 ℃，延伸45 s，40個循環(huán)，重復(fù)實驗3次。內(nèi)參GAPDH上游引物：5′-GTCAAGGCTGAGAACGGGAA-3′，下游引物：5′-AAATGAGCCCCAGCCTTCTC-3V；AQP4上游引物：5V-ATTGGGAGTCACCACGG-TTCAT-3′，下游引物：5′-TGGATTCATGCTGGC-TCCGGTATV3′。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-△△Ct方法計算AQP4相對表達(dá)量。

1.3.2FASN、EphA2相對表達(dá)量檢測 采用免疫組織化學(xué)法測定FASN、EphA2表達(dá)，將待檢腦膜瘤組織、正常腦膜組織石蠟切片(切片厚度5 μm)脫蠟至水，并經(jīng)10%的多聚甲醛進(jìn)行固定，二甲苯透明，3% H2O2條件下避光孵育5～8 min，蒸餾水/PBS分別洗滌2/3次，梯度乙醇脫水，并進(jìn)行石蠟包埋，常溫孵育5 min，去除PBS，滴加一抗(兔抗鼠)，4 ℃孵育過夜，次日PBS緩沖液洗滌3次，5 min/次，加入DAB顯色6 min，根據(jù)顏色變化(棕色本底出現(xiàn))終止反應(yīng)，通過蘇木精進(jìn)行復(fù)染、中性樹膠封固后，通過使用電子顯微鏡(北京Quantum量子科學(xué)儀器貿(mào)易有限公司，型號：LVEM5)×400進(jìn)行觀察。記錄其相對表達(dá)量。

1.4統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 26.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)。計量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗、配對t檢驗、F檢驗，采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行ROC曲線分析AQP4、FASN、EphA2對腦膜瘤的預(yù)測價值，采用Pearson相關(guān)性分析相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1正常腦膜組織、腦膜瘤組織AQP4、FASN、EphA2相對表達(dá)量比較 與正常腦膜組織對比，腦膜瘤組織AQP4、FASN、EphA2相對表達(dá)量較高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 正常腦膜組織、腦膜瘤組織AQP4、FASN、EphA2相對表達(dá)量比較

2.2不同臨床病例特征組AQP4、FASN、EphA2表達(dá)對比 AQP4、FASN、EphA2相對表達(dá)量與腦膜瘤患者的年齡、腫瘤直徑、腦膜尾征無明顯相關(guān)性，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。AQP4、FASN、EphA2相對表達(dá)量與腦膜瘤分級、瘤周水腫、骨侵犯具有相關(guān)性，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。其中Ⅱ級、Ⅲ級、有瘤周水腫、存在骨侵犯的AQP4、FASN、EphA2相對表達(dá)量均顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

表2 不同臨床病理特征組AQP4、FASN、EphA2相對表達(dá)量對比

2.3腦膜瘤組織中AQP4、FASN、EphA2的相關(guān)性 腦膜瘤組織的AQP4、FASN表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.506，P<0.001)；FASN、EphA2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.528，P<0.001)；AQP4EphA2表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.507，P<0.001)。見圖1。

圖1 AQP4、FASN、EphA2之間相關(guān)性分析

2.4AQP4、FASN、EphA2表達(dá)對腦膜瘤的預(yù)測價值 ROC曲線分析顯示，與AQP4、FASN、EphA2單項診斷相比，三項聯(lián)合對腦膜瘤的診斷價值較高(P<0.05)。見表3，圖2。

表3 ROC曲線圖分析AQP4、FASN、EphA2表達(dá)對腦膜瘤的預(yù)測價值

圖2 ROC曲線圖

3 討 論

腦膜瘤在顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤中較為常見，而對于腦膜瘤治療的主要手段，臨床常以手術(shù)為主[8]。當(dāng)下，對于腦膜瘤疾病的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，可能是由于多種因素致使蛛網(wǎng)膜產(chǎn)生了基因變異，抑或者是因為所處的內(nèi)環(huán)境發(fā)生變化而引起，從而使得蛛網(wǎng)膜帽狀細(xì)胞進(jìn)行大量增殖，無法進(jìn)行有效抑制，從而發(fā)展為腦膜瘤[9]。據(jù)相關(guān)研究指出，腦膜瘤的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，可能與某些內(nèi)部環(huán)境的變化以及遺傳變異等因素相關(guān)[10]。經(jīng)研究表明，AQP4、FASN、EphA2異常表達(dá)，與腦膜瘤的發(fā)生、發(fā)展具有密切關(guān)系。故測定不同指標(biāo)對評估腦膜瘤病情的發(fā)展具有重要作用。

AQP4屬于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中重要的水通道蛋白，位于機(jī)體染色體18q 11.2與q 12.1之間的連接處，主要分布于軟腦膜、海馬齒狀回、下丘腦、小腦蒲內(nèi)，參與腦部疾病的發(fā)展以及腦脊液的形成、吸收全過程[11]。據(jù)相關(guān)研究指出，AQP4可能機(jī)體腦中水分的含量產(chǎn)生一定影響，在一些腦腫瘤疾病中，都會出現(xiàn)AQP4表達(dá)升高，由此可認(rèn)為，AQP4可能與腦水腫、腦膜瘤等疾病的發(fā)生具有緊密關(guān)聯(lián)，可能參與該疾病病情發(fā)展的全過程[12]。在此基礎(chǔ)上，本研究發(fā)現(xiàn)，AQP4在腦膜瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)狀態(tài)，對腫瘤的發(fā)展重要影響。與該上述相關(guān)研究結(jié)果保持一致。分析原因，高滲透壓、pH值降低、缺氧等能夠上調(diào)AQP4表達(dá)，AQP4在腦膜瘤中的表達(dá)可能受到以上因素的影響[13]。在腦膜瘤發(fā)生后，其機(jī)體內(nèi)的新生血管通透性較高，導(dǎo)致其腫瘤細(xì)胞始終處于高缺氧狀態(tài)，從而上調(diào)AQP4表達(dá)，而長期的缺氧會導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部呈現(xiàn)酸性，這也可能對AQP4表達(dá)產(chǎn)生影響?？梢娤抡{(diào)AQP4表達(dá)可能是控制腦膜瘤進(jìn)一步發(fā)展的關(guān)鍵。

FASN是由2條相同的多肽合成而來，是一種催化內(nèi)源性脂肪酸并起到關(guān)鍵作用的多功能酶[14]。能夠?qū)?xì)胞的脂類代謝進(jìn)行一定程度的影響，參與內(nèi)源性之類物質(zhì)的合成，并且受到營養(yǎng)或激素信號的調(diào)控[15]。據(jù)相關(guān)研究表明，在腫瘤疾病當(dāng)中，F(xiàn)ASN呈現(xiàn)高表達(dá)，是因為HER2表達(dá)升高能夠激活PI3K/AKT通過，從而增加FASN的轉(zhuǎn)錄、翻譯及蛋白穩(wěn)定，而FASN的過表達(dá)也會增強(qiáng)HER2信號傳導(dǎo)，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[16]。由此可認(rèn)為，F(xiàn)ASN與腦膜瘤疾病之間也具有緊密關(guān)聯(lián)，可能參與該疾病的發(fā)生、發(fā)展。再此基礎(chǔ)上，本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)ASN的相對表達(dá)量在腦膜瘤疾病中呈現(xiàn)異常過表達(dá)狀態(tài)，與上述相關(guān)研究結(jié)果相符。分析其原因，可能是因為FASN為腫瘤細(xì)胞生存的必要條件，且與病情的發(fā)展呈正相關(guān)，以此得出，F(xiàn)ASN可能參與腦膜瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展全過程，并且能夠有效反映出腦膜瘤疾病的嚴(yán)重程度，能夠在進(jìn)一步的研究中成為腦膜瘤疾病的關(guān)鍵性診斷指標(biāo)。

EphA2是130 000 a的跨膜糖蛋白，也是VM相關(guān)的重要信號通路蛋白，其中含有976個氨基酸。EphA2能夠誘導(dǎo)抑制黏著斑激酶、細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶，以此來調(diào)節(jié)機(jī)體多種腫瘤細(xì)胞的活性，促進(jìn)其細(xì)胞增殖的發(fā)生[17]。據(jù)相關(guān)研究指出，對胃癌患者在進(jìn)行EphA2表達(dá)的研究時發(fā)現(xiàn)，與癌旁組織中的EphA2表達(dá)量進(jìn)行對比，癌組織中的EphA2表達(dá)量顯著升高，并且其表達(dá)量與胃癌的分級、浸潤程度以及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈現(xiàn)出正相關(guān)關(guān)系[18]。由此可以看出，EphA2與腫瘤疾病之間具有緊密關(guān)聯(lián)[19]。在此基礎(chǔ)上，本研究結(jié)果顯示，EphA2表達(dá)量在腦膜瘤疾病中呈現(xiàn)異常高表達(dá)，并且通過實驗證實，EphA2表達(dá)量在腦膜瘤疾病中的表達(dá)情況更為顯著，本研究這一結(jié)果與上述相關(guān)研究結(jié)果一致。分析其原因可能是因為，EphA2是VM相關(guān)的信號通路蛋白，EphA2在血管生成方面起到重要的調(diào)節(jié)作用。當(dāng)疾病發(fā)生時，EphA2表達(dá)出現(xiàn)異常升高，造成腦部出現(xiàn)缺氧狀態(tài)，機(jī)體血供驟降，從而造成EphA2水平升高。以此，下調(diào)EphA2表達(dá)，能夠有效抑制腦膜瘤疾病的進(jìn)一步發(fā)展，是控制疾病的重要環(huán)節(jié)。

據(jù)相關(guān)研究表明，AQP4、FASN、EphA2可能成為檢測腦膜瘤的關(guān)鍵性重要指標(biāo)，能夠有效反映患者腦部出現(xiàn)損傷的嚴(yán)重程度，及病情嚴(yán)重程度。在腫瘤患者中常出現(xiàn)AQP4、FASN、EphA2表達(dá)上調(diào)的情況，是因為當(dāng)AQP4核定位后，與FASN、EphA2等目標(biāo)基因進(jìn)行相互結(jié)合，共同參與腫瘤的增殖、侵襲。三者之間能夠共同作用，相互抑制，三者表達(dá)量的高低變化可能會隨著其中某一表達(dá)的變化而進(jìn)行轉(zhuǎn)變。另外依照本研究結(jié)果顯示，AQP4與FASN之間呈正相關(guān)，F(xiàn)ASN與EphA之間呈正相關(guān)，AQP4與EphA2之間呈正相關(guān)，此結(jié)果提示著AQP4、FASN、EphA2可能共同參與腦膜瘤疾病的發(fā)生、發(fā)展。AQP4、FASN、EphA2與此類疾病相關(guān)，臨床可根據(jù)AQP4、FASN、EphA2相對表達(dá)量的高低來對病情的嚴(yán)重程度進(jìn)行評估。另外本文分析三者的相關(guān)性，并采用ROC曲線分析三者對腦膜瘤的預(yù)測價值，結(jié)果顯示，三者呈線性相關(guān)關(guān)系，且三者聯(lián)合預(yù)測腦膜瘤的價值比單一預(yù)測價值相對較高，提示著臨床可根據(jù)三者水平變化評估腦膜瘤疾病，但本文并未深入分析其具體作用機(jī)制，因此三者參與此病的機(jī)制還需后續(xù)研究進(jìn)一步分析，為臨床上腦膜瘤的診斷提供參考。

綜上所述，AQP4、FASN、EphA2在腦膜瘤組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，并且與疾病的嚴(yán)重程度具有緊密相關(guān)性，AQP4、FASN、EphA2的表達(dá)與腦膜瘤分級、瘤周水腫、骨侵犯之間呈正相關(guān)性，且AQP4、FASN、EphA2三者兩兩之間也就有相關(guān)，可能共同作用于腦膜瘤疾病的發(fā)展過程。但因本文研究樣本量較小，仍需進(jìn)一步明確AQP4、FASN、EphA2在腦膜瘤中的協(xié)同作用機(jī)制。