銀菊止癢洗液HPLC特征指紋圖譜及聚類分析

謝 巍，楊 妮，肖 萍，盧森華，莫禮艷

（1.柳州市婦幼保健院/廣西科技大學附屬婦產(chǎn)醫(yī)院兒童醫(yī)院，廣西 柳州 545001；2.玉林市食品藥品檢驗檢測中心，廣西 玉林 537000）

銀菊止癢洗液由金銀花、野菊花、蛇床子、苦參等7味中藥組成，是柳州市婦幼保健院多年來在臨床用藥經(jīng)驗和辯證施治原則的基礎上總結(jié)的有效方劑。其中，野菊花具有疏散風熱、清肝明目、解毒的功效，金銀花具有宣散風熱、清解血毒的功效，蛇床子具有燥濕、祛風、殺蟲的功效［1］，諸藥合用具有清熱燥濕、解毒止癢的療效，可廣泛應用于小兒腠理失和、濕熱內(nèi)蘊所致的濕疹。該方劑中的主要化學成分有綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素等［2-4］，據(jù)相關文獻報道，綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素具有較強的抗細菌、炎癥、真菌、心肌纖維化、病毒等作用［5-8］，提示其可能為銀菊止癢洗液的活性成分。

國內(nèi)外有許多學者對上述化學成分進行了含量測定研究［9-12］，這些研究對銀菊止癢洗液的質(zhì)量控制有很好的指導意義，但中藥制劑組成復雜多變，僅僅依靠含量測定難以全面評價中藥制劑質(zhì)量。而指紋圖譜卻能突出中藥制劑的完整面貌，并且同類制劑的指紋圖譜具有相似性，依靠圖譜可以實現(xiàn)對中藥制劑內(nèi)在化學成分的綜合評價以及整體質(zhì)量的全面控制，使中藥制劑的成分更加可控［13］。系統(tǒng)聚類分析能通過數(shù)學處理方法替代傳統(tǒng)靠經(jīng)驗和專業(yè)知識來進行分類工作［14］。為全面控制銀菊止癢洗液質(zhì)量，本研究擬通過HPLC特征指紋圖譜法結(jié)合系統(tǒng)聚類分析的方法對不同批次銀菊止癢洗液展開研究，為銀菊止癢洗液的質(zhì)量控制提供依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 儀器

U3000型高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher公司）；HH-S6型恒溫數(shù)顯水浴箱（金壇市醫(yī)療儀器廠）；KQ-500GDV型超聲清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；Synergy型超純水機（美國默克公司）；FW80型高速萬能粉碎機（天津市泰斯特儀器有限公司）；XS-205Du型電子分析天平（瑞士METTLERTOLEDO公司）。

1.2 藥品與試劑

銀菊止癢洗液源于柳州市婦幼保健院；綠原酸（純度99.3%）、蒙花苷（純度95.1%）、咖啡酸（純度96.2%）、蛇床子素（純度98.2%），中國食品藥品檢定研究院；正丁醇（AR），東莞市今勝化工有限公司；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純），德國默克公司；去離子水，Synergy超純水機制作。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件 采用CAPCELL PAK C18MGⅡ色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），流動相為甲醇（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脫程序見表1。檢測波長330 nm，柱溫25℃，流速1.0 mL/min，進樣量5 μL。

表1 流動相梯度洗脫程序

1.3.2 溶液制備

1）溶液制備。精密稱取綠原酸、咖啡酸、蒙花苷、蛇床子素對照品各10 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇超聲溶解，定容至刻度，得到單一對照溶液。分別精密量取單一對照品溶液各1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋定容至刻度，即得混合對照品溶液。

2）供試品溶液制備。精密量取銀菊止癢洗液20.0 mL置于分液漏斗中，用水飽和正丁醇萃取3次，每次25 mL，合并正丁醇層，再用正丁醇飽和的水萃取2次，每次25 mL，棄去水洗液，合并正丁醇層，水浴蒸干，用甲醇溶解，置于5 mL量瓶中，加甲醇定容稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

1.3.3 精密度試驗 精密量取銀菊止癢洗液20 mL，按照“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.3.1”色譜條件，連續(xù)進樣6次，記錄圖譜及峰面積，以A15為參照峰，分別計算銀菊止癢洗液中共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD。

1.3.4 重復性試驗 分別精密量取同一批次銀菊止癢洗液樣品6份，每份20 mL，按照“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.3.1”色譜條件進樣分析，記錄圖譜及峰面積，以A15為參照峰，計算銀菊止癢洗液中共有峰相對保留時間和相對峰面積RSD。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗 精密量取銀菊止癢洗液樣品20 mL，按照“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.3.1”色譜條件分別于1、2、4、6、8、12 h，連續(xù)進樣6次，記錄圖譜及峰面積，以A15為參照峰，計算銀菊止癢洗液中共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD。

2 結(jié)果與分析

2.1 精密度試驗

精密度試驗結(jié)果表明，銀菊止癢洗液樣品中15個共有峰的相對保留時間的RSD為0.04%～0.40%，相對峰面積的RSD為0.05%～1.50%，表明儀器的精密度良好。

2.2 重復性試驗

重復性試驗結(jié)果表明，共有峰的相對保留時間的RSD為0.04%～0.60%，相 對 峰 面 積 的RSD為0.50%～1.80%，表明該試驗方法重復性良好。

2.3 穩(wěn)定性試驗

穩(wěn)定性試驗結(jié)果顯示，相對保留時間RSD為0.04%～0.50%，相對峰面積RSD為0.07%～2.00%，說明供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 HPLC特征指紋圖譜的建立

2.4.1 不同批次銀菊止癢洗液的指紋圖譜采集 分別精密量取銀菊止癢洗液20 mL，按照“1.3.2”方法制備供試品溶液，依“1.3.1”色譜條件進樣分析，記錄12批銀菊止癢洗液樣品的HPLC色譜圖譜、保留時間和峰面積。將12批銀菊止癢洗液樣品的圖譜及數(shù)據(jù)導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”［15］，建立銀菊止癢洗液疊加HPLC色譜（圖1）。共獲得15個共有峰（編號為A1～A15），以蛇床子素色譜峰（15號峰）為參照峰，指認了14個共有峰。對照色譜、共有模式指紋圖譜、HPLC疊加色譜分別見圖1、圖2、圖3。

圖1 混合對照品色譜

圖2 銀菊止癢洗液對照指紋圖譜

圖3 12批銀菊止癢洗液HPLC疊加色譜

2.4.2 共有峰和指紋圖譜確定 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)A版（2004）》軟件對HPLC數(shù)據(jù)進行處理。自動匹配指紋圖譜數(shù)據(jù)的相關參數(shù)，標定銀菊止癢洗液共有峰，并生成對照指紋圖譜。本研究共標定了15個共有峰，參照圖譜選擇樣品，時間窗寬度設定為0.1 min，多點校正并自動匹配譜峰，采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜。把參照峰A15的峰面積看作1，分別計算不同批次銀菊止癢洗液共有峰的相對保留時間和峰面積，并根據(jù)指紋圖譜共有模式計算相似度（表2）。結(jié)果顯示，相對峰面積的RSD為6.40%～35.50%，相對保留時間的RSD為0.03～0.40%，相似度在0.963～0.999。

表2 銀菊止癢洗液HPLC特征指紋圖譜相似度評價結(jié)果

2.5 系統(tǒng)聚類分析

采用SPSS 19.0軟件進行系統(tǒng)聚類分析，以12批不同批次銀菊止癢洗液序號為橫向列，以15個共有特征峰為縱向列，以各自對應相對峰面積為指標，組成12×15原始數(shù)據(jù)表，先將數(shù)據(jù)進行Z得分標準化處理，再以平方Euclidean距離為度量標準，采用組間對比和距離公式作為樣品的測度進行系統(tǒng)聚類分析（圖4）。結(jié)果表明，當距離標尺為5時，12批銀菊止癢洗液樣品被分為4類，其中S3、S7和S12聚為第一類，S1、S5、S8、S10、S2和S11歸為第二類，S4和S6聚為第三類，S9單獨歸為第四類；當距離標尺為10時，12批銀菊止癢洗液樣品被分為3類，其中，S4和S6歸為第一類，S1、S2、S5、S8、S10和S11聚為第二類，S3、S7、S9和S12聚為第三類；當距離標尺為25時，樣品被分為2類，S4和S6歸為一類；其他歸為一類。

圖4 銀菊止癢洗液樣品聚類分析

2.6 主成分分析

利用SPSS 19.0軟件，以銀菊止癢洗液的15個共有峰的峰面積為指標，對共有峰面積進行標準化處理后再進行主成分分析，分別得到主成分特征值、方差貢獻率和累計方差貢獻率。結(jié)果2個主成分的特征值為10.170和3.158，均大于1，方差貢獻率分別為67.797%和21.055%，2個主成分累積方差貢獻率為88.852%。表明這2個成分是影響銀菊止癢洗液的主要因子，基本反映出銀菊止癢洗液的質(zhì)量評價指標，故選擇提取前2個主成分進行分析。

將得到的2個因子的成分矩陣進行正交旋轉(zhuǎn)處理，得到主成分因子1大于0.9的有1號峰（0.937）、2號峰（0.968）、4號峰（0.961）、5號峰（0.952）、7號峰（0.960）。 主 成 分 因 子2大 于0.9的 有 ：10號 峰（0.925）、11號峰（0.948）。其中因子1的2號峰（綠原酸）和因子2的11號峰（蒙花苷）對主成分貢獻最大，根據(jù)旋轉(zhuǎn)成分矩陣可推測綠原酸、蒙花苷對銀菊止癢洗液制劑品質(zhì)有明顯的影響，可作為銀菊止癢洗液質(zhì)量評價指標。

將上述2個因子分別乘以對應的標準化處理后峰面積，分別得到因子1（F1）、因子2（F2）得分，再分別乘以各自方差貢獻率除以累積方差貢獻率，即可得到不同批次銀菊止癢洗液的綜合得分（F），制劑的整體質(zhì)量越好綜合得分越高。綜合得分最高的前3名樣品為S6、S9和S4，當綜合得分大于10.989時S6、S9、S4聚為一類。當綜合得分小于于10.989時S10、S2、S12、S1、S7、S5及S3歸為一類，與聚類分析中距離標尺為25時分類基本一致，具體結(jié)果見表3。

表3 12批銀菊止癢洗液制主成分得分、綜合得分及排名

3 小結(jié)

前期的研究建立了銀菊止癢洗液中4個化學成分含量測定方法［16］，為全面控制銀菊止癢洗液質(zhì)量，本研究結(jié)合含量測定方法和色譜條件，建立了12批銀菊止癢洗液指紋HPLC圖譜分析方法。根據(jù)色譜圖的峰分離效果以及峰面積標定了15個共有峰，并指認了其中4個共有峰，進一步結(jié)合相似度評價，計算了不同批次銀菊止癢洗液的質(zhì)量。結(jié)果表明，本研究所建立的HPLC指紋圖譜法準確、穩(wěn)定、重現(xiàn)性好、專屬性強，有效地補充了含量差異的不足。同時，也存在著不足之處，指紋圖譜采用含量測定色譜條件，各色譜峰相對集中，要達到很好的分離效果，對色譜柱提出了較高的要求。

聚類分析結(jié)果顯示，當距離標尺為5時，12批銀菊止癢洗液樣品被分為4類，其中S3、S7和S12聚為第一類，S1、S5、S8、S10、S2和S11歸為第二類，S4和S6聚為第三類，S9為第四類。提示在生產(chǎn)過程中，投料時應注意藥材產(chǎn)地、廠家和批次的選擇。主成分分析中S6、S9、S4綜合評分較高，結(jié)合主成分分析結(jié)果，提示道地藥材在中藥制劑生產(chǎn)中應優(yōu)先選擇。

銀菊止癢洗液對照指紋圖譜中蛇床子素（15號峰），具有峰面積較大、保留時間適中的特點，且為樣品共有已知成分，故選用15號峰作為參照峰。