養(yǎng)陰清熱方通過(guò)下調(diào)JAK/STAT信號(hào)通路調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡的實(shí)驗(yàn)研究

掌琳惠,馬元婧,繆蓉,王偉,翁文馨,袁冬平,龍軍,孫云霞

(1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院,江蘇 南京 210023;2.江蘇省中醫(yī)院老年科,江蘇 南京 210004)

動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是心血管疾病的先發(fā)事件,是一種以血管壁脂質(zhì)沉積為特點(diǎn)的慢性炎癥性自身免疫疾病[1]。誘發(fā)AS的因素很多,細(xì)菌感染機(jī)體后釋放的LPS可以促進(jìn)AS的發(fā)展。LPS可以促進(jìn)CD4+T細(xì)胞向輔助性T細(xì)胞17(Helper T cells 17,Th17)亞群分化,減少調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cells,Treg)亞群的比例。在LPS作用下,機(jī)體呈現(xiàn)出抗炎細(xì)胞因子(如IL-10、TGF-β等)少、促炎細(xì)胞因子(如IL-6、IL-12p70等)多的炎癥狀態(tài)[2-3]?，F(xiàn)已知Treg/Th17平衡是調(diào)控AS免疫炎癥的關(guān)鍵,轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和RORγt分別是調(diào)節(jié)Treg和Th17的關(guān)鍵因子[4-5]。

養(yǎng)陰清熱方(YHF)是全國(guó)名老中醫(yī)唐蜀華教授治療AS的經(jīng)驗(yàn)方,在臨床上已應(yīng)用多年。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)YHF可以調(diào)節(jié)外周Treg/Th17的平衡,改善高脂飲食誘導(dǎo)的ApoE-/-小鼠AS癥狀[6-7],然而具體機(jī)制仍不明確。酪氨酸蛋白激酶/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活子(JAK/STAT)通路是多種細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的共同通路,參與炎癥的發(fā)生發(fā)展。研究表明,IL-6介導(dǎo)的JAK/STAT信號(hào)通路在初始CD4+T細(xì)胞分化中起重要作用[8],細(xì)胞因子IL-6的釋放促進(jìn)了CD4+T細(xì)胞分化為T(mén)h17和Treg[9]。因此,JAK/STAT通路在Treg/Th17平衡中發(fā)揮重要的作用。本實(shí)驗(yàn)著重觀察YHF對(duì)LPS刺激下的小鼠CD4+T細(xì)胞Treg/Th17平衡及炎性細(xì)胞因子表達(dá)的影響,并探討這一過(guò)程是否與JAK/STAT信號(hào)通路有關(guān)。

1 材料

1.1 細(xì)胞

1.2 藥品與試劑

標(biāo)準(zhǔn)品:虎杖苷、白藜蘆醇、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、大黃素、羥基紅花黃色素A、姜黃素、蘆丁、槲皮素(上海源葉生物科技有限公司,HPLC≥98%,批號(hào):T15A10F85743、R19J12S138196、J17N8Z48440、T17A10F95418、C10J9Q52616、HA0820KA14、Y24F11Y7051、YJ0603HA13)。PBS(武漢博士德生物工程有限公司,批號(hào):09D16B30);RPMI培養(yǎng)基(Hyclone,批號(hào):319075016);胎牛血清(Gibco,批號(hào):1205331);二甲基亞砜(南京化學(xué)試劑有限公司,批號(hào):14081511779);LPS(Tocris,批號(hào):1158);小鼠Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells試劑盒(Invitrogen,批號(hào):11416D);MTT(Biosharp,批號(hào):0793);AG490(Sigma,批號(hào):658411);Leukocyte Activation Cocktail(BD Pharmingen,批號(hào):9324126);FITC Rat IgG2a K Isotype對(duì)照流式抗體、PE Mouse IgG2a K Isotype對(duì)照流式抗體、APC Arm Hamster IgG2a K Isotype對(duì)照流式抗體(eBioscience,批號(hào):E00569-1633、4281861、4283465);4×細(xì)胞固定破膜緩沖液、5×細(xì)胞破膜/洗滌緩沖液(BD Pharmingen,批號(hào):1285830、8229785);抗小鼠CD4 FITC流式抗體(Invitrogen,1984820);抗小鼠CD25 PE流式抗體、抗小鼠IL-17A PE流式抗體(eBioscience,批號(hào):4277529、4306479)、抗小鼠Foxp3 APC流式抗體(BD Pharmingen,批號(hào):5006762);Foxp3兔抗鼠多克隆抗體(Proteintech,批號(hào):01581000);STAT3兔抗鼠多克隆抗體、JAK2兔抗鼠多克隆抗體、RORγt兔抗鼠多克隆抗體、p-STAT3兔抗鼠多克隆抗體、p-JAK2兔抗鼠多克隆抗體(Abcam,批號(hào):GR186186855-6、GR317162-2、GR316144-3、GR287047-19、GR3174887-5);小鼠IL-6、TGF-β、IL-10、IL-12p70 ELISA試劑盒(杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司,批號(hào):EK2061/2、EK2812/2、EK210/3-96、EK212HS-96)。

1.3 儀器

低溫冷卻液循環(huán)泵(南京金正公司,型號(hào):DLSB-5L/20);高效液相色譜儀(美國(guó)Thermo Scientific公司,型號(hào):UltimateTM3000);酶標(biāo)儀(瑞士TECAN公司,型號(hào):Infinite M200PRO);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司,型號(hào):GaliosTMFlow Cytometer);電泳儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào):164-5050Western);凝膠成像儀(美國(guó)Bio-Rad公司,型號(hào):GelDoc2000)。

2 方法

2.1 YHF水提液的制備

藥材制何首烏、酒黃精、虎杖、漏蘆、姜黃、紅花均購(gòu)自江蘇省中醫(yī)院,并經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)劉圣金教授鑒定均為正品,以1∶1∶3∶3∶1∶1的質(zhì)量比混合,于8倍體積蒸餾水中浸泡1 h,隨后煎煮1 h,收集水煎液。藥渣再用6倍水煎煮1 h,合并2次煎液。將所得水煎液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)濃縮,旋蒸溫度為60 ℃，得YHF水提液(2 g·mL-1),分裝凍存于-20 ℃冰箱,備用。

2.2 HPLC檢測(cè)

檢測(cè)前先解凍YHF水提液,12 000 r·min-1離心5 min,移取上清,三蒸水稀釋20倍,0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。色譜柱:Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5 μm)。流動(dòng)相:0.2%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)。梯度洗脫條件:0～25 min:90%A;25～35 min:82%A;35～45 min:60%A;45～50 min:40%A。流速:1.0 mL·min-1。柱溫:30 ℃。進(jìn)樣量:10 μL。檢測(cè)波長(zhǎng):羥基紅花黃色素A,407 nm;虎杖苷,320 nm;蘆丁,350 nm;2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷,320 nm;白藜蘆醇,320 nm;槲皮素,365 nm;大黃素,254 nm;姜黃素,375 nm。將樣品與標(biāo)準(zhǔn)品保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì),對(duì)色譜峰進(jìn)行定性分析,通過(guò)外標(biāo)法計(jì)算樣品中有效成分含量。

2.3 脾臟CD4+ T細(xì)胞的分選

無(wú)菌分離小鼠完整脾臟,研磨成細(xì)胞勻漿,過(guò)濾,加入紅細(xì)胞裂解液混勻,靜置,離心收集細(xì)胞。參照小鼠Dynabeads Untouched Mouse CD4 Cells試劑盒說(shuō)明書(shū)用法,磁珠分選出CD4+T細(xì)胞。加入抗CD3/CD28抗體(4 μg·mL-1抗小鼠CD28抗體和6 μg·mL-1抗小鼠CD3抗體),于37 ℃,5%CO2條件下培養(yǎng)分離得到的CD4+T細(xì)胞[7]。

2.4 分組與給藥

LPS濃度篩選試驗(yàn)分組:空白對(duì)照組和LPS組。用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1,接種到96孔板中。空白對(duì)照組給予抗CD3/CD28抗體。LPS組在抗CD3/CD28抗體的基礎(chǔ)上給予LPS,分為0.001、0.01、0.1、1、10、100 μmol·L-16個(gè)濃度組。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)孵育12 h,MTT法分別檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的OD值。

給藥濃度篩選實(shí)驗(yàn)分組:空白對(duì)照組，LPS組，1、2、4、8 mg·mL-1YHF組。各組細(xì)胞均用完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106mL-1,接種到96孔板中,給予抗CD3/CD28抗體孵育培養(yǎng)。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔?？瞻讓?duì)照組給予等體積的RPMI無(wú)血清培養(yǎng)基。LPS組給予0.1 μmol·L-1LPS培養(yǎng)12 h。YHF組在給予LPS培養(yǎng)12 h后分別給予不同濃度的YHF(1、2、4、8 mg·mL-1)。24 h和48 h后MTT法分別檢測(cè)各孔在490 nm波長(zhǎng)處的OD值。

數(shù)學(xué)學(xué)科具有思維的高度抽象性，邏輯嚴(yán)密性等突出特點(diǎn)，考試大綱以體現(xiàn)數(shù)學(xué)學(xué)科特點(diǎn)為前提，要求考試內(nèi)容包括大學(xué)本科數(shù)學(xué)專業(yè)基礎(chǔ)課程知識(shí)與高中數(shù)學(xué)知識(shí)，包括數(shù)學(xué)分析，高等代數(shù)，解析幾何，概率論與數(shù)理統(tǒng)計(jì)及高中新課標(biāo)中所規(guī)定的必修課全部?jī)?nèi)容，全面考察相關(guān)知識(shí)點(diǎn).

在研究YHF對(duì)JAK/STAT信號(hào)通路影響的實(shí)驗(yàn)中使用JAK抑制劑AG490。AG490配制成5 mmol·L-1的母液,用時(shí)以終濃度為50 μmol·L-1加入到CD4+T細(xì)胞中。YHF的濃度為4 mg·mL-1。YHF作用于CD4+T細(xì)胞24 h后做相應(yīng)檢測(cè)。

2.5 ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清細(xì)胞因子含量

CD4+T細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,3 000 r·min-1離心10 min,收集上清液。使用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中IL-10、TGF-β、IL-6和IL-12p70含量。樣本上樣量100 μL。按照說(shuō)明書(shū)步驟,依次加入待檢樣本、抗體、HRP顯色底物、終止液進(jìn)行孵育、洗滌,最后用酶標(biāo)儀讀取指定波長(zhǎng)下的OD值,按說(shuō)明書(shū)中的計(jì)算公式,計(jì)算細(xì)胞因子含量。

2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+ T細(xì)胞中Treg、Th17細(xì)胞的比例

在給藥18 h后將細(xì)胞用含1%BSA的PBS清洗并用Leukocyte Activation Cocktail處理6 h,然后將細(xì)胞與流式抗體在4 ℃條件下避光孵育。熒光標(biāo)記Foxp3或IL-17A前先在細(xì)胞中加入固定/破膜液對(duì)細(xì)胞打孔,然后加入Foxp3或IL-17A流式抗體孵育標(biāo)記。加入染色緩沖液清洗,再將細(xì)胞重懸于染色緩沖液中,上機(jī)檢測(cè)。首先在FSC-SSC散點(diǎn)圖中將淋巴細(xì)胞群設(shè)門(mén),根據(jù)標(biāo)記的CD4流式抗體圈出CD4+T細(xì)胞。然后根據(jù)CD25流式抗體和Foxp3抗體圈出CD25+Foxp3+T細(xì)胞(Treg細(xì)胞),或者根據(jù)IL-17A流式抗體圈出IL-17A+T細(xì)胞(Th17細(xì)胞),即可得到這些細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例。

2.7 Western blot法檢測(cè)蛋白的表達(dá)

用RIPA強(qiáng)裂解液提取細(xì)胞蛋白,再用BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)量濃度。加入上樣緩沖液,在100 ℃金屬浴中變性10 min。將30 μg蛋白樣品加入10%SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳。電泳結(jié)束后,將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。抗體孵育前,使用溶于TBST(含0.1%聚山梨酯20的三乙醇胺緩沖鹽溶液)的脫脂奶粉封閉。封閉結(jié)束后,根據(jù)蛋白質(zhì)的相對(duì)分子質(zhì)量裁剪PVDF膜,并先后在稀釋于5%BSA溶液的一抗和含HRP的二抗中孵育。孵育結(jié)束后,PVDF膜用TBST漂洗,滴加適量化學(xué)發(fā)光HRP底物,在全自動(dòng)凝膠成像儀中獲取條帶圖像,并用Image Lab4.0.1軟件(Bio-rad公司)分析。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

3 結(jié)果

3.1 YHF水提液的有效成分分析

在YHF水提液中共鑒定出8種有效成分,分別為羥基紅花黃色素A、虎杖苷、蘆丁、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、白藜蘆醇、槲皮素、大黃素、姜黃素,各成分的含量見(jiàn)表1,色譜峰見(jiàn)圖1。

表1 YHP水提液中8種有效成分含量

注: A.407 nm;B.320 nm;C.350 nm;D.320 nm;E.320 nm;F.365 nm;G.254 nm;H.375 nm;1.紅花黃色素;2.虎杖苷;3.蘆丁;4.2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷;5.白藜蘆醇;6.槲皮素;7.大黃素;8.姜黃素

3.2 YHF對(duì)LPS誘導(dǎo)的CD4+ T細(xì)胞增殖的抑制作用

MTT結(jié)果見(jiàn)圖2A,相較于空白對(duì)照組(CD3/CD28),0.01～10 μmol·L-1LPS作用CD4+T細(xì)胞12 h后,可顯著促進(jìn)細(xì)胞增殖(P<0.01，P<0.001),其中0.1 μmol·L-1的作用更明顯(P<0.001)。因此,后續(xù)研究選擇0.1 μmol·L-1LPS與CD4+T細(xì)胞作用12 h作為刺激CD4+T細(xì)胞增殖的條件。

為了觀察YHF對(duì)LPS刺激的CD4+T細(xì)胞增殖是否有干預(yù)作用,本實(shí)驗(yàn)用MTT法檢測(cè)了LPS刺激CD4+T細(xì)胞12 h后,YHF干預(yù)24 h和48 h對(duì)細(xì)胞活力的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2B。1、2、4、8 mg·mL-1YHF作用CD4+T細(xì)胞24 h,均可以抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(P<0.05);2、4 mg·mL-1YHF作用CD4+T細(xì)胞48 h,可以抑制LPS誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖(P<0.05)。由于YHF作用細(xì)胞48 h的平均細(xì)胞活力低于24 h,因此選用YHF給藥濃度為1、2、4 mg·mL-1和給藥時(shí)間為24 h作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)條件。以上結(jié)果提示,YHF水提液可以抑制LPS誘導(dǎo)的CD4+T細(xì)胞增殖。

注:與空白對(duì)照組(CD3/CD28)比較,**P<0.01,***P<0.001;與LPS組比較,

3.3 YHF對(duì)CD4+ T細(xì)胞中Treg、Th17比例的影響

檢測(cè)CD4+T細(xì)胞中Treg、Th17比例的結(jié)果見(jiàn)圖3,與空白對(duì)照組比較,0.1 μmol·L-1LPS作用CD4+T細(xì)胞12 h后,Treg比例減少(P<0.05),Th17比例明顯增加(P<0.01)。與LPS組比較,1、2、4 mg·mL-1的YHF作用細(xì)胞24 h后,Treg細(xì)胞比例均升高(P<0.05,P<0.01),Th17細(xì)胞比例降低(P<0.01)。以上結(jié)果提示,YHF能影響LPS刺激下的CD4+T細(xì)胞中Treg/Th17比例,使Treg/Th17比例向Treg方向偏移。

注:與空白對(duì)照組(CD3/CD28)比較,*P<0.05,**P<0.01;與LPS組比較,

3.4 YHF對(duì)CD4+ T細(xì)胞上清中Treg、Th17相關(guān)的細(xì)胞因子表達(dá)的影響

ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清中Treg(IL-10、TGF-β)和Th17(IL-6、IL-12p70)相關(guān)細(xì)胞因子的含量,結(jié)果見(jiàn)圖4。與空白對(duì)照組比較,0.1 μmol·L-1LPS作用CD4+T細(xì)胞12 h后,Treg相關(guān)的IL-10和TGF-β含量減少,Th17相關(guān)的IL-6、IL-12p70含量增加(P<0.05)。與LPS組比較,2 mg·mL-1YHF增加TGF-β、IL-10的含量(P<0.05)，降低IL-6的含量(P<0.05),4 mg·mL-1YHF可顯著增加TGF-β的含量(P<0.05)，減少I(mǎi)L-6、IL-12p70的含量(P<0.05)。以上結(jié)果表明,在LPS刺激CD4+T細(xì)胞的情況下,使用YHF進(jìn)行干預(yù)可以促進(jìn)抗炎因子IL-10、TGF-β的分泌,抑制炎性因子IL-6、IL-12p70的分泌。

注:與空白對(duì)照組(CD3/CD28)比較,*P<0.05;與LPS組比較,

3.5 YHF對(duì)CD4+ T細(xì)胞中Treg、Th17特征性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3和RORγt蛋白表達(dá)的影響

Western blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,0.1 μmol·L-1LPS作用CD4+T細(xì)胞12 h后,Treg轉(zhuǎn)錄因子Foxp3的表達(dá)減少,Th17轉(zhuǎn)錄因子RORγt增加(P<0.05)。與LPS組比較,2、4 mg·mL-1YHF均能增加Foxp3蛋白的表達(dá)(P<0.05),減少RORγt蛋白的表達(dá)(P<0.01,P<0.05),結(jié)果見(jiàn)圖5。

注:與空白對(duì)照組(CD3/CD28)比較,*P<0.05;與LPS組比較,

3.6 YHF通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路干預(yù)Treg和Th17相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)

Western blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組比較,0.1 μmol·L-1LPS能顯著增加JAK2和STAT3蛋白的表達(dá)(P<0.01)。與LPS組比較,1、2、4 mg·mL-1YHF能夠降低JAK2蛋白表達(dá)(P<0.05,P<0.01)和STAT3蛋白表達(dá)(P<0.05),結(jié)果見(jiàn)圖6。

注:與空白對(duì)照組(CD3/CD28)比較,**P<0.01;與LPS組比較,

AG490是一種酪氨酸激酶受體抑制劑,可作為JAK抑制劑特異性抑制STAT3的磷酸化和活性[10]。與LPS組比較,CD4+T細(xì)胞經(jīng)4 mg·mL-1YHF處理24 h后,p-JAK2、p-STAT3和RORγt蛋白的表達(dá)量均下降(P<0.05),Foxp3蛋白表達(dá)增加(P<0.05)。與LPS組比較,CD4+T細(xì)胞經(jīng)AG490處理24 h后,p-JAK2、p-STAT3和RORγt蛋白的表達(dá)量均下降(P<0.01，P<0.001),Foxp3蛋白表達(dá)增加(P<0.01)。與YHF組比較,YHF與JAK2特異性抑制劑AG490聯(lián)合使用可顯著降低p-JAK2、p-STAT3和RORγt蛋白表達(dá)(P<0.01),增加Foxp3蛋白表達(dá)(P<0.01)。見(jiàn)圖7。以上結(jié)果表明YHF可以下調(diào)p-JAK2、p-STAT3和RORγt蛋白的表達(dá),增加Foxp3蛋白表達(dá)。

注:與空白對(duì)照組(CD3/CD28)比較,*P<0.05,**P<0.01;與LPS組比較,#P<0.05,##P<0.01,###P<0.001;與YHF組比較,

3.7 YHF通過(guò)JAK/STAT信號(hào)通路干預(yù)CD4+ T細(xì)胞上清中Treg、Th17相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)

ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖8,與LPS組比較,4 mg·mL-1YHF促進(jìn)抗炎因子IL-10、TGF-β的分泌(P<0.05),抑制炎性因子IL-6、IL-12p70的分泌(P<0.05),這與JAK2特異性抑制劑AG490的作用趨勢(shì)一致。YHF與AG490聯(lián)合使用促進(jìn)抗炎因子IL-10、TGF-β的分泌(P<0.05，P<0.01),抑制炎性因子IL-6、IL-12p70的分泌(P<0.05)。

注:與空白對(duì)照組(CD3/CD28)比較,*P<0.05;與LPS組比較,

4 討論

在中醫(yī)理論中,AS屬“胸痹”“真心痛”等范疇,主要病機(jī)歸為虛-痰-瘀-毒[11]。針對(duì)AS陰虛、痰濕致體生瘀熱、毒邪的病理特點(diǎn),YHF以養(yǎng)陰、清熱、活血、解毒為治則組方,緩解AS進(jìn)程。近年來(lái)AS的免疫炎癥學(xué)說(shuō)認(rèn)為,在AS發(fā)展過(guò)程中,巨噬細(xì)胞[12]、樹(shù)突狀細(xì)胞[13]以及T細(xì)胞[14]存在數(shù)量和功能上的紊亂。Treg和Th17是調(diào)節(jié)免疫炎癥的關(guān)鍵T細(xì)胞亞群,Treg具有免疫抑制作用而Th17細(xì)胞可以促進(jìn)炎癥發(fā)展。因此調(diào)節(jié)Treg與Th17之間的平衡被認(rèn)為是調(diào)控AS免疫炎癥的關(guān)鍵[4,15]。

課題組前期研究已證實(shí),YHF能夠調(diào)節(jié)AS小鼠外周血Treg水平,改善體內(nèi)Treg/Th17平衡[16]。在本研究中,我們進(jìn)一步觀察到Y(jié)HF能夠抑制LPS刺激的CD4+T細(xì)胞增殖,并使Treg/Th17平衡向Treg方向偏移。此外,YHF對(duì)Treg/Th17特征性轉(zhuǎn)錄因子Foxp3/RORγt的表達(dá)也產(chǎn)生了相應(yīng)的調(diào)節(jié)作用。這些結(jié)果說(shuō)明調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡是YHF改善AS的機(jī)制之一。

JAK2/STAT3是JAK/STAT信號(hào)通路的重要成員,具有促進(jìn)炎癥的作用并在AS中發(fā)揮著重要作用[17-18]。在STAT中,STAT3蛋白是初始T細(xì)胞分化為T(mén)reg或炎癥性Th17細(xì)胞的重要決定因素,STAT3的磷酸化能夠促進(jìn)RORγt的合成[9]。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了CD4+T細(xì)胞JAK2、STAT3蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果顯示,YHF可以減少CD4+T細(xì)胞中JAK2、STAT3蛋白的表達(dá),與JAK2特異性抑制劑AG490[19]的聯(lián)用進(jìn)一步證實(shí)了YHF可以作用于CD4+T細(xì)胞中的JAK2。以上結(jié)果表明,YHF調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡的作用可能是通過(guò)JAK2/STAT3信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)HPLC檢測(cè)發(fā)現(xiàn)YHF水提液中存在8種有效成分,分別為羥基紅花黃色素A、虎杖苷、蘆丁、2,3,5,4'-四羥基二苯乙烯葡萄糖苷、白藜蘆醇、槲皮素、大黃素和姜黃素。據(jù)報(bào)道：羥基紅花黃色素A可通過(guò)Toll樣受體8(TLR8)信號(hào)調(diào)節(jié)卵巢癌CD4+T細(xì)胞極化和免疫細(xì)胞因子的表達(dá)[20]；虎杖苷可以降低ApoE-/-小鼠血清中炎性細(xì)胞因子和趨化因子的含量,對(duì)AS有一定的預(yù)防和緩解作用[21]；槲皮素可以通過(guò)下調(diào)高遷移率族蛋白1(HMGB1)和Toll樣受體4(TLR4)的蛋白和基因表達(dá),產(chǎn)生抗AS的作用[22]；大黃素能抑制JAK2/STAT3信號(hào)通路,延緩ApoE-/-小鼠AS斑塊的形成[23]；姜黃素能抑制TLR4的表達(dá)及其相關(guān)的炎癥反應(yīng),產(chǎn)生抗AS的作用[24]。前期研究發(fā)現(xiàn),白藜蘆醇可以抑制T細(xì)胞的活化并減輕高脂飲食伴隨LPS刺激誘發(fā)的AS[25]。因此,本研究中觀察到Y(jié)HF調(diào)節(jié)Treg/Th17平衡的作用與這些成分的抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用有密切關(guān)系。

綜上所述,本研究發(fā)現(xiàn)YHF可以有效抑制LPS誘導(dǎo)的小鼠CD4+T細(xì)胞增殖,抑制JAK2/STAT3信號(hào)分子的表達(dá),增加Foxp3的表達(dá)和減少RORγt的表達(dá),同時(shí)增加抗炎細(xì)胞因子IL-10和TGF-β的分泌,抑制促炎細(xì)胞因子IL-6和IL-12p70的分泌。YHF通過(guò)以上作用實(shí)現(xiàn)了對(duì)AS免疫炎癥的調(diào)控。