蜂花粉致敏機(jī)制與脫敏技術(shù)研究進(jìn)展

陶宇逍，李強(qiáng)強(qiáng)*，周桂華，吳黎明

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蜜蜂研究所，北京 100093；2.廣西蜜博士蜂業(yè)有限責(zé)任公司，廣西 南寧 532706）

蜂花粉是蜜蜂從顯花植物花蕊中采集的花粉，經(jīng)蜜蜂加入花蜜及其唾液混合加工成的一種不規(guī)則的花粉團(tuán)[1]。蜂花粉含有多糖、蛋白質(zhì)、必需氨基酸、不飽和脂肪酸、維生素、礦物質(zhì)、核酸、酶類、酚酸類、黃酮類化合物以及微量營養(yǎng)素等200余種營養(yǎng)成分，幾乎包含了自然界全部營養(yǎng)素。因此，蜂花粉是一種良好的膳食補(bǔ)充劑，并享有“天然微型營養(yǎng)庫”的美稱[2]。蜂花粉富含生物活性物質(zhì)，可有效增強(qiáng)免疫力、防止衰老、美容皮膚，同時(shí)對(duì)炎癥、癌癥、心腦血管疾病、糖尿病、前列腺疾病等有輔助治療作用，是理想的功能性食品。但因蜂花粉的致敏性，蜂花粉產(chǎn)品的安全性和質(zhì)量控制仍是亟待解決的難題[3]。

蜂花粉的來源是普通花粉，因此蜂花粉和普通花粉一樣有可能引起人體的過敏反應(yīng)[4]?；ǚ圻^敏原是目前已知的最重要的一種過敏原，許多植物的花粉都會(huì)引起過敏患者一定的過敏反應(yīng)[5]。在一項(xiàng)研究中，用蜂花粉對(duì)147名特應(yīng)性患者和57位健康個(gè)體進(jìn)行過敏皮試，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，具有致敏性的成分是蜂花粉中的花粉，而不是蜜蜂唾液中的酶[6]。目前對(duì)于蜂花粉過敏案例的研究并不像其它花粉那樣豐富。本文將國內(nèi)外關(guān)于蜂花粉的致敏案例、過敏原分離鑒定、致敏機(jī)制評(píng)價(jià)，以及改善致敏性的加工控制技術(shù)相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為蜂花粉的安全生產(chǎn)和開發(fā)利用提供相關(guān)參考。

1 致敏機(jī)理

蜂花粉引起的食物源性過敏反應(yīng)屬于I型過敏反應(yīng)。I型過敏反應(yīng)的機(jī)制是過敏原刺激呼吸道或消化道的免疫細(xì)胞，細(xì)胞信號(hào)由抗原呈遞細(xì)胞傳遞到T細(xì)胞，T細(xì)胞釋放細(xì)胞因子促進(jìn)B細(xì)胞產(chǎn)生IgE抗體，IgE與肥大細(xì)胞表面的Fc受體結(jié)合，此時(shí)機(jī)體處于致敏狀態(tài)。當(dāng)機(jī)體再次接觸過敏原，過敏原與附著于肥大細(xì)胞上的IgE結(jié)合，肥大細(xì)胞發(fā)生脫粒，激發(fā)過敏反應(yīng)[7]。致敏過程如圖1所示。

圖1 I型過敏反應(yīng)機(jī)理Fig.1 Mechanism of type I allergy

2 蜂花粉變應(yīng)原的分離鑒定方法

2.1 十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法

對(duì)植物花粉過敏原的研究，研究者們通常利用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分離花粉粗提液組分并確定其蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量，經(jīng)離子交換層析法分離純化幾類主要的蛋白質(zhì)，通過免疫印跡法對(duì)比鑒定每種主要蛋白質(zhì)過敏原的致敏性，從而鑒定出蜂花粉中的主要變應(yīng)原[8]。

陳小文等[9]通過SDS-PAGE對(duì)油菜花粉的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分離并測定相對(duì)分子質(zhì)量，之后用免疫印跡法測定變應(yīng)原成分，并通過離子交換層析對(duì)油菜花粉變應(yīng)原進(jìn)行分離純化，結(jié)果顯示，油菜花粉中有10余條蛋白帶，其中分子質(zhì)量為30、25、15、10 ku的蛋白可與油菜花粉過敏癥病人的血清IgE結(jié)合，其中15 ku和10 ku的蛋白質(zhì)為主要變應(yīng)原。目前研究者使用此方法，已分離、純化得到了椰子、重陽木、大籽蒿、田菁等多類植物花粉的變應(yīng)原[10-13]。

2.2 雙向電泳法

除SDS-PAGE外，雙向電泳法也是分離測定過敏原的常用方法。與SDS-PAGE相比，雙向電泳法可以得到獨(dú)立的蛋白質(zhì)點(diǎn)，且分子量和等電點(diǎn)更加準(zhǔn)確。劉碩等[14]使用雙向電泳法對(duì)真葉葵花粉提取液的蛋白質(zhì)組分進(jìn)行分析，電泳圖結(jié)果顯示約有601個(gè)主要蛋白斑點(diǎn)，分子量分布約20 kDa～130 kDa，等電點(diǎn)主要集中在pH4.0～8.0。

2.3 聚合酶鏈反應(yīng)法

聚合酶鏈反應(yīng)法（polymerase chain reaction，PCR）是一種更加靈敏的檢測方法，可檢測到編碼過敏原蛋白質(zhì)的痕量DNA和RNA，并且結(jié)合分子生物學(xué)技術(shù)可獲得完整的致敏蛋白。Midoro-Horiuti等[15]通過雪松花粉樣品中的mRNA獲得雪松花粉主要過敏原Jun a 1的cDNA基因序列，并由大腸桿菌表達(dá)出過敏原蛋白質(zhì)，之后通過過敏癥患者的IgE進(jìn)行免疫痕跡分析，從而確定了Jun a 1的致敏性。為獲得梯牧草中的主要過敏原Phl p 4的完整蛋白并確定其致敏性，Dewitt等[16]通過PCR方法克隆出Phl p 4的全長cDNA，并由大腸桿菌表達(dá)出完整蛋白，再通過離子親和色譜進(jìn)行分離純化，成功獲得Phl p 4蛋白，并分析出其與芹菜過敏原蛋白Api g 5具有同源性。Vrtala等[17]利用過敏患者的IgE從Phleum pretense花粉中分離出一種由cDNA編碼的過敏原，可與約80%的草花粉過敏患者體內(nèi)的IgE結(jié)合，通過重組蛋白鑒定為來自梯牧草Phl p V的V組過敏原。由此可見，PCR法并非直接鑒定樣品中過敏原的完整蛋白序列，而是通過檢測編碼基因間接地獲得致敏蛋白序列。

2.4 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法

色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有高靈敏性、高分辨率、高自動(dòng)化等優(yōu)點(diǎn)，能直接檢測過敏原蛋白的存在、亞型、特異性肽段等，并且在檢測復(fù)雜樣品中的多個(gè)過敏原蛋白時(shí)具有優(yōu)越性，同時(shí)不涉及免疫手段，不需要特異性抗體的參與，被廣泛應(yīng)用于過敏原蛋白的研究中。Sepp?l?等[18]使用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，鑒定出了梯牧草中的Phl p 1b、Phl p 1a和Phl p 5b 3種過敏原蛋白的含量。付婉藝[19]依據(jù)免疫印跡結(jié)果，從黃花蒿花粉蛋白提取物SDS-PAGE膠上取蛋白條帶，使用高效液相色譜-離子阱質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行鑒定，成功鑒定出黃花蒿花粉中的新過敏原Art an 7。由于花粉的自然變異，花粉中的蛋白質(zhì)過敏原存在很多同工型，不同的同工型的氨基酸序列可能僅相差一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)可同時(shí)鑒定出多種同工型。Fenaille等[20]基于蛋白質(zhì)組學(xué)的分析方法，使用基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)，鑒定出來自不同草種的草花粉第一類過敏原存在5個(gè)同工型。因此，將質(zhì)譜技術(shù)與各種分離手段相結(jié)合，可用于蛋白質(zhì)組學(xué)高通量分析，從而明確致敏蛋白的各種亞型及特異性肽段等[21]。

3 基于過敏動(dòng)物模型的蜂花粉致敏性評(píng)價(jià)與機(jī)制研究

由于人體實(shí)驗(yàn)的安全性和局限性，建立敏感動(dòng)物的過敏模型研究過敏原是更為安全高效的方法。研究表明，嚙齒動(dòng)物在免疫調(diào)節(jié)的許多方面與人類相似，并且某些品系屬于高IgE反應(yīng)型，類似于人類的遺傳性過敏癥，因此過敏動(dòng)物模型被廣泛應(yīng)用于食物致敏性評(píng)價(jià)與機(jī)制研究中，常用過敏嚙齒動(dòng)物模型見表1。

表1 常用過敏嚙齒動(dòng)物模型Table 1 Commonly used rodent models of allergy

3.1 基于小鼠模型的蜂花粉致敏性評(píng)價(jià)與機(jī)制研究

小鼠作為最常用的動(dòng)物模型，具有體積小、繁殖快、成本低等優(yōu)點(diǎn)，目前近親交配和轉(zhuǎn)基因小鼠以及多種小鼠免疫分子試劑已經(jīng)商品化，小鼠模型被廣泛用于過敏性疾病和過敏機(jī)制的研究[33]。

BALB/c小鼠是近親交配高IgE應(yīng)答品系，常被作為食物過敏和花粉過敏的動(dòng)物模型。Castillo-Courtade等[34]用卵清蛋白（ovalbumin，OVA）作為過敏原，氫氧化鋁作為佐劑對(duì)BALB/c小鼠進(jìn)行經(jīng)口灌胃，用大劑量OVA灌胃激發(fā)，制備小鼠消化道過敏模型。結(jié)果顯示，過敏組小鼠中，血清總IgE、OVA特異性IgE和OVA特異性IgG表達(dá)量增高，回腸、結(jié)腸及血清中mMCp-1表達(dá)量增高，脾細(xì)胞、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）和白細(xì)胞介素-3（interleukin-3，IL-3）表達(dá)量增高。不同品系小鼠對(duì)同一過敏原的過敏反應(yīng)可能存在差異，如趙新鳳等[35]對(duì)BALB/c和KM兩個(gè)品系小鼠食物過敏模型進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，BALB/c小鼠對(duì)OVA的敏感性高于KM小鼠。

3.2 基于大鼠模型的蜂花粉致敏性評(píng)價(jià)與機(jī)制研究

敏感品系大鼠能產(chǎn)生較為理想的I型過敏反應(yīng)，相較于豚鼠和小鼠，大鼠的大小更適于在單體進(jìn)行分析，并且致敏激發(fā)后能產(chǎn)生與人類相似的過敏癥狀[36]。BN大鼠是高免疫球蛋白應(yīng)答品系，常作為研究花粉過敏和食物過敏的動(dòng)物模型。梯牧草花粉與水接觸后會(huì)釋放出含有過敏原的淀粉顆粒，Motta等[37]以此淀粉顆粒溶液作為過敏原，用滴鼻法對(duì)BN大鼠進(jìn)行氣管內(nèi)致敏，滴鼻激發(fā)后采集血液和支氣管淋巴結(jié)。采用酶聯(lián)免疫法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）對(duì)大鼠血清中的梯牧草抗原特異性IgE進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示，特異性IgE表達(dá)增高，并且花粉顆粒可誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞增殖。朱慶齡等[38]采用卵清蛋白作為過敏原，在無佐劑條件下對(duì)BN大鼠經(jīng)口灌胃，建立BN大鼠食物過敏模型。結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，過敏組大鼠血清OVA-IgE和血漿組胺水平顯著增高，致敏率為90%。Sun等[39]比較了BN和Wistar大鼠口服卵清蛋白后的過敏反應(yīng)和臨床表現(xiàn)，結(jié)果顯示，兩種品系的大鼠表現(xiàn)出不同的過敏反應(yīng)和臨床表現(xiàn)，并且過敏反應(yīng)與臨床表現(xiàn)之間沒有相關(guān)性，這些結(jié)果表明這兩種品系大鼠的免疫學(xué)機(jī)制可能存在不同。

3.3 基于豚鼠模型的蜂花粉致敏性評(píng)價(jià)與機(jī)制研究

豚鼠具有易感性，是目前常用的過敏動(dòng)物之一。楊瓊梁等[40]用楊樹花粉激發(fā)豚鼠過敏建立過敏模型，對(duì)Dunkin Hartley雄性豚鼠腹腔注射致敏3次后，通過霧化吸入激發(fā)。結(jié)果顯示，模型組豚鼠的鼻黏膜、支氣管肺泡灌洗液和肺組織存在炎癥細(xì)胞浸潤，白細(xì)胞介素4免疫反應(yīng)上升，干擾素γ免疫反應(yīng)下降，血清中IgE、組胺、白三烯B4含量增加。向軍儉等[41]以海蝦浸提液為過敏原，氫氧化鋁為免疫佐劑，建立豚鼠過敏模型。結(jié)果顯示，豚鼠血清中海蝦過敏原的血清IgE和IgG水平顯著上升。

盡管利用敏感品系動(dòng)物構(gòu)建蜂花粉食源性致敏的動(dòng)物模型及其機(jī)制研究目前尚不健全，但上述花粉及食物致敏的動(dòng)物模型建立為后續(xù)蜂花粉食源致敏性研究奠定了基礎(chǔ)，各致敏指標(biāo)的測定也為蜂花粉致敏機(jī)制的探究提供了技術(shù)支持。

4 改善蜂花粉致敏性的加工控制技術(shù)

4.1 超高壓技術(shù)

超高壓技術(shù)可在常溫或低溫環(huán)境下使用，在改變抗原蛋白空間構(gòu)象的同時(shí)，對(duì)食品營養(yǎng)成分和風(fēng)味物質(zhì)的影響較小，在食品脫敏加工領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[42]。例如，大豆中的大豆球蛋白和β-伴大豆球蛋白是主要過敏原，Tang等[43]研究發(fā)現(xiàn)，在較高的壓力（400 MPa或600 MPa）條件下，大豆球蛋白的構(gòu)象會(huì)發(fā)生變化。牛β-乳球蛋白是一種重要的牛奶過敏原，Meng等[44]使用高壓處理牛β-乳球蛋白，結(jié)果表明，其構(gòu)象因高壓處理而改變，致敏性顯著下降。

4.2 熱處理

熱處理可使蛋白質(zhì)發(fā)生共價(jià)或非共價(jià)相互作用，如交聯(lián)、聚合、變形和二硫鍵重排等，在一定程度上破壞了蛋白質(zhì)的過敏原表位，從而降低致敏性。Burks等[45]在80℃和120℃條件下處理大豆樣品60 min，通過ELISA法檢驗(yàn)大豆蛋白7S和11S片段的致敏性，發(fā)現(xiàn)加熱能顯著降低7S和11S蛋白結(jié)合IgE的能力。Kasera等[46]研究了熱處理對(duì)豆類蛋白致敏性的改變，結(jié)果顯示，蕓豆、黑豆和花生的可溶性蛋白以及不溶性蛋白的特異性IgE結(jié)合能力顯著降低。然而，單熱處理存在不確定性，在加熱過程中可能生成一些新的過敏原表位、蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的過敏原表位可能暴露，從而可能會(huì)增加致敏性。并且，熱處理對(duì)于食物中的熱不穩(wěn)定性營養(yǎng)成分（如維生素、不飽和脂肪酸等）會(huì)產(chǎn)生破壞，相比非熱脫敏技術(shù)存在一定的弊端。

4.3 輻照

輻照處理可使蛋白質(zhì)的二硫鍵、氫鍵等發(fā)生斷裂，使蛋白質(zhì)二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，甚至導(dǎo)致蛋白質(zhì)脫氫、脫氨，使一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。輻照還可使蛋白質(zhì)分子內(nèi)或分子間發(fā)生交聯(lián)，從而降低致敏蛋白質(zhì)的致敏性[47]。Vaz等[48]用γ-輻射處理小麥胚芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA），發(fā)現(xiàn)WGA的過敏性抗原表位在高劑量輻射后活躍性降低，同時(shí)也發(fā)現(xiàn)經(jīng)10 kGy處理后的小麥胚芽凝集素的結(jié)構(gòu)發(fā)生了變化，其呈折疊且無定形聚合狀態(tài)，證明γ-輻射可降低小麥的致敏性。然而，目前消費(fèi)者對(duì)輻照食品存在排斥心理，輻照食品的食用安全性也存在爭議，因此開發(fā)新型、高效、安全的脫敏技術(shù)十分必要。

4.4 生物法

4.4.1 酶法

蛋白酶催化蛋白質(zhì)水解，可破壞具有過敏原表位的片段，從而顯著降低過敏原蛋白的致敏性。Lakshman等[49]從紅曲菌中提純出兩種酸蛋白酶，采用單一酶法和復(fù)合酶法酶促制備乳清蛋白濃縮物的水解產(chǎn)物。結(jié)果表明，紅曲霉酸蛋白酶能夠有效地水解兩個(gè)主要的牛乳過敏原，降低牛乳乳清蛋白的致敏性。李育強(qiáng)等[50]建立了一種花粉和蜂花粉破壁、脫敏、提取水溶性成分的方法，使用糖苷酶、蛋白酶和肽酶處理，在脫敏同時(shí)能保留更多的營養(yǎng)成分并改善口感。

4.4.2 發(fā)酵法

微生物作用可使蛋白質(zhì)分解變性，從而達(dá)到降低過敏性的目的。相比于其它方法，發(fā)酵處理后的食品中的蛋白質(zhì)被分解，有助于吸收，同時(shí)對(duì)其它營養(yǎng)成分影響較小[51]。Biscola等[52]研究評(píng)估了蛋白水解菌株糞腸球菌VB43水解豆?jié){中存在的主要致敏蛋白的能力，結(jié)果表明，β-伴大豆球蛋白被完全水解，大豆球蛋白被水解為酸性多肽。

生物法包括酶法和發(fā)酵法，相比超高壓技術(shù)、熱處理和輻照而言，更加高效、安全，在花粉和蜂花粉產(chǎn)品開發(fā)領(lǐng)域已有所應(yīng)用，然而目前尚缺少對(duì)酶或發(fā)酵處理后蜂花粉致敏性評(píng)價(jià)的科學(xué)手段，因此對(duì)于處理參數(shù)條件的優(yōu)化和控制無法標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)施。健全蜂花粉致敏性評(píng)價(jià)體系、開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化脫敏方法是亟需解決的問題。

5 結(jié)語

蜂花粉是良好的膳食補(bǔ)充劑，有較大的開發(fā)潛力，隨著需求的增加，有關(guān)其致敏性的研究和評(píng)估機(jī)制也亟需完善。對(duì)于蜂花粉過敏原的研究，可以從根本上建立健全蜂花粉的安全性評(píng)估機(jī)制，為生產(chǎn)所需的各種脫敏技術(shù)手段打好理論基礎(chǔ)，也對(duì)蜂花粉進(jìn)一步地開發(fā)利用具有重要意義。