小角X射線散射實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)溶液的輻照損傷及防護(hù)方法*

邢雪青 劉 超 默 廣 史 穎 吳忠華**

（1）中國科學(xué)院高能物理研究所，北京 100049；2）沈陽化工大學(xué)高分子產(chǎn)業(yè)高端制造研究院，沈陽 110142）

同步輻射照射物質(zhì)后，會(huì)與物質(zhì)發(fā)生相互作用，導(dǎo)致物質(zhì)中產(chǎn)生不同程度的輻照損傷。同步輻射使物質(zhì)產(chǎn)生輻照損傷的相互作用［1］有4種形式，即直接（主要、次要）相互作用和間接（主要、次要）相互作用。直接主要相互作用是：目標(biāo)原子中的光電效應(yīng)，即產(chǎn)生一個(gè)離子和一個(gè)快電子（光電子）；直接次要相互作用是：光電子的非彈性散射，即產(chǎn)生電子級(jí)聯(lián)和電離。間接主要相互作用是：溶劑分子中的光電效應(yīng)，即從溶劑中產(chǎn)生自由基等活性物質(zhì)（如OH自由基）；間接次要相互作用是：自由基等活性物質(zhì)對(duì)目標(biāo)分子產(chǎn)生化學(xué)損傷。一般來說，在固體材料中，輻照損傷以直接相互作用為主。當(dāng)有水分子存在時(shí)，間接相互作用出現(xiàn)，甚至占據(jù)主導(dǎo)位置。無論哪種相互作用，輻照導(dǎo)致的結(jié)構(gòu)改變對(duì)于同步輻射結(jié)構(gòu)表征都會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。特別是隨著同步輻射技術(shù)的進(jìn)步，光子通量越來越高［2-4］，輻照引起的損傷問題勢必越來越嚴(yán)重。在具體的表征實(shí)驗(yàn)中，如何評(píng)估輻照損傷程度以及如何降低輻照損傷是一個(gè)不容忽視的問題。

通常，有機(jī)物比無機(jī)物的輻照耐受度要差［1］。在常用到的5～20 keV能量范圍內(nèi)，1012cps以內(nèi)的光通量下，蛋白質(zhì)等生物大分子受到的輻照損傷最嚴(yán)重［5-7］。小角X射線散射（SAXS）技術(shù)是研究蛋白質(zhì)分子在溶液中的形狀、構(gòu)象、組裝和折疊等結(jié)構(gòu)信息的有力工具，并已普遍應(yīng)用于溶液中生物大分子的結(jié)構(gòu)表征［8-11］。在過去的幾十年中，SAXS和廣角X射線散射（WAXS）技術(shù)研究結(jié)構(gòu)生物學(xué)取得了重要的影響，SAXS數(shù)據(jù)庫SASBDB（www.sasbdb.org）自2018年開始向公眾發(fā)布。截止到2022年1月中旬，該數(shù)據(jù)庫已收集2 520套SAXS實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)集和3 606個(gè)模型［12］。

當(dāng)高能X射線輻照到蛋白質(zhì)分子時(shí)，會(huì)誘導(dǎo)蛋白質(zhì)分子發(fā)生一系列的結(jié)構(gòu)和化學(xué)改變，即產(chǎn)生輻照損傷。輻照損傷的產(chǎn)生將嚴(yán)重影響X射線探測實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性，在具體的實(shí)驗(yàn)中需要根據(jù)蛋白質(zhì)分子的具體情況采取必要的防護(hù)措施。蛋白質(zhì)等生物大分子溶液的輻照損傷產(chǎn)生機(jī)理與影響因素決定了如何選擇輻照損傷防護(hù)策略及其有效性。

1 蛋白質(zhì)溶液的輻照損傷及影響因素

有關(guān)蛋白質(zhì)等生物大分子晶體輻照損傷效應(yīng)的研究已經(jīng)有30多年的歷史［13-20，7］，這些研究提供了晶體結(jié)構(gòu)輻照損傷效應(yīng)的識(shí)別和量化工具［21-23］。同步輻射SAXS實(shí)驗(yàn)中蛋白質(zhì)等生物大分子溶液的輻照損傷研究也同樣歷史悠久［24-26］。入射X射線與溶劑水反應(yīng)產(chǎn)生各種自由基［6，26］，自由基又與蛋白質(zhì)分子發(fā)生氧化還原反應(yīng)，對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)產(chǎn)生破壞作用，這種通過自由基發(fā)生的間接作用比X射線直接作用的輻照損傷危害性還大［27-28］。在一定條件下，溶劑水因同步輻射束照射而發(fā)生光解的過程中將產(chǎn)生羥基（OH?）、過氧化氫（HO2?）、活性氧，以及溶劑化電子等自由基［6，28-29］。這些高度反應(yīng)活性的物質(zhì)會(huì)與蛋白質(zhì)吸收X射線后形成的自由基結(jié)合，導(dǎo)致非?？斓亩嚯逆湹淖杂苫せ?，自由基激活的蛋白質(zhì)之間的相互作用會(huì)產(chǎn)生輻照誘導(dǎo)的聚集物［30］。

使樣品結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯改變的輻照劑量稱為臨界輻照劑量。樣品的臨界輻照劑量越大，說明其對(duì)抗輻照損傷的能力越強(qiáng)。蛋白質(zhì)分子臨界輻照劑量在SAXS實(shí)驗(yàn)中要比晶體衍射中低幾個(gè)數(shù)量級(jí)［31］。如常溫下溶菌酶晶體可以承受約500 kGy的劑量，而溶菌酶溶液只可承受不超過約400 Gy的劑量［30］，若使用甘油來調(diào)整蛋白質(zhì)之間的相互作用，則溶菌酶溶液可承受約1 kGy的輻照劑量［30，32］。不同的蛋白質(zhì)分子的輻照損傷耐受度差異很大，通常在SAXS實(shí)驗(yàn)之前預(yù)測樣品是否容易受到輻射損傷是很困難的，需要根據(jù)具體情況進(jìn)行具體處理。在受輻照的蛋白質(zhì)稀溶液中會(huì)產(chǎn)生肽鏈的裂解和聚合，在冷凍蛋白質(zhì)溶液中可以觀察到碎裂，但沒有聚合產(chǎn)物。自由基清除劑的使用表明，羥基自由基對(duì)固體狀態(tài)下的碎片化和失活沒有顯著的貢獻(xiàn)，而水化電子與蛋白質(zhì)裂解過程緊密相關(guān)［28，33］。

輻照引起的嚴(yán)重結(jié)構(gòu)損傷甚至可目測判斷出來，比如清澈溶液中因輻照而有絮狀物析出等。大部分情況下，輻照損傷不能通過目測來判斷，需要通過表征數(shù)據(jù)的變化來判斷輻照損傷的產(chǎn)生及程度。輻照損傷的產(chǎn)生及程度除與樣品本身的特性有關(guān)，與樣品所處的環(huán)境因素也有很大的關(guān)系，比如溫度、濕度、氧含量等對(duì)樣品的輻照損傷也有重要影響［1，34-36］。除了樣品本身的特性以及環(huán)境因素外，影響蛋白質(zhì)溶液輻照損傷的主要是輻照參數(shù)：光束通量、光子能量、探測器效率等，其中影響最大的是光束通量。隨著同步輻射束線技術(shù)的進(jìn)步，所提供的X射線通量及通量密度越來越高，導(dǎo)致的輻照損傷或許還會(huì)表現(xiàn)出新的特性，如在新升級(jí)的第四代光源ESRF-EBS，在高通量下（2×1013cps），高能量（43.44 keV）的光對(duì)金屬等比較耐輻照的樣品也會(huì)產(chǎn)生較強(qiáng)的熱效應(yīng)而使其產(chǎn)生結(jié)構(gòu)損傷［37］，相應(yīng)的對(duì)輻照損傷的防護(hù)也提出了新的挑戰(zhàn)?？傊?，輻照損傷與樣品的特性、環(huán)境，以及輻照參數(shù)息息相關(guān)，因而輻照損傷的防護(hù)策略也主要從這些方面加以考慮。在討論輻照損傷防護(hù)策略之前，首先要講解輻照損傷研究中的一個(gè)重要物理量——輻照劑量。

2 輻照劑量與臨界輻照劑量的定義與計(jì)算

不同的光束線具有不同的光束通量、光子能量、光斑尺寸，及光斑形狀等。為了方便不同光束線的輻照損傷防護(hù)策略進(jìn)行相互比較和借鑒，統(tǒng)一使用輻照劑量的國際單位（SI）Gy（J/kg）來表示。其定義是每單位質(zhì)量所吸收的能量，與入射X射線光束通量成正比關(guān)系，與入射X射線光子能量、透射系數(shù)、光斑尺寸、樣品厚度等相關(guān)。樣品受到的X射線輻照劑量［31］可表示為：

texp是曝光時(shí)間（s），f是X射線通量（phs/s），E是X射線能量（J），T是樣品透射系數(shù)，V是射線照射體積（cm3），ρ是樣品質(zhì)量密度（kg/cm3）。公式（1）表明入射X射線能量E與輻照劑量D成正比。入射X射線能量E還直接影響X射線的透射系數(shù)T。接收X射線散射信號(hào)的探測器效率高低則直接影響著每幀圖像的最短采集時(shí)間。精確測量樣品處光斑的尺寸對(duì)于合理估計(jì)樣品受到的輻照劑量至關(guān)重要。對(duì)于液態(tài)狀的樣品，如果樣品池有窗口材料，則樣品前窗口材料會(huì)引起照射到樣品上的光強(qiáng)衰減，這部分衰減會(huì)導(dǎo)致公式（1）中f的減小，因此需要精確計(jì)算出來，可通過窗口材料元素組成及比例得到總的吸收系數(shù)，根據(jù)吸收公式進(jìn)行計(jì)算可得窗口材料對(duì)光強(qiáng)的吸收。

通常，樣品輻照損傷的程度可以定性地通過觀測經(jīng)X射線照射后每幀散射圖像的變化來判斷，但是，用輻照劑量描述的輻照損傷更加定量化。輻照誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)分子聚集只有在至少兩個(gè)蛋白質(zhì)分子或“目標(biāo)”被激活時(shí)才會(huì)發(fā)生［34］，即蛋白質(zhì)發(fā)生輻照聚集或其他輻照損傷需要接受一定的輻照劑量（即臨界劑量）。臨界輻照劑量值是產(chǎn)生輻照損傷前樣品可以承受的最大輻照劑量。Jeffries等［27］定義蛋白質(zhì)溶液的臨界輻照劑量為：引起蛋白質(zhì)回轉(zhuǎn)半徑Rg產(chǎn)生0.1 nm偏差所需要的最低輻照劑量。考慮有限樣品路徑的情況下，臨界輻照劑量DThresh可由下式計(jì)算得到：

上式中，E為每個(gè)光子的能量（單位J/photon），t為從開始曝光至達(dá)到臨界劑量所經(jīng)歷的時(shí)間（s），可以直接從Rg隨時(shí)間變化的作圖中得到。f表示樣品經(jīng)受的光束通量（photons/s）。ρm為樣品的質(zhì)量密度（g/cm3）。A為輻照到樣品上的光斑總面積（cm2）。L為光束穿過試樣的厚度（cm）。μ/ρ為樣品平均質(zhì)量吸收系數(shù)（cm2/g）。因子1 000是為了將劑量單位由J/g轉(zhuǎn)換成J/kg，即Gy。鑒于回轉(zhuǎn)半徑的計(jì)算與散射背底的扣除密切相關(guān)，因此，實(shí)驗(yàn)中需要注意背底數(shù)據(jù)測量的準(zhǔn)確性以及扣除方式。比如實(shí)驗(yàn)中在測量樣品前后注意及時(shí)測量背底數(shù)據(jù)，扣除背底散射時(shí)需注意對(duì)使用探測器暗電流等的矯正，使用通過樣品后的光強(qiáng)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行歸一化等。

RADDOSE-3D是計(jì)算臨界輻照劑量的免費(fèi)開源軟件［22，38］。該軟件最初用于X射線大分子晶體學(xué)（MX）實(shí)驗(yàn)中計(jì)算蛋白質(zhì)晶體吸收的時(shí)間和空間 分 辨 三 維 劑 量 分 布［22］。Brooks等［39］對(duì)RADDOSE-3D進(jìn)行了擴(kuò)展，使SAXS實(shí)驗(yàn)的劑量計(jì)算變得方便可行。該軟件考慮了SAXS實(shí)驗(yàn)中的三維幾何、毛細(xì)管的圓柱形幾何形狀、樣品的液體組成，以及毛細(xì)管材料對(duì)光束的衰減。使用RADDOSE-3D計(jì)算的輻照劑量是經(jīng)過衍射加權(quán)的劑量（DWD）［23］。采集的每一幅散射圖所對(duì)應(yīng)的光束通量可通過光電二極管計(jì)數(shù)得到［39］。

3 蛋白質(zhì)溶液的輻照損傷判斷標(biāo)準(zhǔn)

在蛋白質(zhì)等生物大分子SAXS實(shí)驗(yàn)中，獲得可靠散射數(shù)據(jù)的前提是得到單散射、無聚集的樣品，并且在整個(gè)測量過程中始終保持樣品的這種單散狀態(tài)。因此，避免因輻照損傷導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子的聚集、展開，以及碎片化［30，33，40］，這是小角散射技術(shù)的一個(gè)關(guān)鍵瓶頸問題。輻照損傷導(dǎo)致聚集效應(yīng)表現(xiàn)為低角度SAXS強(qiáng)度的增加，而碎片化效應(yīng)則相反，會(huì)導(dǎo)致低角度SAXS強(qiáng)度的降低；蛋白質(zhì)荷電引起的分子排斥也會(huì)降低低角部分散射強(qiáng)度；蛋白質(zhì)分子的展開通常會(huì)導(dǎo)致其回轉(zhuǎn)半徑的增大等［30，33］。輻照損傷大多表現(xiàn)為蛋白質(zhì)聚集，一般不會(huì)發(fā)生蛋白質(zhì)分子較大的構(gòu)象變化或多肽裂解［30］。

輻照損傷會(huì)導(dǎo)致所采集的散射數(shù)據(jù)不能使用，因此需要對(duì)輻照損傷的起點(diǎn)進(jìn)行判斷。具體方法有：對(duì)樣品連續(xù)采集一系列散射圖譜（幀），通過觀察比較散射曲線的變化簡單定性分析輻照損傷的起點(diǎn)；獲取每條散射曲線零角度散射強(qiáng)度I（0）和回轉(zhuǎn)半徑Rg的變化，當(dāng)變化達(dá)到一定程度便表示結(jié)構(gòu)發(fā)生變化了；通過軟件計(jì)算連續(xù)采集的散射數(shù)據(jù)的差異等。

3.1 通過回轉(zhuǎn)半徑Rg和或零角度強(qiáng)度I（0）判斷

一般認(rèn)為球狀蛋白的Rg增加0.1 nm就代表球狀蛋白有顯著的質(zhì)量重分布［30］。利用Rg對(duì)溶液中粒子形狀和大小的敏感性，可使Rg成為一個(gè)量化輻 照 損 傷 的 簡 便 手 段［30，41］。對(duì) 散 射 數(shù) 據(jù) 作ln［I（q）］～q2曲線，在0.8＜qRgu＜1.3范圍內(nèi)，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)作線性回歸可用作一種評(píng)估輻照損傷的經(jīng)驗(yàn)手段。上述Rgu是指樣品沒有受到輻照損傷時(shí)的回轉(zhuǎn)半徑。對(duì)散射曲線的線性回歸得到的斜率可用于計(jì)算輻照損傷后樣品的虛擬回轉(zhuǎn)半徑Rgps。此處Rgps并不嚴(yán)格等于聚集后的顆粒回轉(zhuǎn)半徑，只是用來表示一種聚集效應(yīng)的累積［27］。根據(jù)回轉(zhuǎn)半徑的變化（Rgps-Rgu）可以簡單定性分析輻照損傷的起點(diǎn)。已有研究表明輻照損傷與輻照劑量、蛋白質(zhì)（溶菌酶）溶液濃度、劑量率（單位時(shí)間的輻照劑量）密切相關(guān)［30，42］：對(duì)每一個(gè)蛋白質(zhì)分子溶液而言，存在一個(gè)劑量閾值，閾值以下不會(huì)造成輻照損傷，閾值以上輻照損傷隨劑量的增大而變得嚴(yán)重［30］；溶液中的輻照效應(yīng)與蛋白質(zhì)的濃度有關(guān)［43］，在較低的蛋白質(zhì)濃度下，產(chǎn)生一種“稀釋效應(yīng)”，溶液稀釋1倍輻照損害將變成2倍［43］，單位輻照劑量產(chǎn)生一定量的OH自由基，可以激活一定數(shù)量的蛋白質(zhì)分子［30］；在較高的劑量率下，自由基激活的溶菌酶在給定的輻照劑量下會(huì)更集中并相關(guān)聯(lián)［30］。

3.2 判斷輻照損傷起點(diǎn)

為了防止輻照損傷對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生影響，蛋白質(zhì)溶液的SAXS數(shù)據(jù)的采集時(shí)間都極短，導(dǎo)致每幀的信噪比都較差，因此有必要確定任意兩個(gè)散射曲線是否相似［39］，從而將相似曲線進(jìn)行平均來降低噪聲，同時(shí)判斷出輻照損傷的起點(diǎn)，得到臨界劑量值。每幀之間的相似度可使用ATSAS軟件包中DATCMP［44］程序的CorMap［45］檢驗(yàn)功能進(jìn)行評(píng)估。CorMap檢驗(yàn)是在兩曲線相似的空值假設(shè)（null hypothesis）下，觀察計(jì)算兩曲線差值為正值或負(fù)值的最長延伸的概率P。如果P高于一個(gè)給定的顯著性閾值，那么可以認(rèn)為相比較的兩幀是相似的［39］。CorMap檢驗(yàn)對(duì)每個(gè)實(shí)驗(yàn)連續(xù)采集的前3條曲線（幀）進(jìn)行兩兩比較，以確保它們是相似的（設(shè)定閾值P＞0.01）。然后將所有后續(xù)幀與第一幀進(jìn)行比較。當(dāng)CorMap檢驗(yàn)在P=0.01顯著性水平上發(fā)現(xiàn)3個(gè)連續(xù)幀（為了排除通過光束的異常值，例如氣泡或粒子）不相似時(shí)，認(rèn)定輻照損傷變得顯著。在3個(gè)連續(xù)的不同幀中，將第一幀所代表的樣品吸收輻照劑量定義為閾值或臨界劑量DThresh。

Brooks等［39］開發(fā)了一個(gè)Python庫，對(duì)散射曲線相似度檢驗(yàn)的結(jié)果可進(jìn)行可視化分析。利用這一點(diǎn)，就有可能為顯著的輻照損傷起點(diǎn)定義一個(gè)簡單的度量標(biāo)準(zhǔn)。可視化分析的核心之一是兩幀之間的相關(guān)矩陣（圖1）。這些相關(guān)圖顯示出兩幀之間的相似度。當(dāng)兩幀相似時(shí)，相關(guān)圖類似于隨機(jī)晶格（圖1a，b），表示相比較的兩條曲線中數(shù)據(jù)兩兩相減，差值取正取負(fù)完全隨機(jī)。然而，當(dāng)任意兩幀之間有系統(tǒng)差異時(shí)，相關(guān)圖中會(huì)有大區(qū)域連續(xù)的黑色或白色（圖1c，d），即差值不再隨機(jī)，有連續(xù)多個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)之間差值連續(xù)取正或連續(xù)取負(fù)。上述數(shù)據(jù)在ESRF的BM29束線上的BioSAXS實(shí)驗(yàn)站采集［39］。

Fig.1 Similarity comparison of continuous acquisition frames of GI protein［39］圖1 連續(xù)采集GI蛋白質(zhì)溶液SAXS曲線相似度比較［39］

另外可分別以每幀作為參考幀對(duì)輻照損傷進(jìn)程進(jìn)行可視化分析［39］，計(jì)算每幀與其余幀之間的相似度形成的散點(diǎn)圖。Brooks等［39］計(jì)算了采集的第2～120條曲線與采集的第1條曲線的相似度圖譜。使用變量C代表在對(duì)應(yīng)的兩兩相關(guān)圖中連續(xù)白色或黑色塊的最長長度。每一點(diǎn)根據(jù)該點(diǎn)橫坐標(biāo)對(duì)應(yīng)散射數(shù)據(jù)與第一條散射曲線相關(guān)CorMap的P值取色，P=1，表示對(duì)應(yīng)比較的兩條曲線是相似的，對(duì)應(yīng)該散點(diǎn)取藍(lán)色；P＜0.01，表示對(duì)應(yīng)比較的兩條曲線不相似，對(duì)應(yīng)該散點(diǎn)取橙色。介于0.01和1之間的點(diǎn)標(biāo)為綠色，表示兩條曲線也是相似的。采用10 mmol/L二硫蘇糖醇（DTT）保護(hù)劑添加進(jìn)GI（葡萄糖異構(gòu)酶）溶液中，將采集的120幀數(shù)據(jù)分別兩兩比較按上述相同的涂色方式得到熱圖［39］。如果僅考慮和第1幀比較，那么從第8幀開始就已經(jīng)發(fā)生輻照損傷。然而，經(jīng)過所有幀兩兩比較后發(fā)現(xiàn)，第8幀到第57幀之間的數(shù)據(jù)可以認(rèn)為和第7幀是相似的。因此，第8～57幀對(duì)應(yīng)的散射曲線也是可用的，對(duì)應(yīng)的樣品可看作未發(fā)生輻照損傷［39］。CorMap的優(yōu)點(diǎn)是其不使用實(shí)驗(yàn)強(qiáng)度上的誤差，這些誤差在數(shù)據(jù)處理過程中往往因不準(zhǔn)確傳遞而被錯(cuò)誤估計(jì)。為了使不同研究人員的實(shí)驗(yàn)相互間具有可比性，最有效的方法是將輻照損害的進(jìn)程作為樣品吸收劑量的函數(shù)進(jìn)行追蹤。CorMap結(jié)合RADDOSE-3D獲得輻照損傷的曲線起點(diǎn)以及對(duì)應(yīng)的輻照劑量閾值［39］。

4 蛋白質(zhì)溶液SAXS輻照損傷防護(hù)方法

對(duì)蛋白質(zhì)溶液的SAXS實(shí)驗(yàn)而言，整個(gè)測量過程中始終保持樣品的單分散狀態(tài)是獲得有效數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)。然而，輻照損傷通常會(huì)改變樣品的單分散性。因此，蛋白質(zhì)溶液的SAXS測量需要最大限度地降低輻照損傷，延長有效采譜時(shí)間，增加數(shù)據(jù)信噪比。由于蛋白質(zhì)等生物大分子的獨(dú)特性，它們的臨界輻照劑量高度依賴樣品。有些蛋白質(zhì)分子可以經(jīng)受長時(shí)間的同步輻射照射而不產(chǎn)生輻照損傷，有些蛋白質(zhì)分子則會(huì)很快變性析出。更為復(fù)雜的是，臨界劑量很可能隨著溶劑條件（鹽種類、pH等）的變化而改變。因此，輻照損傷防護(hù)策略需要根據(jù)每種蛋白質(zhì)分子的具體特性，從環(huán)境、輻照參數(shù)等方面綜合考慮。蛋白質(zhì)的輻照損傷可能嚴(yán)重依賴于其形成聚集體的傾向，也可能依賴于緩沖液成分，改變緩沖液也可能改變蛋白質(zhì)形成聚集體的傾向。所以，SAXS實(shí)驗(yàn)前要充分調(diào)研樣品，盡量獲得全面的樣品信息，設(shè)計(jì)有效的采譜方案，優(yōu)化數(shù)據(jù)的采集方式［1］。實(shí)驗(yàn)中采取積極有效方式，避免不必要的照射，使用高敏低噪聲探測器，盡量縮短曝光時(shí)間并增強(qiáng)信噪比［1］?？傊?，要在減少輻照損傷的前提下安全地獲得SAXS數(shù)據(jù)。

降低蛋白質(zhì)溶液輻照損傷的總體思路是：減少樣品單次曝光的受輻照劑量，提高樣品的輻照劑量閾值（臨界輻照劑量）。從輻照劑量計(jì)算公式（1）可以看出：衰減光通量［27］、減少單幅圖（幀）的曝光時(shí)間［2，46-53］、散焦光斑［36］、使液體振蕩/移動(dòng)/循環(huán)/流動(dòng)［54-60，27］、使用低能量入射X射線等方法都可以減少單幅圖（幀）對(duì)應(yīng)的單位體積樣品受到的輻照劑量，從而避免或減緩輻照損傷的發(fā)生。此外，低溫/冷凍［31，61］、添加保護(hù)劑（常溫保護(hù)劑和低溫保護(hù)劑）［30-31，39，54，62-67］、使用共振軟X射線等方法等也可以提高樣品的輻照劑量閾值［68］，獲得更長的有效采譜時(shí)間，以增強(qiáng)數(shù)據(jù)信噪比。以下將從衰減光強(qiáng)、減少曝光時(shí)間、樣品流動(dòng)、冷凍、添加保護(hù)劑、降低入射X射線光子能量等6個(gè)方面介紹輻照損傷的防護(hù)措施及效果。

4.1 衰減入射光強(qiáng)法

當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液的單幅SAXS圖（幀）的采集時(shí)間已是實(shí)驗(yàn)站可實(shí)現(xiàn)的最短曝光時(shí)間，而采集到的前兩幅圖就不相似，導(dǎo)致無法判斷采集的第一幅圖譜是否已受輻照損傷的影響。在這種情況下，衰減光強(qiáng)是降低輻照損傷首當(dāng)其沖的方式，尤其對(duì)于一些不需要超快時(shí)間分辨或者瞬態(tài)研究的樣品來說更是如此。歐洲分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室（EMBL）的P12 BioSAXS束線［69］光通量最高可達(dá)1013photons/s，但其經(jīng)常使用的通量是5.1×1012photons/s。該束線配備了一套光通量衰減器，由3個(gè)過濾轉(zhuǎn)盤組成。每個(gè)過濾轉(zhuǎn)盤上可安裝10個(gè)衰減箔，其中1個(gè)為空。第1個(gè)轉(zhuǎn)盤上安裝有6～54 μm的9個(gè)鋁箔，第2個(gè)轉(zhuǎn)盤上有60～540 μm的9個(gè)鋁箔，第3個(gè)有75～675 μm的9個(gè)鈦箔。通過3個(gè)轉(zhuǎn)盤可以得到1 000種不同衰減程度的組合，例如在10 keV處，光通量可得到從0.96到2×1015的不同衰減倍數(shù)。因此，可以針對(duì)特定的樣品微調(diào)或定制不同的入射光強(qiáng)度。圖2a～c［27］展示了溶菌酶溶液（4.4 g/L）散射強(qiáng)度隨入射光強(qiáng)衰減程度的變化。從連續(xù)采集5次曝光50 ms的散射曲線可以看到，在未衰減光強(qiáng)（5.1×1012phs/s）時(shí)，最先采集的兩條曲線差別就很大，說明起碼從第2條曲線開始，也可能第1條曲線對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)已經(jīng)發(fā)生輻照損傷。但是衰減到7.3×1011phs/s和1.8×1011phs/s后，連續(xù)采集的5條散射曲線表明對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)并未發(fā)生輻照損傷，但是信噪比卻變差。所以，在使用衰減入射光強(qiáng)以降低輻照損傷時(shí)，在降低信噪比和減少輻照損傷之間達(dá)到最佳平衡是關(guān)鍵。圖2d給出了不同衰減水平下散射數(shù)據(jù)的初始損傷速率（此處定義為回轉(zhuǎn)半徑隨時(shí)間的變化值ΔRpsg·s-1）。由此可知，入射X射線強(qiáng)度越高，初始損傷率就越大。

Fig.2 Effect of incident intensity attenuation on the critical dose of samples［27］圖2 光強(qiáng)衰減對(duì)樣品臨界劑量的影響［27］

4.2 減少單次曝光時(shí)間法

減少單幅圖的曝光時(shí)間是降低單幅圖對(duì)應(yīng)輻照劑量最簡單且最常用的方式。EMBL的P12生物SAXS束線是關(guān)注輻照損傷最多的SAXS束線之一，在該束線上使用頻率最高的采譜方式是50 ms/幀［2，46-49，52，70］，先進(jìn)行1 s內(nèi)的50 ms×20幅圖的采集，若此20幀沒有發(fā)生輻照損傷，后續(xù)便直接采用每幅圖1 s曝光時(shí)間的連續(xù)采集，直至所需要的數(shù)據(jù)量［46］并比較。

日本Spring8的BL40XU束線光子通量為1×1015phs/s，通過不同的脈沖方式實(shí)現(xiàn)了微秒［3］、亞納秒［71］、皮秒［4］時(shí)間尺度的數(shù)據(jù)采集。其中，微秒X射線脈沖用于蛋白質(zhì)晶體衍射和小角散射實(shí)驗(yàn)，獲得蛋白質(zhì)分子瞬態(tài)結(jié)構(gòu)信息。采譜時(shí)間降低到微秒可大大降低單幅SAXS圖受到的輻照劑量。Sigma Koki公司為此束線制作了所有的快門系統(tǒng)，通過圓盤旋轉(zhuǎn)快門和刀片通斷擺動(dòng)快門的組合實(shí)現(xiàn)6微秒X射線脈沖。

在輻照劑量超高的自由電子激光（XFELs）中，預(yù)防輻照損傷的主要方式是采用串列晶體學(xué)方法［72-73］，每個(gè)噴射而出的樣品懸浮液滴最多被一個(gè)脈沖照射，照射X射線脈沖可短到飛秒量級(jí)，因而每一幅圖的曝光時(shí)間極短。一般要求單次曝光脈沖持續(xù)時(shí)間要短于輻照損傷所需時(shí)間，以使輻照損傷還來不及發(fā)生，以極高的劑量（如100 Ggy，8 keV）在極短的時(shí)間（如＜40 fs）內(nèi)將需要的信號(hào)采集完成。

總之，減少單幅圖的曝光時(shí)間，連續(xù)曝光多次，直到輻照損傷導(dǎo)致SAXS圖譜發(fā)生明顯變化，再將輻照損傷發(fā)生前的數(shù)據(jù)平均得到最終數(shù)據(jù)。減少單次曝光時(shí)間的方法是最常見的避免輻照損傷的方法。此外，使樣品流動(dòng)也能有效減少輻照損傷，也是常用到的一種方式。

4.3 樣品流動(dòng)法

為了降低輻照劑量同時(shí)提高信噪比，可增大樣品光照體積，將輻照劑量平攤到更多的樣品中，如通過使X射線光束散焦變大，但此方式效果有限，且可能降低空間分辨率。常用且效果更佳的方法是流動(dòng)或平移樣品，縮短光束照射同一處樣品的時(shí)間。通過樣品流動(dòng)的方式將輻照劑量分?jǐn)偟礁蟮捏w積中，從而降低單位質(zhì)量樣品吸收的能量，即輻照劑量，達(dá)到減少輻照損傷、延長有效總曝光時(shí)間的目的。XFELs中的液體樣品通過液體射流、氣溶膠或分子束的方式持續(xù)地傳送到X射線光束中［72-73］，保證每個(gè)入射X射線脈沖照射的都是新鮮的樣品。此方法通常需要的樣品量較大，對(duì)于比較珍貴或者稀少的樣品則不適合。可考慮樣品振動(dòng)或循環(huán)流動(dòng)的方式。溶菌酶水溶液的流動(dòng)狀態(tài)（流速30 μl/s）和靜止?fàn)顟B(tài)相比，臨界劑量起碼提高了5倍［27］。

普通流動(dòng)的方式對(duì)減少輻照損傷雖然有效，但是由于樣品在毛細(xì)管中流動(dòng)時(shí)，處于層流狀態(tài)，毛細(xì)管中心和管壁之間的流速分布很不均勻。毛細(xì)管中蛋白質(zhì)溶液的層流可以用一個(gè)簡單的拋物線徑向速度曲線來描述［74］。由毛細(xì)管中的層流速度公式（3）可知：在管壁處的流速趨于零［54］。

由劑量公式（1）可知蛋白質(zhì)分子受到的X射線劑量與它在光束中的停留時(shí)間成正比，因此，流速分布對(duì)輻照劑量在樣品中的分布有很大的影響，流速趨近于零的邊界條件導(dǎo)致了樣品管壁附近承受著極高的輻照劑量［57］。

為了克服普通層流模式下管壁處樣品因不流動(dòng)而受到的嚴(yán)重輻照損傷，Kirby等［54］在澳大利亞同步加速器的SAXS/WAXS束線上使用共流法進(jìn)行了共流狀態(tài)下核糖核酸酶RNAse A蛋白質(zhì)溶液耐輻照損傷的研究。該共流法需要一個(gè)特制的共流毛細(xì)管樣品池（圖3）。在共流樣品池中，緩沖液靠近毛細(xì)管內(nèi)壁流動(dòng)，而樣品集中在毛細(xì)管中間流動(dòng)。緩沖液流量由泵控制的總流出量和樣品流入量的差值決定。中心采樣流的直徑取決于總流量中的分?jǐn)?shù)樣品流量。同時(shí)為了消除測量時(shí)間內(nèi)輻照損傷對(duì)緩沖液的影響，還可在緩沖液中加入適量甘油。不同入射光強(qiáng)條件下，分析比較了樣品在普通流動(dòng)池和共流池中分別獲得的SAXS一維曲線的統(tǒng)計(jì)相似性、回轉(zhuǎn)半徑、最大尺寸、低角部分散射強(qiáng)度、整體散射強(qiáng)度、零角度強(qiáng)度、Porod體積、分子質(zhì)量等多個(gè)參數(shù)，結(jié)果顯示：各個(gè)參數(shù)受輻照損傷的影響在共流模式下都比普通流動(dòng)模式下小。用于SAXS測量的毛細(xì)管若被污染，會(huì)導(dǎo)致背底數(shù)據(jù)出現(xiàn)錯(cuò)誤，進(jìn)而使采集到的蛋白質(zhì)散射信號(hào)變得不準(zhǔn)確。此共流模式不僅對(duì)蛋白質(zhì)輻照損傷有保護(hù)作用，同時(shí)還可以避免毛細(xì)管的污染。樣品流動(dòng)是保護(hù)蛋白質(zhì)溶液免受輻照損傷的一種有效方式。與普通流動(dòng)相比，共流方式（蛋白質(zhì)溶液在毛細(xì)管的中心，不接觸管壁）可以使蛋白質(zhì)溶液輻照耐受度比普通流動(dòng)的方式提高一個(gè)數(shù)量級(jí)。因此與靜止模式相比，選擇速度合適的共流模式可使輻照損傷臨界劑量至少提高50倍。

Fig.3 Cross-sectional view of the sheath flow sample cell［54］圖3 共流樣品池剖視圖［54］

相對(duì)來說，共流模式還沒有普通流動(dòng)模式應(yīng)用廣泛。因此有必要介紹一下普通流動(dòng)模式下毛細(xì)管直徑的選擇。在普通流動(dòng)模式下，最佳樣品厚度只考慮最佳散射，或樣品的最佳吸收厚度為1，即μx≈1，μ為樣品吸收系數(shù)，x為樣品物理厚度。溶液樣品的最佳厚度為水的吸收系數(shù)的倒數(shù)，大致為1 mm（8 keV時(shí)）或2 mm（10 keV時(shí)）。對(duì)輻照非常敏感的樣品而言，樣品最佳厚度的計(jì)算除考慮散射外，還需要考慮輻照損傷。Schroer等［74］對(duì)比研究了兩種直徑的毛細(xì)管對(duì)最終散射數(shù)據(jù)的影響。只考慮散射信號(hào)計(jì)算的最佳厚度為1.9 mm（10 keV時(shí)），選擇接近最佳樣品厚度的毛細(xì)管尺寸（內(nèi)徑尺寸1.7 mm）。另一種考慮到散射信號(hào)和輻照損傷，選擇小于理論計(jì)算最佳厚度的尺寸，選為0.9 mm。選擇更小直徑的毛細(xì)管是為了增加受照與不受照體積的比例，從而提高樣品的利用率，但需注意毛細(xì)管的直徑不能小于光斑的尺寸，否則浪費(fèi)光通量。此外，對(duì)于連續(xù)流實(shí)驗(yàn)，更小的毛細(xì)管可以獲得更高的流速，以便更快地通過光束和更新樣品，從而減少輻照損傷的累積效應(yīng)。盡管更小的毛細(xì)管直徑會(huì)降低信噪比，但是結(jié)合更有效的數(shù)據(jù)收集方案可以額外補(bǔ)償光路長度（毛細(xì)管直徑）減少引起的信號(hào)減弱，最終從未損壞的樣品中得到更高質(zhì)量的散射數(shù)據(jù)。

通過測試比較發(fā)現(xiàn)：直徑小于最佳厚度（特定能量下吸收系數(shù)的倒數(shù)）的毛細(xì)管確實(shí)能全面改進(jìn)輻照敏感生物樣品的SAXS曲線。圖4比較了兩種尺寸毛細(xì)管樣品散射曲線隨時(shí)間的變化，顯示使用更小直徑的毛細(xì)管確實(shí)會(huì)增加樣品的輻照劑量閾值。相對(duì)于大直徑的毛細(xì)管，小直徑毛細(xì)管曝光采集更長時(shí)間也未見輻照損傷對(duì)數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響。隨著總體積流量的增加，單位質(zhì)量樣品的受輻照劑量都有所減小，對(duì)兩種毛細(xì)管中溶菌酶輻照損傷開始的時(shí)間都延長了。在相同的總體積流量下，較小直徑毛細(xì)管比大直徑毛細(xì)管中的單位質(zhì)量樣品受輻照的劑量要低。因此，輻照損傷開始的時(shí)間更晚，能獲得更多未受輻照損傷影響的數(shù)據(jù)。對(duì)于給定的線性流速，不同流速下的兩個(gè)毛細(xì)管的速度曲線表明，在直徑0.9 mm的毛細(xì)管中，緩慢移動(dòng)的樣品邊界層要薄得多，因此沉積蛋白質(zhì)和聚集物的可能性更低，可使溶菌酶溶液曝光時(shí)間整體延長1～2個(gè)數(shù)量級(jí)。相關(guān)的SAXS研究是在EMBL P12 BioSAXS束線完成的，所用入射光子能量為10 keV（λ=0.124 nm），光斑尺寸是200 μm×350 μm（V×H）。

Fig.4 Effect of capillary diameter on irradiation damage of samples［74］圖4 毛細(xì)管直徑對(duì)樣品輻照損傷的影響［74］

輻照劑量的定義是單位質(zhì)量吸收的能量，因此以上3種防護(hù)方法都沒有提高樣品的輻照劑量閾值，只是讓輻照損傷變得緩慢（衰減光強(qiáng)）、或分?jǐn)偟礁鄠€(gè)散射曲線中（減少曝光時(shí)間）、或分散到更大的體積（流動(dòng)）中。其中流動(dòng)的防護(hù)方式導(dǎo)致樣品用量消耗很大，對(duì)于非常珍稀的樣品就不合適，如一些重要的膜蛋白等。因此，對(duì)于樣品量稀少的生物大分子，提高樣品的輻照劑量閾值更有意義。以下介紹3種提高輻照劑量閾值的方法，即低溫冷凍法、防護(hù)劑法，以及共振軟X射線散射法。

4.4 低溫冷凍法（cryo-SAXS技術(shù)）

在晶體衍射和電子顯微鏡觀測中，通常將生物大分子冷凍到100 K附近的溫度來緩解［75-76］輻照損傷［21］。這種冷凍方法可極大地減小生物樣品的輻照損傷，降低所需樣品的最小體積，拓展SAXS技術(shù)到稀有生物大分子的研究中。在100 K附近，溶劑中自由基的擴(kuò)散幾乎全部消除，冷凍溶劑的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)像腳手架一樣不僅穩(wěn)固了生物大分子結(jié)構(gòu)，而且還可防止輻照引起的結(jié)構(gòu)較大松弛。在冷凍生物大分子晶體衍射中，晶體可以承受的最大輻照劑量約是30 MGy，比常溫樣品的最大輻照劑量高出20～150倍［18，75-76］。這種冷凍方式對(duì)輻照損傷的防護(hù)作用與分子種類無關(guān)。成功的冷凍過程中蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)保存完整，且在整個(gè)冷凍過程中沒有冰核產(chǎn)生，同時(shí)實(shí)現(xiàn)溶劑快速完全的玻璃化。冷凍蛋白質(zhì)樣品過程中，溶劑的玻璃化可通過快速冷凍技術(shù)來實(shí)現(xiàn)，比如將樣品放入液氮或液態(tài)丙烷中、或樣品插入冷氣流中、或高壓下冷凍樣品［21，77］。此外，加入冷凍保護(hù)劑（如甘油等）可以降低溶劑完全玻璃化對(duì)冷凍速率的要求。冷凍技術(shù)在SAXS研究中具有廣泛的應(yīng)用，尤其對(duì)輻照極其敏感的蛋白質(zhì)溶液而言，冷凍小角散射（cryo-SAXS）技術(shù)是一種降低輻照損傷、提高樣品最大承受輻照劑量的有效方法［78］。

Cryo-SAXS技術(shù)的成功應(yīng)用關(guān)鍵在于能重復(fù)制備樣品及準(zhǔn)確收集數(shù)據(jù)。直接測量得到的溶液SAXS數(shù)據(jù)中總是包含來自溶劑的散射背底，而散射背底是需要準(zhǔn)確扣除的。在cryo-SAXS技術(shù)中，若冷凍過程導(dǎo)致溶劑產(chǎn)生了冰晶，那么來自冰晶或者其他任何密度不均勻體的散射背底都會(huì)嚴(yán)重影響待測樣品的散射信號(hào)準(zhǔn)確獲得，更為困難的是這些散射背底難以復(fù)制，從而導(dǎo)致散射背底不能準(zhǔn)確扣除。因此，cryo-SAXS技術(shù)的關(guān)鍵是找到一種將溶劑均質(zhì)玻璃化的可靠方法，同時(shí)還要保證溶解其中的蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)完整性。合適的冷凍速率、冷凍保護(hù)劑種類，以及濃度選擇是獲得均質(zhì)玻璃化溶劑的關(guān)鍵。冷凍保護(hù)劑的選擇將在后面4.5節(jié)詳細(xì)介紹。Meisburge等［78］在SAXS束線（CHESS G1）上整合了一臺(tái)暢噴氮制冷機(jī)（open-flow nitrogen cryocooler），獲得了小液滴在氮?dú)饬髦型耆ＡЩ臈l件。通過選擇45%質(zhì)量濃度的聚乙二醇-200作為冷凍保護(hù)劑，獲得GI（常被用作SAXS的測量標(biāo)樣）溶液在100 K溫度完全玻璃態(tài)下的SAXS數(shù)據(jù)及分析結(jié)果，證實(shí)cryo-SAXS可以極大地提高GI蛋白輻照劑量閾值，同時(shí)結(jié)構(gòu)保持不變。對(duì)于普通蛋白質(zhì)溶液，常溫下輻照耐受度為1～10 kGy，甚至更低，比如溶菌酶在常溫?zé)o保護(hù)劑時(shí)劑量閾值是～400Gy，而冷凍條件下輻照劑量耐受度可以提高2～5個(gè)數(shù)量級(jí)，直到3.7 MGy對(duì)應(yīng)的散射曲線也沒有輻照損傷出現(xiàn)的痕跡［78］。此外，低溫冷凍法需要的樣品體積很小。光照樣品體積小到15 nl還可以獲得足夠好的數(shù)據(jù)。而普通常溫樣品需要10～20 μl才可以獲得足夠好的數(shù)據(jù)。因此，低溫冷凍法對(duì)輻照敏感、樣品稀少、隨時(shí)間容易降解、無法在常溫下進(jìn)行SAXS測試的蛋白質(zhì)溶液有重要意義。以上GI的SAXS數(shù)據(jù)是在CHESS G1束線采集的。入射光能量10.5 keV，光通量為6.3×1010photons/s，光斑大小（H×V，F(xiàn)WHM）為119×193 μm2，或入射光能量10.0 keV，通量1.0×1011photons/s，光斑大小為220×190 μm2。

冷凍SAXS技術(shù)的樣品池設(shè)計(jì)與常規(guī)SAXS技術(shù)的樣品池設(shè)計(jì)不同。因?yàn)樾枰焖倬鶆虿ＡЩ瘶悠啡芤海紫纫髽悠烦氐捏w積盡量小，這樣液滴才易于快速完全玻璃化，其次，為便于溫度的快速傳遞，樣品池不能做成完全封閉的類型。目前文獻(xiàn)報(bào)道過3種樣品池，其中兩種為無窗設(shè)計(jì)［78］，因此樣品池中光路路徑不固定。另一種為有窗設(shè)計(jì)，因此樣品在光路具有固定的路徑。無窗樣品池的主要缺點(diǎn)是無法用傳統(tǒng)方式將背底準(zhǔn)確扣除，需要更為復(fù)雜的扣除過程［78］。根據(jù)傳統(tǒng)SAXS技術(shù)，準(zhǔn)確的背底扣除首先要復(fù)制出與樣品有相同厚度的玻璃化背底。這對(duì)于無窗樣品池來說是不可能實(shí)現(xiàn)的，因此限制了無窗樣品池的廣泛使用。Hopkins等［61］為了便于扣除cryo-SAXS技術(shù)的散射背底，使用微加工技術(shù)制作了適用低溫冷凍SAXS技術(shù)的固定路徑（有窗）的硅材質(zhì)樣品池，此類有窗樣品池能較好地解決cryo-SAXS中無窗樣品池背底扣除的困難。

兩種無窗樣品池均來自Meisburge等對(duì)cryo-SAXS技術(shù)的研究中［78］，第一種無窗樣品池是圓柱狀結(jié)構(gòu)。溶液樣品體積約1 μl，由長1.8 mm、直徑860 μm、管壁25 μm厚的聚酰亞胺組成，入射光沿圓柱體中心軸通過。為了實(shí)現(xiàn)樣品與不銹鋼支架間的熱分離，裝載樣品的圓柱管粘在直徑510 μm、壁厚25 μm的一小段聚酰亞胺管材上。第二種無窗樣品池是使用表面張力將樣品固定在一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)聚酰亞胺環(huán)中，樣品直徑約600 μm。用于cryo-SAXS實(shí)驗(yàn)的有窗樣品池是一種微加工制作、且在光路中有固定溶液路徑長度的硅材質(zhì)樣品池（圖5）［61］。樣品支架的幾何形狀是由蝕刻掩模和各向異性KOH蝕刻決定的［61］。此樣品池頂部開放，體積小到納米量級(jí)，形狀與普通樣品池類似。這類樣品池為低溫冷凍SAXS技術(shù)的推廣應(yīng)用提供了極大的便利。由于低的散射背底和低的X射線吸收，樣品池只有640 nl的體積，且光照樣品體積僅為2.5 nl，又具有可重復(fù)的樣品冷卻特性，因此這類樣品池的背底扣除可用常規(guī)方式進(jìn)行扣除，可研究樣品量極少的蛋白質(zhì)溶液體系。

Fig.5 Windowless sample cell［61］圖5 無窗樣品池［61］

4.5 添加防護(hù)劑法

以上降低輻照損傷的策略都是物理的方式，除冷凍技術(shù)外，樣品本身的輻照耐受度并沒有增加，只是將輻照劑量分散到更多的樣品中或更多的SAXS圖譜。增強(qiáng)生物大分子的輻照耐受度還可以采用化學(xué)的方式，比如添加防護(hù)劑法。蛋白質(zhì)溶液在X射線的作用下產(chǎn)生多種自由基，自由基再引起蛋白質(zhì)分子聚集等損傷行為［29］。消除自由基或者減少自由基對(duì)生物大分子的影響也是一種有效的保護(hù)措施。當(dāng)健康（正常）細(xì)胞受到輻照時(shí)，它們通過釋放固有的保護(hù)分子，如超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽（GSH）和金屬硫蛋白（MT）［79-81］，來抑制自由基的破壞作用，加強(qiáng)DNA的修復(fù)。氨磷汀、維生素E、抗壞血酸、胡蘿卜素、褪黑素和硫辛酸衍生物等自由基清除劑對(duì)正常細(xì)胞和組織具有一定的保護(hù)能力［82-83］。有些納米材料也已被證明在某些情況下具有良好的抗輻照能力［62］，如碳納米管普遍具有強(qiáng)化的性能和內(nèi)表面，特別適合用來捕獲溶液中的自由基。稀土氧化鈰（CeO2）納米顆粒也可用作自由基清除劑，用于保護(hù)正常組織免受輻照損傷［65］。這些納米顆?？赡苁且环N治療性再生納米藥物，可以清除活性氧?；钚匝跏禽椪照T導(dǎo)細(xì)胞損傷的罪魁禍?zhǔn)?，因而，此類物質(zhì)可以作為保護(hù)劑候選對(duì)象［66-67］。還原劑（如乙醇、Tris、EDTA和DTT）也可作為自由基清除劑，用來消除輻照對(duì)蛋白質(zhì)的損害［6］。高濃度的冷凍保護(hù)劑（如甘油、乙二醇、聚乙二醇、葡萄糖和其他糖類）已被證實(shí)可有效減少輻照對(duì)蛋白質(zhì)晶體的損害［84］。然而必須注意的是，高濃度的低溫凝結(jié)劑可能會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)溶液產(chǎn)生多種副作用，如蛋白質(zhì)穩(wěn)定性變差、蛋白質(zhì)體積減少、溶劑黏度增加和散射對(duì)比度的減少等。

輻照損傷防護(hù)劑主要是通過調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)相互作用的冷凍保護(hù)劑，又可以分成冷凍條件下使用和常溫條件下使用的冷凍保護(hù)劑。用于cryo-SAXS技術(shù)的冷凍保護(hù)劑有聚乙二醇（PEG）、乙二醇、甘油、二甲基亞砜（DMSO）等。如前所述，在cryo-SAXS技術(shù)的應(yīng)用中，最大的障礙是產(chǎn)生多余和不可重復(fù)的冰。在冷凍蛋白質(zhì)晶體學(xué)（MX）技術(shù)中，冷凍速率、冷凍劑種類、濃度的選擇是均勻徹底玻璃化的最重要因素。而對(duì)于冷凍SAXS技術(shù)來說，除此限制條件外，還受限于其他條件。大部分冷凍保護(hù)劑的電子密度比水大，冷凍保護(hù)劑的加入使溶劑整體電子密度增加，導(dǎo)致溶液樣品和溶劑背底之間的電子密度差變小，使得樣品散射能力降低，最終導(dǎo)致散射信號(hào)的信噪比變得更差。因此，最佳選擇的冷凍保護(hù)劑應(yīng)在低濃度下就可起到冷凍保護(hù)作用，同時(shí)還要和水的電子密度相差不大?；谶@些條件，Meisburger等［31］發(fā)現(xiàn)聚乙二醇PEG-200是幾種小分子冷凍保護(hù)劑（包括甘油、乙二醇、DMSO）中最優(yōu)的。所需PEG-200的最低濃度可以通過檢驗(yàn)是否有冰晶的散射強(qiáng)度來判斷，若在q≤0.02?-1區(qū)域沒有多余的散射強(qiáng)度產(chǎn)生就表示沒有冰晶形成。結(jié)果表明，當(dāng)PEG-200的濃度達(dá)到45%時(shí)，冰的散射信號(hào)才完全消失。使溶液完全玻璃化所需的DMSO最低濃度是45%（w/w），所需乙二醇或者甘油的最低濃度是50%（w/w）［21］。在常溫下用來提高蛋白質(zhì)溶液耐輻照能力的低溫保護(hù)劑有甘油、乙二醇、蔗糖、海藻糖以及其他糖等。Kuwamoto等［30］研究了甘油、乙二醇、蔗糖在常溫下對(duì)溶菌酶（含有四個(gè)鏈內(nèi)二硫鍵）的保護(hù)作用，添加少量的冷凍保護(hù)劑，如甘油、乙二醇和蔗糖，可以有效地降低輻照損傷。甘油和乙二醇在100 mmol/L濃度范圍內(nèi)同樣有效，蔗糖也有類似的有效濃度。Castellví等［63］將幾種小分子化合物用于低分子質(zhì)量、低濃度的蛋白質(zhì)溶液體系中作為輻照損傷防護(hù)劑，起到很好的防護(hù)作用，同時(shí)還不會(huì)對(duì)背底散射能力產(chǎn)生明顯影響。

低溫保護(hù)劑降低輻照損傷的機(jī)理可能是：在存在少量冷凍保護(hù)劑的情況下，蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)間的相互作用發(fā)生了變化［30］。低溫保護(hù)劑對(duì)缺乏二硫鍵的其他蛋白質(zhì)的輻照損傷也有減少作用［30］。因此，乙二醇，甘油和蔗糖抑制輻照損傷的作用或許適用于更加廣泛的SAXS測量。Jeffries等［27］考察了溶液添加劑對(duì)抑制輻照損傷的影響，以RNAse蛋白為例，研究無添加劑及不同添加劑情況下的臨界輻照劑量值，10 g/L RNAse溶液處于靜止?fàn)顟B(tài)，以全光通量采集的SAXS數(shù)據(jù)（7×30 ms曝光）顯示30 ms曝光后便顯示嚴(yán)重的輻照損傷，臨界劑量值僅為0.32 kGy；添加1 mmol/L DTT的SAXS數(shù)據(jù)顯示臨界劑量增加至1.61 kGy；添加1 mmol/L抗壞血酸的SAXS數(shù)據(jù)顯示臨界劑量值為1.07 kGy；添加5%（v/v）甘油的SAXS數(shù)據(jù)顯示臨界劑量值為5.29 kGy。說明添加劑可顯著降低樣品的輻照損傷，特別是在添加甘油的情況下，直到暴露在全光束中300 ms后才檢測到損傷［27］。在常溫下使用的低溫保護(hù)劑中，甘油是被使用最頻繁的一種保護(hù)劑。小角散射數(shù)據(jù)庫SASBDB中約一半的數(shù)據(jù)是在有防護(hù)劑的條件下獲得的，而其中又有約一半的保護(hù)劑使用的是甘油［63］。甘油同時(shí)還可以消除溶劑因輻照而發(fā)生的變化［54］。

不同保護(hù)劑在不同濃度下的輻照損傷防護(hù)效果不同。Brooks等［39］定量計(jì)算了抗壞血酸、DTT、乙二醇、甘油、硝酸鈉、蔗糖、四甲基哌啶氮氧化物（TEMPO）、海藻糖等8種輻照損傷保護(hù)劑針對(duì)GI防護(hù)的效果以及濃度依賴性。結(jié)果顯示，幾種輻照防護(hù)劑的防護(hù)效果有顯著的濃度依賴性。其中，抗壞血酸、甘油和硝酸鈉的防護(hù)效果均表現(xiàn)出強(qiáng)烈的濃度正依賴性；DTT則表現(xiàn)出相反的行為；蔗糖、TEMPO和海藻糖表現(xiàn)出很小的正依賴性，但即使在最高濃度（10 mmol/L）下，3種試劑的RDOT（輻照損傷開始閾值）也小于2。RDOT定義為溶液添加保護(hù)劑后與未添加保護(hù)劑時(shí)的劑量閾值之比，常用來量化輻射效果的改進(jìn)。這表明這些放射性保護(hù)劑在增加樣品的劑量耐受性方面不是很有效。乙二醇的RDOT隨濃度從1～5 mmol/L增大而減小，但在10 mmol/L時(shí)又有較大的增大。因此，乙二醇的保護(hù)能力并不是濃度的簡單單調(diào)函數(shù)。最有效的輻照損傷保護(hù)取決于樣品中保護(hù)劑的濃度。低濃度（1 mmol/L和2 mmol/L）DTT是最有效的。

使用輻照損傷防護(hù)劑來減輕或者消除輻射損傷是一個(gè)簡單而有效的方法，也是一個(gè)重要的研究方向，還有很多面紗等著去揭開。比如高效且低散射背底的新型防護(hù)劑類型或者防護(hù)劑組合值得進(jìn)一步研究。特別是常溫下能將每個(gè)蛋白質(zhì)分子固定在一個(gè)籠子里面，禁止蛋白質(zhì)分子與蛋白質(zhì)分子相遇，像腳手架一樣困住每個(gè)蛋白質(zhì)分子，且不使蛋白質(zhì)發(fā)生構(gòu)象改變的物質(zhì)，就像冷凍后的溶劑網(wǎng)格，值得投入大量的時(shí)間和精力來尋求。

4.6 使用共振軟X射線散射（RSoXS）

常規(guī)SAXS實(shí)驗(yàn)的X射線能量范圍通常是8～12 keV。在軟X射線環(huán)境下，共振軟X射線散射（RSoXS）使用的能量＜2 keV，這允許探測多種元素的K或L吸收邊，其中一些元素在生物系統(tǒng)中是普遍存在（C、N、O）或常見（如Ca）的。在元素吸收邊進(jìn)行X射線散射實(shí)驗(yàn)，由于鍵合方式或元素組成的不同，樣品中不同部分之間的散射強(qiáng)度對(duì)比度可能增加多個(gè)數(shù)量級(jí)。RSoXS是一種用于聚合物薄膜探測的技術(shù)。它以約0.1 eV的能量分辨率調(diào)整X射線能量來提高散射對(duì)比度［85］。RSoXS能夠區(qū)分樣品中不同的化學(xué)成分，并且具有近似納米級(jí)的空間分辨率。

Ye等［68］使用RSoXS技術(shù)對(duì)牛血清白蛋白（BSA）進(jìn)行了研究，使用的樣品體積比使用硬X射線測量所需樣品體積小了多個(gè)量級(jí)，卻仍然可得到水溶液中BSA的形狀和大小。與硬X射線相比，軟X射線對(duì)蛋白質(zhì)分子的輻照損傷明顯減弱。硬X射線會(huì)破壞所有類型的鍵，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)聚集。然而，RSoXS可以選擇性地?fù)p傷某些類型的化學(xué)鍵。當(dāng)X射線能量從10 keV降到285.3 eV后，輻照損傷僅局限于特定鍵。因此，軟X射線可減輕輻照損傷對(duì)蛋白分子結(jié)構(gòu)的總體影響，輻照劑量耐受度也比硬X射線高出多個(gè)數(shù)量級(jí)。從輻照劑量公式中也可以看出，單位時(shí)間內(nèi)的輻照劑量與光子能量成正比。需要注意的是，當(dāng)光子能量很低時(shí)，適合的樣品厚度就要很薄。比如在C元素的吸收邊，用于RSoXS溶液散射的最佳厚度僅為1 μm，只是10 keV光子能量下最佳厚度的千分之一，可是兩種厚度的樣品分別在兩種方法中得到的散射強(qiáng)度卻大致相當(dāng)。因此，RSoXS技術(shù)特別適合用量稀少的樣品，但對(duì)樣品池的制作精度要求會(huì)很高。

以上詳細(xì)介紹了幾種在蛋白質(zhì)溶液散射實(shí)驗(yàn)中常用到的輻照損傷防護(hù)策略。在具體的實(shí)驗(yàn)中，往往要根據(jù)實(shí)際需求同時(shí)采用幾種方式（比如縮短曝光時(shí)間、增加樣品流動(dòng)、和添加保護(hù)劑）來進(jìn)行輻照損傷防護(hù)?？s短曝光時(shí)間、冷凍樣品、和添加保護(hù)劑也可以聯(lián)合用于輻照損傷防護(hù)。無論采取哪些方式，縮短單次曝光時(shí)間，累積連續(xù)采集次數(shù)都是要用到的，這是避免輻照損傷對(duì)散射數(shù)據(jù)產(chǎn)生影響的必要方式。

5 總結(jié)與展望

輻照損傷與樣品的種類、濃度、輻照劑量、輻照劑量率、輻照損傷防護(hù)劑種類等多種因素有關(guān)。對(duì)于經(jīng)驗(yàn)豐富的SAXS實(shí)驗(yàn)者和束線科學(xué)家來說，優(yōu)化束線和樣品條件將輻照損害降低到合理可及的程度是非常值得且有必要的。然而，由于樣品的多樣性，對(duì)于用戶量巨大的裝置來說，輻照損傷的防護(hù)措施可能是復(fù)雜多樣的。在光通量極高的生物大分子SAXS實(shí)驗(yàn)中，為了盡可能地避免輻照給生物大分子結(jié)構(gòu)帶來損傷，需盡可能結(jié)合多種防護(hù)措施。對(duì)于溶液樣品，從輻射損傷防護(hù)效果上來說，低溫冷凍（cryo-SAXS）技術(shù)是最好的，臨界劑量也可提高2～5個(gè)數(shù)量級(jí)，但實(shí)現(xiàn)起來比較困難，需要高度專業(yè)化的儀器設(shè)備，同時(shí)數(shù)據(jù)采集和分析都比較復(fù)雜，與實(shí)驗(yàn)站其他設(shè)備的組裝也要提前考慮好。常溫下的輻照防護(hù)措施與冷凍條件相比更加方便實(shí)現(xiàn)。樣品流動(dòng)和連續(xù)短時(shí)間采譜是必不可少的。從輻照損傷防護(hù)的角度考慮，毛細(xì)管樣品的厚度也要比只考慮散射計(jì)算出來的最佳厚度適當(dāng)小一些，還應(yīng)當(dāng)結(jié)合振動(dòng)或分子排阻凝膠色譜等措施避免樣品在毛細(xì)管內(nèi)壁的沉淀聚集。當(dāng)然，最好的樣品流動(dòng)方式是共流方式，比普通流動(dòng)相比臨界劑量至少可以提高1個(gè)數(shù)量級(jí)。同時(shí)針對(duì)不同的生物大分子，選擇合適的保護(hù)劑，以及合適的保護(hù)劑濃度也是必須的。根據(jù)樣品的特性及實(shí)驗(yàn)要求，也可考慮是否降低光通量來降低樣品的輻照損傷，比如衰減光強(qiáng)、散聚光斑等。然而，每一種輻照損傷防護(hù)措施都有相應(yīng)的代價(jià)，比如添加劑可能改變?nèi)軇┑幕瘜W(xué)性質(zhì)（如DTT對(duì)二硫鍵的還原），造成樣品可能有害的改變；降低光通量會(huì)使數(shù)據(jù)信噪比變差等。軟線共振技術(shù)雖然可以顯著降低蛋白質(zhì)溶液的輻照損傷，但是實(shí)驗(yàn)條件相對(duì)苛刻，樣品需要放置于高真空環(huán)境內(nèi)，窗口材料也需要謹(jǐn)慎選擇，不合適窗口材料對(duì)光強(qiáng)的吸收會(huì)非常強(qiáng)或者對(duì)信號(hào)造成干擾。另外，共振技術(shù)數(shù)據(jù)分析也相對(duì)復(fù)雜，因此該方法發(fā)展比較緩慢。

HEPS粉光小角散射束線光子通量為1015cps（12 keV時(shí)）［86］，與日本Spring8的BL40XU束線具有相同數(shù)量級(jí)的光子通量。在BL40XU束線上，針對(duì)蛋白質(zhì)溶液，每幅散射圖曝光時(shí)間可短到6 μs。通過簡單對(duì)比可知，在HEPS的粉光小角散射束線上進(jìn)行微秒時(shí)間的數(shù)據(jù)采集應(yīng)該是充分且恰當(dāng)?shù)摹Ｓ形墨I(xiàn)報(bào)道了DESY PETRA III的P12束線在10 keV入射光，500 μm×250 μm光斑尺寸，5×1012cps光子通量下，濃度為10 g/L的RNAse蛋白質(zhì)在5%體積分?jǐn)?shù)的甘油存在的靜止?fàn)顟B(tài)下，可以測量到300 ms而不出現(xiàn)輻照損傷［27］。HEPS粉光小角散射站的光通量是P12束線的200倍，面積是其兩倍（參考光斑尺寸500 μm×500 μm），不考慮能量的差異，達(dá)到相同的閾值劑量，HEPS粉光小角散射可以連續(xù)測量3 ms而不出現(xiàn)輻照損傷。對(duì)于輻照損傷不是很明顯的普通蛋白質(zhì)或者蛋白質(zhì)復(fù)合物，在P2束線曝光1 s均沒有輻照損傷產(chǎn)生［2，46-49，52，70］，對(duì) 應(yīng) 在HEPS上 最 少 可 以 曝 光10 ms。CHESS G1束線對(duì)GI在光斑尺寸119 μm×193μm，光子通量6.3×1010cps，光子能量10.5 keV的冷凍SAXS條件下，總曝光時(shí)間可達(dá)2 460 s，類比在HEPS粉光小角散射站可曝光1.5 s。

一般情況下，超快或瞬態(tài)時(shí)間分辨的生物大分子SAXS研究需要在高通量的粉光小角散射束線上進(jìn)行。若樣品對(duì)輻照損傷極為敏感，進(jìn)行輻照損傷的防護(hù)是必須的。縮短常溫下曝光時(shí)間、增加樣品流動(dòng)/振動(dòng)/共流、減少毛細(xì)管直徑、添加合適的輻照防護(hù)劑、低溫保護(hù)等，都是抑制輻照損傷的途徑。如果樣品不需要時(shí)間分辨，但對(duì)輻照損傷又極其敏感，那么衰減光強(qiáng)也是一個(gè)解決輻照損傷的很好途徑?？傊椪論p傷防護(hù)需要針對(duì)具體樣品，權(quán)衡利弊，采用最佳的措施。

對(duì)于普通蛋白質(zhì)溶液的SAXS實(shí)驗(yàn)來說，找到一種低散射背底、強(qiáng)吸收自由基的物質(zhì)，與甘油等冷凍保護(hù)劑聯(lián)合起來使用，或許可以達(dá)到更佳的效果。甘油可調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)之間的相互作用，在蛋白質(zhì)分子表面形成一層厚厚的水化層，在這種情況下，所產(chǎn)生的自由基可被自由基清除劑清除掉，避免其進(jìn)一步對(duì)蛋白質(zhì)分子的破壞作用。有關(guān)蛋白質(zhì)等生物大分子溶液的輻照損傷機(jī)理，以及各類自由基清除劑的作用機(jī)制仍值得廣泛深入細(xì)致的研究。