排錢草總生物堿提取物的制備與質(zhì)量分析

馮 軍，柴 玲 ，劉布鳴*，陳小剛，3

（1.廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530022；2.廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 530022；3.廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)藥研究院，廣西 南寧 530001）

排錢草別名龍鱗草、尖葉阿婆錢，為豆科植物排錢草Phyllodium pulchellum（L.）Desv 的干燥根，主要分布于廣西、廣東、江西等省份。其具有活血化瘀、清熱利水的作用，臨床常用于治療肋骨疼痛、月經(jīng)不調(diào)、閉經(jīng)等。目前，對(duì)排錢草藥材的研究主要集中在化學(xué)成分［1-3］、質(zhì)量評(píng)價(jià)［4］以及藥理活性［5-6］等方面，尚無(wú)對(duì)排錢草總生物堿提取物的制備及其質(zhì)量分析方法的研究報(bào)道。本文制備排錢草總生物堿提取物并建立質(zhì)量分析方法，為排錢草的進(jìn)一步開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器 Thermo UItiMate 3000 超高效液相色譜儀，配置在線脫氣機(jī)、四元梯度泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器；布魯克AVANCE NEO 600 MHz 核磁共振儀；Thermo Q-Exactive Focus 高分辨質(zhì)譜儀；Waters 2545-2767-2489 制備型高效制備液相色譜儀；Kromasil Ecosil C-18Extend 半制備色譜柱（250 mm× 10 mm，5 μm）；十萬(wàn)分之一天平；島津2700 紫外-可見分光光度計(jì)。

1.2 試劑與材料 色胺（上海源葉生物技術(shù)有限公司，純度≥98%）；5-甲氧基-N，N-二甲基色胺（由廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，經(jīng)峰面積歸一化法測(cè)定，純度≥98%）；排錢草總生物堿提取物（由廣西中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制）。

1.3 藥材 排錢草采自廣西賀州市鐘山縣紅花村委麥嶺自然村，經(jīng)廣西壯族自治區(qū)中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為豆科植物排錢草Phyllodium pulchellum（L.）Desv的干燥根。

2 方法與結(jié)果

2.1 排錢草總生物堿提取物的制備 取排錢草藥材粗粉1 kg，加15 倍量70%乙醇回流提取3 次，每次1.5 h，濾過(guò)，合并濾液，濾液回收乙醇并減壓濃縮至無(wú)醇味，濃縮至料液比為1：10，即得排錢草提取液；將提取液置于已處理好的大孔樹脂（D101）柱中吸附，速度2 BV/h；先用 1 BV 水洗脫，棄去洗脫液，再用 4 BV 量60%乙醇以4 BV/h 速度洗脫，收集乙醇洗脫液，洗脫液減壓濃縮至浸膏，50 ℃真空干燥，即得排錢草總生物堿提取物。

2.2 排錢草總生物堿提取物主要化學(xué)成分分離鑒定

2.2.1 分離純化 取排錢草總生物堿提取物50 g，用水分散吸附于D101 大孔樹脂，分別用水、30%乙醇和70%乙醇洗脫。30%乙醇洗脫物再以中壓柱層析得到流份（Fr.1-Fr.5），甲醇：水（10：90→50：50）。Fr.5 經(jīng)過(guò)高效制備液相色譜分離得到化合物1（2 g）。

2.2.2 波譜分析 化合物1：1H NMR（DMSO-d6，600 MHz）δ：7.25（1H，d，J=8.8 Hz，H-7），7.14（1H，s，H-2），7.07（1H，d，J=2.2 Hz，H-4），6.79（1H，dd，J=2.2 Hz，8.8 Hz，H-6），3.83（3H，s，5-OCH3），3.32（2H，overlap，H-9），3.14（2H，t，J=8.2 Hz，H-8），2.85（6H，s，N（CH3）2）；13C NMR（DMSO-d6，150 MHz）δ:153.9（C-5），132.0（C-7a），127.0（C-4a），123.4（C-2），111.8（C-6），111.5（C-3），108.3（C-7），99.6（C-4），60.2（C-9），57.8（5-OCH3），54.9（N-CH3），42.1（C-11），20.6（C-10）.以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］報(bào)道基本一致，故鑒定化合物1 為5-methoxy-N，N-dimethyltryptamine（5-甲氧基-N，N-二甲基色胺）。

2.2.3 UHPLC-HR-MS分析

2.2.3.1 色譜條件 Thermo Accucore C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-水（B）；梯度洗脫（0～10 min，10%～90%A）；流速為0.3 ml/min，柱溫為20 ℃；進(jìn)樣量：1 μl。

2.2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧（HESI）；檢測(cè)模式：正離子模式；質(zhì)量掃描范圍：m/z 100～1200；毛細(xì)管溫度為320 ℃；鞘氣體積流量為40 psi，輔助氣體積流量為10 psi；噴霧電壓為3.3 kV；探頭加溫器溫度為350 ℃；質(zhì)量分辨率≥70 000；碰撞能量（CE）：40 eV。

2.2.3.3 供試品溶液的制備 取排錢草總生物堿提取物適量，加甲醇溶解，制成每1 ml 含排錢草總生物堿提取物約1 mg的溶液，0.22 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3.4 樣品測(cè)定 吸取供試品溶液，按色譜、質(zhì)譜條件進(jìn)行分析，分別得到總離子流圖（TIC）及質(zhì)譜圖，采用Xcalibur 軟件進(jìn)行峰提取、峰匹配等數(shù)據(jù)處理，用Compound Discover 2.3 軟件進(jìn)行預(yù)處理，以精確質(zhì)量數(shù)提取主成分5-甲氧基-N，N-二甲基色胺的質(zhì)譜圖。

2.2.4 鑒定結(jié)果與分析 MS（ESI）m/z 219.15、174.09、159.07、143.07，HRMS［M+H］+準(zhǔn)分子離子峰 m/z 219.14906 與5-甲氧基-N，N-二甲基色胺質(zhì)量數(shù)（C13H19ON2，理論值：219.14190）相符，測(cè)得分子量為218，二級(jí)質(zhì)譜符合5-甲氧基-N，N-二甲基色胺的裂解規(guī)律。MS 裂解過(guò)程如下：［M+H］+產(chǎn)生準(zhǔn)分子離子峰m/z 219.15，支鏈二甲胺基裂解后產(chǎn)生m/z 174.09碎片，5號(hào)位甲氧基進(jìn)一步裂解，分別裂去甲基和甲氧基產(chǎn)生m/z 159.07和143.07的碎片，裂解過(guò)程見圖1。

圖1 5-甲氧基-N，N-二甲基色胺裂解過(guò)程

2.3 排錢草總生物堿含量測(cè)定

2.3.1 對(duì)照品的選擇與檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 現(xiàn)有研究表明，排錢草中含有色胺以及5-甲氧基-N，N-二甲基色胺、N，N-二甲基色胺、5-羥基-N，N-二甲基色胺等以色胺為結(jié)構(gòu)母核的生物堿成分。實(shí)驗(yàn)顯示，色胺對(duì)照品及樣品溶液均在275 nm波長(zhǎng)處有最大吸收，見圖2。故以色胺作為總生物堿含量測(cè)定的對(duì)照品，在275 nm波長(zhǎng)處測(cè)定。

圖2 紫外吸收光譜圖

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取色胺對(duì)照品適量，加甲醇制成每1 ml 含503 μg 的溶液，即得。

2.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密吸取色胺對(duì)照品溶液0.1 ml、0.2 ml、0.3 ml、0.4 ml、0.5 ml、0.6 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，以甲醇作為空白，在275 nm 測(cè)定吸光度，以濃度（μg/ml）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為Y=0.027 50X+0.015 93，r=0.999 8。

2.3.4 供試品溶液的制備 取3個(gè)批次的排錢草總生物堿提取物，每批2 份，每份約10 mg，精密稱定，分別置于25 ml 量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取1 ml，置于10 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.5 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)測(cè)定6次，結(jié)果RSD 為0.09%（n=6）。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，分別在0 min、30 min、45 min、60 min、90 min、120 min測(cè)定，結(jié)果RSD為1.1%（n=6），表明供試品溶液在120 min內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批樣品制備供試品溶液6份，按擬定方法測(cè)定，結(jié)果平均含量為50.41%，RSD 為1.01%（n=6）。

2.3.8 回收率試驗(yàn) 取已知含量的排錢草總生物堿提取物，分別精密加入色胺對(duì)照品適量，按擬定方法測(cè)定含量，并計(jì)算回收率，回收率平均值為95.16%，RSD 為2.3%（n=6）。

2.3.9 樣品測(cè)定 以甲醇作為空白，在275 nm 波長(zhǎng)處分別測(cè)定吸光度，計(jì)算生物堿含量，排錢草總生物堿含量以色胺C10H12N2計(jì)算分別為50.90%、50.11%、50.21%，結(jié)果見表1。

表1 排錢草總生物堿提取物含量測(cè)定結(jié)果

3 討 論

隨著科技發(fā)展，精制的天然植物提取物以低毒高效的特性受到人們?cè)絹?lái)越多的青睞。研究表明，排錢草主要藥效成分為生物堿類成分。由于排錢草藥用部位為根，應(yīng)用中具有重量大、儲(chǔ)存難、運(yùn)輸不便等缺點(diǎn)，制備排錢草總生物堿提取物既能保證與藥材主要功效的一致性，又能彌補(bǔ)上述不足。本文建立的排錢草總生物堿提取物的質(zhì)量分析方法準(zhǔn)確可靠，可為排錢草總生物堿提取物的質(zhì)量控制提供方法參考。