梅花鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程中頂端不同組織COL1A1基因啟動(dòng)子DNA甲基化模式及差異分析

張芙蕊 韓若冰 郭夢(mèng)雅 趙洵武 李和平

(東北林業(yè)大學(xué) 野生動(dòng)物與自然保護(hù)地學(xué)院，哈爾濱 150040)

鹿茸是哺乳動(dòng)物中唯一可完全再生的附屬器官，其生長(zhǎng)速度極快卻沒(méi)有癌變[1]，鹿茸每年周期性再生的過(guò)程通過(guò)軟骨內(nèi)成骨的方式進(jìn)行，并且具有分層明顯的成骨帶，包括間充質(zhì)層、前軟骨層、過(guò)渡層、軟骨層以及骨組織，Colitti等[2]研究表明鹿茸組織的細(xì)胞凋亡率較高，認(rèn)為細(xì)胞程序性凋亡在鹿茸角快速再生過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，使鹿茸組織中細(xì)胞凋亡和細(xì)胞生長(zhǎng)之間形成了有序的平衡機(jī)制，以此阻止其發(fā)展為腫瘤。因此鹿茸是研究哺乳動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā)育和分子機(jī)制的優(yōu)秀生物學(xué)模型[3]，同時(shí)也是癌癥生物學(xué)領(lǐng)域的研究模型[1]。

COL1A1基因是細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用途徑中的重要基因，在調(diào)控生物體生長(zhǎng)發(fā)育，以及在癌細(xì)胞系轉(zhuǎn)移和癌癥患者預(yù)后標(biāo)志預(yù)測(cè)等領(lǐng)域中具有重要的作用。本團(tuán)隊(duì)此前已研究分析了馴鹿鹿茸頂端間充質(zhì)中COL1A1基因的DNA甲基化水平，結(jié)果表明COL1A1基因可能是馴鹿生茸機(jī)制的重要調(diào)控基因[4]。Stéger等[5]研究發(fā)現(xiàn)，COL1A1基因等調(diào)控生長(zhǎng)相關(guān)基因在馬鹿鹿茸中的表達(dá)量是鹿角表達(dá)量的10倍以上；趙姬臣[6]對(duì)狍茸頂端組織轉(zhuǎn)錄組分析篩選出COL1A1基因存在高表達(dá)現(xiàn)象，表明COL1A1基因在鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程中可能存在重要調(diào)控作用。DNA甲基化是一種哺乳動(dòng)物中重要的表觀遺傳修飾，不僅在不改變DNA序列的前提下對(duì)基因的遺傳和表達(dá)進(jìn)行調(diào)控，而且這種調(diào)控作用可以在世代間穩(wěn)定遺傳[7]，基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平的變化可以直接抑制基因與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合，進(jìn)而調(diào)控特定基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平[8]。并且已有研究表明COL1A1基因啟動(dòng)子對(duì)DNA甲基化十分敏感[9]，但COL1A1基因在鹿茸中甲基化水平對(duì)鹿茸生長(zhǎng)是否發(fā)揮作用尚不清楚。因此進(jìn)一步研究鹿茸頂端組織中COL1A1基因啟動(dòng)子的DNA甲基化水平，可能揭示鹿茸中COL1A1基因?qū)ζ渖L(zhǎng)的差異調(diào)控作用。

因此，本研究以梅花鹿鹿茸生長(zhǎng)過(guò)程中的3個(gè)不同生長(zhǎng)時(shí)期(前期：小鞍子時(shí)期;中期：二杠茸時(shí)期;后期：三杈茸時(shí)期)的頂端組織及其4個(gè)不同組織層(茸皮組織、間充質(zhì)組織、前軟骨組織、軟骨組織)作為試驗(yàn)材料，利用亞硫酸氫鹽測(cè)序法(Bisulfite sequencing PCR, BSP)對(duì)COL1A1基因啟動(dòng)子區(qū)部分序列甲基化水平進(jìn)行測(cè)定，以分析COL1A1基因在梅花鹿鹿茸不同生長(zhǎng)時(shí)期和頂端不同組織層中甲基化水平的差異，為進(jìn)一步研究鹿茸生長(zhǎng)、再生和骨化等調(diào)控機(jī)制提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品

本研究選用3頭5歲成年健康雄性梅花鹿，分別在脫盤后的30、60和90 d左右采集梅花鹿生茸前期(小鞍子時(shí)期)、生茸中期(二杠茸時(shí)期)和生茸后期(三杈茸時(shí)期)鹿茸主干頂端5 cm左右的組織，參考Li等[10]對(duì)鹿茸頂端組織分層方法，分出茸皮層、間充質(zhì)層、前軟骨層和軟骨層4種組織，總共36個(gè)樣本。組織樣品采集后立即放入液氮中保存。

1.2 主要試劑

基因組DNA提取試劑盒(RMI060002604)購(gòu)自AXYGEN公司；甲基化基因組處理試劑盒(EZ DNA Methylation-Gold Kit，D5005)購(gòu)自ZYMO RESEARCH公司；瓊脂糖凝膠純化回收試劑盒(D2500-02)購(gòu)自O(shè)mega公司；DL 2000 Plus DNA Marker(MD101-01)購(gòu)自Vazyme公司；rTaq DNA聚合酶(R001A)，Hot Start Taq DNA聚合酶(R007A)，DH5α感受態(tài)細(xì)胞(CB101)，pMD18-T載體(6011)，6×Loading Buffer，dNTP Mix(2.5 mM)，10×PCR Buffer(Mg2+Plus)購(gòu)自TaKaRa公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1基因組DNA的提取與檢測(cè)

使用基因組DNA提取試劑盒，按照試劑盒說(shuō)明書提取基因組DNA。提取DNA后分別用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000測(cè)定DNA的質(zhì)量以及純度和濃度。其中DNA濃度均應(yīng)在200～500 ng/μL，利于后續(xù)的甲基化處理獲得最佳CT轉(zhuǎn)化率。

1.3.2重亞硫酸鹽修飾基因組DNA

使用甲基化基因組處理試劑盒對(duì)基因組DNA進(jìn)行轉(zhuǎn)化修飾處理。注意按照說(shuō)明配置CT轉(zhuǎn)化液，其在使用前應(yīng)水浴加熱到37 ℃，并震蕩混勻，防止由于CT轉(zhuǎn)化液形成沉淀而影響甲基化修飾的CT轉(zhuǎn)化率。最后，得到處理后基因組DNA立即用于甲基化PCR擴(kuò)增。

1.3.3BSP甲基化引物設(shè)計(jì)

使用在線軟件http:∥www.urogene.org/methprimer/和Primer 5.0對(duì)OPN基因啟動(dòng)子區(qū)域的CpG島進(jìn)行分析預(yù)測(cè)和引物設(shè)計(jì)。其中上游引物是5’-GGTTTAGATTGAATTGGGGG-3’，下游引物是5’-TAACCTTCTTCTTAACCCTCC-3’，退火溫度是53.5 ℃。在亞硫酸氫鹽處理的甲基化PCR引物擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，含一個(gè)長(zhǎng)度201 bp的CpG島，共有25個(gè)CG位點(diǎn)，預(yù)期擴(kuò)增大小441 bp。

1.3.4COL1A1基因甲基化PCR的擴(kuò)增及測(cè)序

以重亞硫酸鹽處理后的基因組DNA為模版，進(jìn)行甲基化PCR的擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為(10 μL)：Hot start Taq DNA聚合酶0.05 μL，DNA模板1 μL，10×PCR Buffer 1 μL，dNTP Mix 0.8 μL，上、下游引物各0.5 μL，ddH2O 6.15 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?8 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

得到的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行回收純化后與pMD18-T載體進(jìn)行連接，連接體系為(10 μL)：solution 1 5 μL，PMD-18T vector 1 μL，回收產(chǎn)物3.5 μL，ddH2O 0.5 μL，16 ℃連接1 h。連接完成后將連接產(chǎn)物10 μL 與DH5α感受態(tài)細(xì)胞50 μL按步驟進(jìn)行轉(zhuǎn)化。培養(yǎng)的菌液均勻涂布在LB固體培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)15～17 h。用槍頭挑取單一飽滿的白色菌落于1.5 mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，置于恒溫?fù)u床(37 ℃，200 r/min)培養(yǎng)8 h。將1 μL的DNA模板換成1 μL菌液對(duì)克隆產(chǎn)物進(jìn)行菌液PCR，用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行克隆陽(yáng)性鑒定。最后，將克隆成功的10管菌液送至吉林庫(kù)美生物科技有限公司進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3.5統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)

測(cè)序結(jié)果利用Chromas查看序列峰圖，使用DNAStar軟件對(duì)序列進(jìn)行人工校對(duì)和拼接，得到甲基化BSP測(cè)序結(jié)果。

將該基因甲基化BSP測(cè)序結(jié)果與啟動(dòng)子序列導(dǎo)入在線軟件QUMA(http:∥quma.cdb.riken.jp/)，計(jì)算該基因在不同組織中的DNA甲基化轉(zhuǎn)化率，同時(shí)得到DNA甲基化模式分析的圓圈圖。

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件GraphPad Prism 8.0.1和IBM SPSS Statistics version 23分析各組織的甲基化總差異和各CG位點(diǎn)上的甲基化差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA的提取及質(zhì)量檢測(cè)

利用1%的瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000檢測(cè)基因組DNA提取的質(zhì)量。提取的基因組DNA濃度均可達(dá)到200 ng/μL以上，OD260/OD280值均在1.8～2.0。因此，鹿茸頂端各組織的基因組DNA提取質(zhì)量較好，濃度和純度均可滿足試驗(yàn)要求。

2.2 COL1A1基因甲基化BSP-PCR擴(kuò)增及測(cè)序

分別以重亞硫酸鹽修飾處理過(guò)的梅花鹿鹿茸12個(gè)組織的基因組DNA為模板，對(duì)COL1A1基因啟動(dòng)子區(qū)進(jìn)行BSP-PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增出的片段大小均與預(yù)期擴(kuò)增大小一致，如圖1所示。測(cè)序結(jié)果利用Chromas查看序列峰圖以確認(rèn)測(cè)序結(jié)果的可靠性，使用DNAStar軟件對(duì)序列進(jìn)行人工校對(duì)和拼接，得到甲基化BSP測(cè)序結(jié)果，與原序列進(jìn)行對(duì)比，確認(rèn)測(cè)序結(jié)果正確。

M：DL 2000 marker；1～6：代表平行樣本。M: DL 2000 marker; 1-6: Parallel samples.

2.3 梅花鹿茸不同時(shí)期頂端各組織COL1A1基因的DNA甲基化模式

通過(guò)對(duì)梅花鹿鹿茸頂端組織的COL1A1基因啟動(dòng)子甲基化BSP測(cè)序結(jié)果校對(duì)、分析，經(jīng)統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，各組織的陽(yáng)性克隆菌液測(cè)序結(jié)果中均有10個(gè)以上的有效測(cè)序結(jié)果，利用軟件QUMA比對(duì)分析該基因在梅花鹿鹿茸12個(gè)組織中的甲基化狀態(tài)(圖2)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果顯示，COL1A1基因在前期、中期、后期的茸皮組織中的甲基化率分別為(9.73±0.92)%、(7.60±0.69)%和(3.73±0.23)%；間充質(zhì)組織中的甲基化率分別為(3.20±0.40)%、(1.33±0.23)%和(1.60±0.69)%；前軟骨組織中的甲基化率分別為(4.67±0.83)%、(2.53±0.46)%和(2.67±0.23)%；軟骨組織中的甲基化率分別為(5.60±0.40)%、(2.80±0.40)%和(2.27±0.61)%。

每一行代表一個(gè)細(xì)菌克隆，每一圈代表一個(gè)單獨(dú)的CpG二核苷酸位點(diǎn)；○：未甲基化位點(diǎn)，●：甲基化位點(diǎn)。Each line represents one individual bacterial clone, and each circle one single CpG dinucleotide; ○: Unmethylated CpGs; ●: Methylated CpGs.

在COL1A1基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化水平的分析區(qū)域中，共有25個(gè)CG位點(diǎn)，分別位于39、56、93、99、118、148、171、190、221、226、233、242、256、262、276、278、291、299、303、322、374、393、400、411和415 bp。各位點(diǎn)的甲基化率見(jiàn)表1所示，在其中的17個(gè)CG位點(diǎn)檢測(cè)到不同程度的甲基化。結(jié)果顯示，39、56、118、190和415 bp處在4層組織中均發(fā)生不同程度的甲基化；221 bp處只在間充質(zhì)前期及中期發(fā)生甲基化；226 bp處只在間充質(zhì)后期發(fā)生甲基化；233 bp處只在茸皮中期發(fā)生甲基化；242 bp處在茸皮前期、間充質(zhì)前期及中期發(fā)生甲基化；262 bp處在茸皮3個(gè)時(shí)期、前軟骨前期、軟骨后期均發(fā)生不同程度甲基化；278 bp處在茸皮前期及中期、間充質(zhì)前期及中期發(fā)生甲基化；291 bp處在間充質(zhì)后期、軟骨前期發(fā)生甲基化；299 bp處在前軟骨3個(gè)時(shí)期、茸皮中期及后期、軟骨層前期均發(fā)生甲基化；303 bp處在茸皮中期、前軟骨中期、軟骨中期均發(fā)生甲基化；393、400和411 bp處只在茸皮前期發(fā)生甲基化。

2.4 梅花鹿茸不同時(shí)期頂端各組織COL1A1基因的DNA甲基化差異

對(duì)COL1A1基因啟動(dòng)子區(qū)在梅花鹿鹿茸不同生長(zhǎng)時(shí)期頂端各組織的DNA甲基化率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)以及差異分析，結(jié)果見(jiàn)圖3所示。對(duì)相同組織甲基化程度進(jìn)行差異性比較的結(jié)果顯示，在茸皮組織中，3個(gè)時(shí)期甲基化程度之間差異均為極顯著(P<0.01)，且甲基化程度依次遞減；在間充質(zhì)組織中，前期甲基化程度最高，中期減小，且與前期存在顯著性差異(0.010.05)；在前軟骨組織中，前期甲基化率最高，分別與中期、后期之間差異均為極顯著(P<0.01)，中期與后期之間無(wú)顯著性差異(P>0.05)；在軟骨組織中，前期甲基化程度最高，與中期存在顯著性差異(0.010.05)。

(a)相同組織甲基化程度差異性比較；(b)相同時(shí)期甲基化程度差異性比較；*：0.01

對(duì)相同時(shí)期甲基化程度進(jìn)行差異性比較的結(jié)果顯示，在前期和中期中，茸皮甲基化程度最高，與間充質(zhì)、前軟骨、軟骨之間差異均為極顯著(P<0.01)，軟骨、前軟骨、間充質(zhì)甲基化程度依次遞減，且前期中間充質(zhì)與軟骨之間差異極顯著(P<0.01)；在后期中，茸皮甲基化程度最高，與間充質(zhì)之間差異為極顯著(P<0.01)，前軟骨、軟骨、間充質(zhì)甲基化程度依次遞減。

COL1A1基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化研究區(qū)域共有25個(gè)CG位點(diǎn)，各位點(diǎn)DNA甲基化差異分析如圖4所示。對(duì)茸皮組織進(jìn)行差異性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前期與中期在39、56、190、233、242、278、299和400 bp處差異極顯著(P<0.01)，在393和411 bp處差異顯著(0.010.05)；前期與后期在39、56、118、190、242、400和415 bp處差異極顯著(P<0.01)，在262、393和411 bp處差異顯著(0.010.05)；中期與后期在39、56、118、233、278和415 bp處差異極顯著，在262和299 bp處差異顯著，其余CG位點(diǎn)上無(wú)顯著差異。對(duì)間充質(zhì)組織進(jìn)行差異性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前期與中期在39、221、226、242、291和415 bp處差異極顯著(P<0.01)，在56、190和278 bp處差異顯著(0.010.05)；前期與后期在39、56、221、226、242、291和415 bp處差異極顯著(P<0.01)，在190和278 bp處差異顯著(0.010.05)；中期與后期在291 bp處差異極顯著(P<0.01)，在56 bp處差異顯著(0.010.05)。對(duì)前軟骨組織進(jìn)行差異性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前期與中期在39、56、190、262、299、303和415 bp處差異極顯著(P<0.01)，在118 bp處差異顯著(0.010.05)；中期與后期在39、56和303 bp處差異極顯著(P<0.01)，在299 bp處差異顯著(0.010.05)。對(duì)軟骨組織進(jìn)行差異性分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，前期與中期在39、56、118、190、291、299和415 bp處差異極顯著(P<0.01)，在303 bp處差異顯著(0.010.05)。

(a)茸皮組織；(b)間充質(zhì)組織；(c)前軟骨組織；(d)軟骨組織；1：前期；2：中期；3：后期。

3 討 論

COL1A1基因具有維持骨組織、結(jié)締組織和細(xì)胞微環(huán)境完整性的作用[11]，并且其傳導(dǎo)多種信號(hào)分子參與器官發(fā)育和組織修復(fù)等生理過(guò)程[12]。鹿茸是研究骨組織再生和創(chuàng)傷修復(fù)的良好模型，而鹿茸頂端組織是鹿茸的生長(zhǎng)中心，為探究COL1A1基因在鹿茸頂端組織生長(zhǎng)過(guò)程中的作用機(jī)制，本研究選用梅花鹿鹿茸不同生長(zhǎng)時(shí)期頂端組織及其由外到內(nèi)依次排列的茸皮、間充質(zhì)、前軟骨、軟骨4個(gè)不同組織層為研究材料，從時(shí)空角度利用亞硫酸氫鹽測(cè)序法研究了鹿茸啟動(dòng)子區(qū)甲基化模式，進(jìn)而分析了2個(gè)維度的甲基化差異。結(jié)果顯示，不同組織之間在總的甲基化水平和CG位點(diǎn)的甲基化水平上均存在不同程度的差異和明顯的規(guī)律。

COL1A1基因在4個(gè)組織中均發(fā)生了不同程度的甲基化，茸皮組織甲基化水平最高，間充質(zhì)、前軟骨、軟骨組織甲基化水平都較低，其中，間充質(zhì)組織甲基化水平最低，且在前期與中期茸皮組織的甲基化水平與其他3個(gè)組織之間的差異均為極顯著，表明COL1A1基因可能在茸皮組織中的生長(zhǎng)作用相對(duì)較弱，而在頂端中心生長(zhǎng)組織中起更重要作用。間充質(zhì)生長(zhǎng)區(qū)在鹿茸茸性皮膚真皮層的下方[13]，間充質(zhì)層細(xì)胞具有極強(qiáng)的分裂增殖能力[14]，并且在體外培養(yǎng)液中能迅速增殖并合成Ⅰ型膠原蛋白[15]。本研究結(jié)果表明，間充質(zhì)層在4個(gè)組織中甲基化水平最低，可能是由于間充質(zhì)組織細(xì)胞間質(zhì)分泌旺盛，并且221 bp這一位點(diǎn)只在間充質(zhì)發(fā)生甲基化，221 bp位點(diǎn)可能是調(diào)節(jié)間充質(zhì)生長(zhǎng)的重要CG位點(diǎn)。已有研究表明，COL1A1基因在乳腺癌、胰腺癌、胃癌及食管癌等惡性腫瘤組織中呈高表達(dá)[16-17]，Ⅰ型膠原蛋白是細(xì)胞間質(zhì)的重要成分[18]，結(jié)合鹿茸具有細(xì)胞快速增殖這一與癌細(xì)胞相似的特點(diǎn)，推測(cè)梅花鹿間充質(zhì)中COL1A1基因可能存在高表達(dá)。

CG位點(diǎn)的甲基化水平會(huì)影響DNA序列與轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合狀態(tài)，進(jìn)而影響基因的表達(dá)，而CpG島DNA高甲基化往往造成基因沉默和表達(dá)下降[19-20]。Ⅰ型膠原蛋白基因在幾種人類癌細(xì)胞中均存在不同程度的甲基化，且甲基化程度與Ⅰ型膠原蛋白表達(dá)呈負(fù)相關(guān)[9]。對(duì)間充質(zhì)組織的研究結(jié)果顯示：中期甲基化水平顯著下調(diào)，后期甲基化率略高于中期，但差異不顯著。張梅等[21]對(duì)快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸間充質(zhì)組織差異表達(dá)基因進(jìn)行篩選，發(fā)現(xiàn)COL1A1基因在骨化期鹿茸間充質(zhì)組織中表達(dá)下調(diào)，這與本研究結(jié)果相符，表明COL1A1基因可能在間充質(zhì)快速生長(zhǎng)期中發(fā)揮更強(qiáng)的作用，促進(jìn)鹿茸生長(zhǎng)。

鹿茸的生長(zhǎng)發(fā)育階段分為生長(zhǎng)期和骨化期，鹿茸形態(tài)從小鞍子(30 d)到三杈茸(90 d)之間為生長(zhǎng)期，以生長(zhǎng)為主，骨化水平緩慢，其中二杠茸(60 d)時(shí)期為快速生長(zhǎng)期，其生長(zhǎng)速度可達(dá)2 cm/d，三杈茸時(shí)進(jìn)入骨化期，生長(zhǎng)速度降低，骨化水平增強(qiáng)[22]。在4個(gè)組織中，快速生長(zhǎng)期甲基化水平均顯著下調(diào)，且造成前期與中期差異的CG位點(diǎn)有39、56和118 bp等，推測(cè)COL1A1基因在快速生長(zhǎng)期發(fā)生高表達(dá)。劉海龍[23]對(duì)鹿茸頂端組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序分析，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外基質(zhì)基因中COL1A1基因在60 d快速生長(zhǎng)期表達(dá)量升高的結(jié)果佐證了這一推論。鹿茸的快速生長(zhǎng)與頂端的軟骨細(xì)胞的增殖、分化以及肥大密切相關(guān)[24]，前軟骨區(qū)和軟骨區(qū)具有豐富的血液供應(yīng)，且在前軟骨區(qū)血管的生成更高[25-26]。在哺乳動(dòng)物骨組織中COL1A1基因研究廣泛，據(jù)報(bào)道大約90%的成骨不全癥患者在COL1A1或COL1A2基因中存在雜合性變異，擾亂細(xì)胞內(nèi)正常的膠原組裝、細(xì)胞分泌以及細(xì)胞外間隙的纖維組裝[27]。Fernndez等[28]研究發(fā)現(xiàn)COL1A1基因在16日齡雞胚胸骨的軟骨細(xì)胞中顯示甲基化相對(duì)下調(diào)，他們認(rèn)為COL1A1密切參與骨及軟骨組織的生長(zhǎng)與調(diào)控。丁玲[29]的研究表明，COL1A1基因在快速生長(zhǎng)期和骨化期鹿茸軟骨組織中均高度表達(dá)但存在表達(dá)差異，COL1A1基因在快速生長(zhǎng)期的表達(dá)量均高于其他篩選出的膠原蛋白類差異表達(dá)基因且達(dá)到10倍以上，在骨化期的表達(dá)量高于除COL2A1外的其他基因，證實(shí)COL1A1在軟骨組織中期、后期都對(duì)鹿茸生長(zhǎng)發(fā)揮了有效的促進(jìn)作用。本研究中軟骨組織中后期甲基化水平低，且中后期相比前期的共同差異CG位點(diǎn)有39、56、118、190、291、299和415 bp，這與丁玲[29]的研究結(jié)果一致，但軟骨組織中期與后期甲基化水平?jīng)]有顯著差異與丁玲的研究結(jié)果相悖，這可能是由于亞硫酸氫鹽測(cè)序法測(cè)定DNA甲基化率時(shí)基因組DNA的CT轉(zhuǎn)化率存在誤差，導(dǎo)致其與轉(zhuǎn)錄組測(cè)定的表達(dá)水平不完全一致。

綜上所述，本研究分析了梅花鹿鹿茸3個(gè)代表前、中、后期生長(zhǎng)過(guò)程的鹿茸頂端不同組織間的DNA甲基化差異，結(jié)果表明COL1A1基因在快速生長(zhǎng)期，以及在間充質(zhì)組織、前軟骨組織、軟骨組織中對(duì)鹿茸生長(zhǎng)具有促進(jìn)作用，并且與COL1A1基因的甲基化位點(diǎn)以及COL1A1基因的甲基化率相關(guān)聯(lián)。但是試驗(yàn)尚需進(jìn)行COL1A1基因的表達(dá)測(cè)定來(lái)驗(yàn)證COL1A1基因的DNA甲基化水平與該基因發(fā)揮促進(jìn)鹿茸生長(zhǎng)作用的關(guān)系，因此后續(xù)研究將對(duì)COL1A1進(jìn)行基因和蛋白表達(dá)水平的測(cè)定，從而對(duì)COL1A1基因的作用機(jī)制進(jìn)行更進(jìn)一步研究。本研究在DNA甲基化水平上探究梅花鹿鹿茸不同組織的表觀遺傳差異，為進(jìn)一步研究鹿茸的再生、快速生長(zhǎng)和骨化機(jī)制提供理論參考。