基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探索痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的分子機(jī)制

李蔣鳳,肖靜靜,何東初,

(1. 湖北中醫(yī)藥大學(xué),湖北 武漢 430060；2. 中國(guó)人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院，湖北 武漢 430070)

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種可導(dǎo)致進(jìn)行性關(guān)節(jié)破壞和血管、代謝、骨骼、心理領(lǐng)域等疾病共病的慢性炎癥性自身免疫性疾病[1]。其臨床特征多以手、手腕、腳和膝蓋的疼痛和腫脹為主(多發(fā)性關(guān)節(jié)炎)，可受累其他關(guān)節(jié)，也可能出現(xiàn)單性關(guān)節(jié)炎或少關(guān)節(jié)炎，發(fā)展后期引起慢性炎癥和不可逆的關(guān)節(jié)或其他器官損傷，表現(xiàn)為多個(gè)疾病亞群的臨床綜合征，如間質(zhì)性肺病、心包炎、胸腔積液或支氣管擴(kuò)張等[2]。RA的全球發(fā)病率約為0.5%～1%，關(guān)節(jié)損傷和殘疾的結(jié)果嚴(yán)重影響工作和生活，并且增加死亡率，對(duì)女性的影響尤為劇烈，通常是男性的2～3倍[3]。研究表明，免疫介導(dǎo)的基質(zhì)組織失調(diào)是慢性炎癥和關(guān)節(jié)破壞的病理基礎(chǔ)，RA前階段持續(xù)數(shù)月至數(shù)年，其特征是存在循環(huán)自身抗體、炎癥細(xì)胞因子和趨化因子的濃度及范圍升高、代謝改變，臨床發(fā)病階段主要病理變化為滑膜炎合并血管、代謝、骨骼等系統(tǒng)的紊亂[4]。近年，盡管小分子激酶抑制劑和生物制劑的開發(fā)大大改善了臨床結(jié)果，但仍不能達(dá)到免疫平衡和無藥物緩解的治愈目標(biāo)，且治療費(fèi)用昂貴，價(jià)格因地區(qū)和國(guó)家而異，每年從10 000美元到36 000美元不等[3，5]。因此，尋找更有效的具有調(diào)節(jié)免疫穩(wěn)態(tài)、減輕炎癥、緩解共病多重作用且價(jià)格低廉的藥物仍是廣大臨床患者的迫切需求。

中醫(yī)藥基于整體觀念以患者臨床癥狀與證候?yàn)榘悬c(diǎn)，具有彌補(bǔ)西藥靶點(diǎn)單一、藥效單一的特點(diǎn)，辨證組方論治常收效頗好。RA屬于中醫(yī)“痹癥”范疇，痹癥寧方為常用治療RA的經(jīng)驗(yàn)用方，歷時(shí)十余年，多次精簡(jiǎn)化裁，臨床使用安全且不良反應(yīng)少[6]。痹癥寧方以“痹癥”名方獨(dú)活寄生湯為基礎(chǔ)，祛風(fēng)除濕時(shí)著重于溫陽通絡(luò)、疏肝調(diào)脾腎，以附子、青風(fēng)藤、威靈仙為君藥，溫寒散風(fēng)、除濕通絡(luò)，以合《素問·痹癥論》“風(fēng)寒濕三氣雜至，合而為痹也”之言；臣以細(xì)辛、桂枝、獨(dú)活、徐長(zhǎng)卿、生薏苡仁，獨(dú)活善治伏風(fēng)，除下焦筋骨之風(fēng)寒濕邪，配伍細(xì)辛入少陰腎經(jīng)溫化陰經(jīng)，桂枝入太陽膀胱經(jīng)溫經(jīng)散寒、通利血脈，與細(xì)辛共治表里之寒濕，加用徐長(zhǎng)卿益氣入肝胃、生薏苡仁清熱健脾腎；佐以當(dāng)歸、赤芍、白芍、鹿角膠養(yǎng)血和血、疏肝強(qiáng)骨，且血肉有情之品尤善填精益髓健脾，配伍生地清熱涼血，除血虛、血瘀之熱，加入地龍、蜈蚣搜風(fēng)通絡(luò)；使以甘草調(diào)和諸藥。系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以藥物作用的網(wǎng)絡(luò)分析為途徑之一，將系統(tǒng)方法、計(jì)算方法和實(shí)驗(yàn)方法相結(jié)合來闡明藥物的分子機(jī)制的方法，可以較好地用于分析具有復(fù)雜性、多成分、多靶點(diǎn)的中草藥和中藥方劑[7]。本研究擬從網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)及分子對(duì)接的角度，探索痹癥寧方抗RA的分子機(jī)制，為其臨床應(yīng)用提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1痹癥寧方有效成分和作用靶點(diǎn)篩選 將痹癥寧方的主要藥物利用中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)檢索得到藥物有效成分，并按照口服生物利用度(OB)和類藥性(DL)兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù)對(duì)成分進(jìn)行篩選，篩選條件為OB≥30%并且DL≥0.18。其次，記錄篩選后有效成分的MOL編號(hào)并在平臺(tái)“Related Targets”項(xiàng)目下對(duì)每個(gè)成分分別進(jìn)行檢索得到藥物有效成分相應(yīng)的靶點(diǎn)基因名稱。最后，在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中將藥物有效成分相應(yīng)的靶點(diǎn)基因名稱轉(zhuǎn)換成gene symbol。佐藥中地龍、蜈蚣、鹿角膠、生地黃藥物則利用BATMAN-TCM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索進(jìn)行補(bǔ)充，篩選條件為score≥20，Adjusted P-value≤0.05，得到藥物的有效成分和靶點(diǎn)基因。

1.2痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)預(yù)測(cè) 利用GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)檢索“rheumatoid arthritis”，并將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索到與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)的基因合并去重作為疾病的相關(guān)靶點(diǎn)基因。將痹癥寧方有效成分的靶點(diǎn)基因與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因取交集，得到痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，利用Venn軟件繪制維恩圖交集圖。根據(jù)痹癥寧方有效藥效成分、藥效成分相對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)靶點(diǎn)基因，使用Cytoscape3.6.0 軟件建立“方藥配伍-有效成分-作用靶點(diǎn)-治療疾病”的映射圖。

1.3蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建 首先，將痹癥寧方有效成分抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因?qū)氲絊TRING數(shù)據(jù)庫(kù)，且將物種限定為人，繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，綜合評(píng)分(z-score)大于0.4的為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并輸出“TSV”格式的結(jié)果，然后在Cytoscape軟件中對(duì)結(jié)果進(jìn)行修飾美化。

1.4GO和KEGG功能富集分析 將痹癥寧方有效成分抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因，利用R軟件中的“org.Hs.eg.db”“clusterProfiler”“enrichplot”“ggplot2”等package在基因本體聯(lián)合會(huì)(GO)及京都基因和基因組百科全書(KEGG)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行功能和信號(hào)通路富集分析。最后，在R語言中將富集信息用圖形來展示，以校正后的P值小于0.05為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5關(guān)鍵基因的篩選及其生物學(xué)過程分析 將預(yù)測(cè)的痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的靶點(diǎn)導(dǎo)入到Cytoscape軟件中，利用Cytohubba插件中四種不同算法，分別為：degree，radiality，MCC(maximal clique centrality)和 EPC(edge percolated component)，篩選出關(guān)鍵基因。同時(shí)，在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)，物種設(shè)置為人，繪制蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)，綜合評(píng)分(z-score)大于0.4的為具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同1.4中利用R軟件進(jìn)行GO中生物學(xué)過程富集分析，以校正后的P值小于0.05為有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6分子對(duì)接驗(yàn)證 利用Autodock(4.2.6)軟件作為分子對(duì)接軟件，對(duì)有效成分小分子和靶標(biāo)蛋白質(zhì)進(jìn)行半柔性對(duì)接。選取關(guān)鍵基因中得分前5的基因所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)為靶標(biāo)蛋白質(zhì)，并在PDB數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)PDB格式。在PyMol(2.1.1)軟件中將靶點(diǎn)蛋白的自身配體、水分子、重復(fù)序列清除。在AutoDockTools(1.5.6)軟件對(duì)清理好靶點(diǎn)蛋白進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、添加蛋白質(zhì)類型，并保存為靶標(biāo)蛋白“pdbqt”格式文件。其次，找到相應(yīng)靶點(diǎn)的藥物有效成分，并在ZINC、Pubchem數(shù)據(jù)庫(kù)中下載其三維結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)“mol2”或“sdf”格式，并可用OpenBabel(2.4.1)軟件將“sdf”格式轉(zhuǎn)換成“mol2”格式。在AutoDockTools軟件中將每個(gè)成分進(jìn)行加氫、計(jì)算電荷、加Root后，保存為小分子“pdbqt”格式文件。分別用處理好的靶標(biāo)蛋白質(zhì)與有效成分小分子利用Autodock軟件進(jìn)行對(duì)接，使用OpenBabel軟件將PDBQT格式的對(duì)接文件轉(zhuǎn)化為PDB格式，最后利用Pymol軟件分析和觀察小分子與靶標(biāo)蛋白對(duì)接結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1痹癥寧方有效成分和作用靶點(diǎn)的篩選結(jié)果篩選后得到君藥附子、青風(fēng)藤、威靈仙有效成分?jǐn)?shù)各為：6個(gè)、4個(gè)、2個(gè)，靶點(diǎn)基因數(shù)各為：19個(gè)、51個(gè)、45個(gè)；臣藥細(xì)辛、桂枝、獨(dú)活、徐長(zhǎng)卿、薏苡仁有效成分?jǐn)?shù)各為7個(gè)、5個(gè)、5個(gè)、3個(gè)、3個(gè)，靶點(diǎn)基因數(shù)各為99個(gè)、44個(gè)、42個(gè)、13個(gè)、27個(gè)；佐藥當(dāng)歸、赤芍、白芍、生地、地龍、蜈蚣、鹿角膠有效成分?jǐn)?shù)各為：2個(gè)、10個(gè)、7個(gè)、4個(gè)、7個(gè)、5個(gè)、2個(gè)，靶點(diǎn)基因數(shù)各為45個(gè)、92個(gè)、83個(gè)、217個(gè)、305個(gè)、225個(gè)、13個(gè)；使藥甘草有效成分?jǐn)?shù)為18個(gè)，靶點(diǎn)基因數(shù)為134個(gè)。將君臣佐使藥物有效成分和靶點(diǎn)基因合并后去重，得到君藥有效成分?jǐn)?shù)為11個(gè)，靶點(diǎn)基因數(shù)為65個(gè)；臣藥有效成分?jǐn)?shù)為21個(gè)，靶點(diǎn)基因數(shù)為124個(gè)；佐藥有效成分?jǐn)?shù)為29個(gè)，靶點(diǎn)基因數(shù)為669個(gè)；使藥有效成分?jǐn)?shù)為18個(gè)，靶點(diǎn)基因數(shù)為131個(gè)。最后，將痹癥寧方所有藥物有效成分和靶點(diǎn)基因合并后去重，得到總有效成分?jǐn)?shù)69個(gè)，總靶點(diǎn)基因數(shù)727個(gè)，見表1。

表1 痹癥寧方有效成分與靶點(diǎn)基因的篩選 個(gè)

2.2預(yù)測(cè)痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病的靶點(diǎn)通過GeneCards、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病進(jìn)行檢索共得到340個(gè)與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎相關(guān)的基因。將痹癥寧方中君臣佐使藥物有效成分對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)基因與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病相關(guān)的靶點(diǎn)基因取交集，獲得56個(gè)痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病潛在的靶點(diǎn)，并利用Venn軟件實(shí)現(xiàn)可視化(見圖1)。將痹癥寧方君臣佐使4種藥物配伍、34個(gè)主要有效成分、56個(gè)潛在靶點(diǎn)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎疾病輸入到Cytoscape軟件，構(gòu)建“方藥配伍-有效成分-作用靶點(diǎn)-治療疾病”的網(wǎng)絡(luò)圖(見圖2)。

圖1 痹癥寧方配伍與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎共同靶點(diǎn)韋恩圖

圖2 痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎“方藥配伍-有效成分-作用靶點(diǎn)-治療疾病”的網(wǎng)絡(luò)圖

網(wǎng)絡(luò)圖的節(jié)點(diǎn)分別表示藥物配伍、有效成分、靶點(diǎn)基因、疾病，邊表示的是藥物配伍、有效成分、靶點(diǎn)基因、疾病之間的聯(lián)絡(luò)關(guān)系。在痹癥寧方抗RA的主要活性成分中，君藥2個(gè)，臣藥13個(gè)，佐藥17個(gè)，使藥7個(gè)，君臣佐藥物共有的活性成分為beta-sitosterol，臣佐使藥物共有的活性成分為kaempferol，臣佐藥物共有的活性成分為(+)-catechin。君臣佐使藥物與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎均共有的靶點(diǎn)基因?yàn)镻TGS2、PTGS1、JUN。

2.3蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)互作和功能富集分析結(jié)果 在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中設(shè)置minimum required interaction score為0.4，獲取average node degree為23.1并且由56個(gè)節(jié)點(diǎn)和648條邊所映射組成痹癥寧方抗RA的靶點(diǎn)基因相互作用圖(見圖3)。在R軟件中對(duì)痹癥寧方抗RA的作用靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，總共獲得1 507條記錄，其中生物學(xué)過程(BP)1 447條，主要涉及炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、活性氧代謝過程、細(xì)胞趨化作用、對(duì)脂多糖的反應(yīng)、白細(xì)胞趨化性、對(duì)細(xì)菌源分子的反應(yīng)、骨髓白細(xì)胞遷移、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等；細(xì)胞組分(CC)19條，主要關(guān)聯(lián)細(xì)胞膜與質(zhì)膜、胞質(zhì)囊腔、分泌顆粒內(nèi)腔等；分子功能(MF)41條，主要具有整合素結(jié)合、RNA聚合酶Ⅱ特異性DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、細(xì)胞因子活性、腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)受體結(jié)合、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、信號(hào)受體激活因子的活性、抗氧化活性等功能(見圖4)。KEGG富集通路共115條，選取前30條進(jìn)行可視化(見圖5)，其中與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路相關(guān)的基因有IL6、FOS、CXCL8、VEGFA、ITGB2、ITGAL、TGFB2、TNFSF11、IL1B、ICAM1、MMP1、JUN、TGFB1。由此可見中藥復(fù)方參與人體多個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程與通路，整體調(diào)節(jié)人體物質(zhì)代謝。

圖3 痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的GO富集圖

圖5 痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎靶點(diǎn)的KEGG富集圖

2.4關(guān)鍵基因的篩選結(jié)果與生物過程學(xué)分析 利用Cytohubba插件對(duì)痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的潛在靶點(diǎn)進(jìn)行關(guān)鍵基因分析，根據(jù)degree、radiality、MCC、EPC 4種算法分別取得分前10的基因，再取交集，得到7個(gè)關(guān)鍵基因，分別為IL6、IL1B、CXCL8、IL10、VEGFA、PTGS2、JUN,見表2。更進(jìn)一步對(duì)關(guān)鍵基因進(jìn)行生物學(xué)過程分析，發(fā)現(xiàn)主要涉及正向調(diào)節(jié)血管生成和發(fā)育、細(xì)胞及白細(xì)胞趨化性、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、對(duì)脂多糖及細(xì)菌源分子的反應(yīng)等過程，見圖6。

圖6 痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎關(guān)鍵基因的生物學(xué)過程圖

表2 關(guān)鍵基因的篩選

2.5分子對(duì)接驗(yàn)證分析 選取前5個(gè)關(guān)鍵基因所對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)為靶標(biāo)蛋白質(zhì)，與藥物有效成分進(jìn)行分子對(duì)接，進(jìn)一步驗(yàn)證藥物作用的分子機(jī)制。藥物的主要作用成分有paeoniflorin、Guanidine、ellagic acid、Tyrosin、sesamin、Xanthinin，靶標(biāo)基因主要為IL6、IL1B、VEGFA、CXCL8、IL10。痹癥寧方的主要有效成分的結(jié)合能均小于0(見表3)，說明其能與靶點(diǎn)產(chǎn)生自發(fā)性結(jié)合。利用PyMol繪制藥物主要有效成分與靶點(diǎn)蛋白質(zhì)對(duì)接模式圖，以結(jié)合距離最短為最優(yōu)結(jié)合方式(見圖7)。paeoniflorin-IL6的結(jié)合位點(diǎn)為ARG-113氨基酸殘基，Guanidine-IL1B的結(jié)合位點(diǎn)為GLU-51氨基酸殘基，Tyrosin-CXCL8的結(jié)合位點(diǎn)為L(zhǎng)YS-42氨基酸殘基，ellagic acid-CXCL8的結(jié)合位點(diǎn)為L(zhǎng)YS-11氨基酸殘基，sesamin-IL10的結(jié)合位點(diǎn)為PHE-111氨基酸殘基，Xanthinin-IL10的結(jié)合位點(diǎn)為GLY-58氨基酸殘基，ellagic acid-VEGFA的結(jié)合位點(diǎn)為GLU-67氨基酸殘基。從總體上進(jìn)行推測(cè)，分子對(duì)接顯示痹癥寧方的主要有效成分與核心靶點(diǎn)有較好的結(jié)合活性。

注：(a)表示paeoniflorin與IL6的結(jié)合位點(diǎn)為ARG-113氨基酸殘基;(b)表示Guanidine與IL1B的結(jié)合位點(diǎn)為GLU-51氨基酸殘基;(c)表示Tyrosin與CXCL8的結(jié)合位點(diǎn)為L(zhǎng)YS-42氨基酸殘基;(d)表示ellagic acid與CXCL8的結(jié)合位點(diǎn)為L(zhǎng)YS-11氨基酸殘基;(e)表示sesamin與IL10的結(jié)合位點(diǎn)為PHE-111氨基酸殘基;(f)表示Xanthinin與IL10的結(jié)合位點(diǎn)為GLY-58氨基酸殘基;(g)表示ellagic acid-VEGFA的結(jié)合位點(diǎn)為GLU-67氨基酸殘基

表3 分子對(duì)接結(jié)合能的結(jié)果

3 討 論

近年來根據(jù)基因多態(tài)性及其易感性，從基因靶點(diǎn)新角度挖掘調(diào)節(jié)RA中先天免疫與后天免疫的疾病修飾療法的研究越來越多[8]。RA以免疫介導(dǎo)的慢性炎癥為基礎(chǔ)，抗炎藥物(非甾體類抗炎藥、緩解病情抗風(fēng)濕藥、糖皮質(zhì)激素)雖然能夠緩解或者抑制炎癥，但停藥后仍易復(fù)發(fā)且不良反應(yīng)多，不能從根本上調(diào)節(jié)內(nèi)免疫穩(wěn)態(tài)環(huán)境和平衡炎癥反應(yīng)。在前期研究中，已經(jīng)證實(shí)了痹癥寧方可阻抑滑膜組織中MMP-9、MMP-3的表達(dá)，并使血清炎癥因子ESR、CRP減少，緩解關(guān)節(jié)炎指數(shù)評(píng)分，具有抗炎消腫、調(diào)節(jié)免疫的作用[9]。現(xiàn)基于系統(tǒng)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接技術(shù)，擬從基因?qū)用孢M(jìn)一步揭示痹癥寧方抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的作用機(jī)制及其靶點(diǎn)。

痹癥寧方抗RA的主要有效成分有β-谷固醇(beta-sitosterol)、山柰酚(kaempferol)、(+)兒茶素[(+)-catechin]等；潛在靶點(diǎn)有IL6、MMP2、FOS、CXCL8等。目前，已有研究證實(shí)β-谷固醇、山柰酚、兒茶素具有抗炎作用，抑制RA-FLS異常增殖和侵襲[10-12]。其中，56個(gè)潛在靶點(diǎn)的GO富集結(jié)果表明主要參與對(duì)細(xì)菌源分子及脂多糖的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)、細(xì)胞趨化作用、白細(xì)胞趨化性、骨髓白細(xì)胞遷移、活性氧代謝過程、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)節(jié)、細(xì)胞對(duì)化學(xué)應(yīng)激的反應(yīng)等生物學(xué)過程，具有的分子功能主要與細(xì)胞因子如TNF、生長(zhǎng)因子受體結(jié)合、抗氧化活性等功能相關(guān)。RA除了伴隨著由細(xì)胞因子和交叉反應(yīng)(自身)抗原介導(dǎo)的長(zhǎng)期炎癥，也存在一種(休眠)微生物組，它可以釋放強(qiáng)效炎癥原脂多糖，從而激活細(xì)胞因子如IL-6、TNF-α催化炎癥發(fā)生以及促進(jìn)細(xì)胞毒性β-淀粉樣蛋白的形成[13]。在RA持續(xù)炎癥中，促炎細(xì)胞因子如TNF和IL-1β等細(xì)胞因子激活成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞，誘導(dǎo)生產(chǎn)如炎性分子和基質(zhì)降解酶，增強(qiáng)白細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的活躍性，進(jìn)一步侵襲和破壞周圍組織[14]。雖然RA以慢性全身性炎癥為主，但長(zhǎng)期激活狀態(tài)下免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞對(duì)生物能量和生物合成的需求也在增加，滑膜細(xì)胞代謝的改變和局部缺氧、缺乏營(yíng)養(yǎng)的微環(huán)境在RA關(guān)節(jié)的病理表現(xiàn)中尤為突出，其中代謝變化是由響應(yīng)營(yíng)養(yǎng)、能量和氧水平以及生長(zhǎng)因子、模式識(shí)別和細(xì)胞因子受體的信號(hào)通路協(xié)調(diào)的[15]。表觀基因組上相似的區(qū)域存在于RA細(xì)胞中，與活性增強(qiáng)子和啟動(dòng)子以及特定的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合基序有關(guān)，當(dāng)重塑表觀基因組或改變?cè)鰪?qiáng)子活性時(shí)，可以調(diào)節(jié)侵掠性RA成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞行為[16]。當(dāng)DNA修復(fù)機(jī)制的表觀調(diào)節(jié)功能異常，氧化應(yīng)激誘導(dǎo)內(nèi)源性DNA損傷的積累，可能觸發(fā)細(xì)胞凋亡，引起自身抗體、受損細(xì)胞溶膠DNA和微核的產(chǎn)生，導(dǎo)致全身免疫性疾病表達(dá)[17]。據(jù)此，痹癥寧方可以從細(xì)菌源頭(血液微生物環(huán)境)、炎癥反應(yīng)(促炎因子和免疫系統(tǒng))、局部缺氧及代謝改變(氧糖代謝)、表觀遺傳、應(yīng)激過程等多個(gè)方面發(fā)揮抗RA的作用。

痹癥寧方的KEGG通路除了富集在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎通路上，與脂質(zhì)代謝、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終末產(chǎn)物-受體(AGE-RAGE)信號(hào)通路、非酒精性脂肪肝、乙型肝炎、炎癥性腸病、致病性大腸桿菌感染、Th17細(xì)胞分化、TNF、IL-17、NF-κB信號(hào)通路、EB病毒、皰疹病毒感染等通路密切相關(guān)。其中，脂質(zhì)代謝和動(dòng)脈粥樣硬化、AGE-RAGE及TNF信號(hào)通路上聚集基因最多。不平衡的脂質(zhì)代謝在自身免疫反應(yīng)中具有致病作用，不僅是動(dòng)脈粥樣硬化形成的基礎(chǔ)，更是RA的危險(xiǎn)因素[18]。AGEs的積累和RAGE的激活誘導(dǎo)了血管組織中持續(xù)的氧化應(yīng)激，抑制AGE/RAGE信號(hào)通路可以減輕血管內(nèi)皮的氧化應(yīng)激從而保護(hù)血管[19]。有研究表明RA中心血管合并癥、2型糖尿病、高血脂癥、腸道菌群失調(diào)及細(xì)菌易位等共病與RA疾病活動(dòng)具有相關(guān)性，且某些共病與RA有因果關(guān)系[13]。TNF-α可以激活RA-FLSs的自噬及NF-κB信號(hào)通路，當(dāng)自噬被阻斷時(shí)，F(xiàn)LSs的自噬水平明顯降低，TNF-α誘導(dǎo)的增殖/凋亡失衡被逆轉(zhuǎn)[20]。TNF-α可刺激致病性Th17細(xì)胞的分化并產(chǎn)生IL17、GM-CSF，擴(kuò)大炎癥反應(yīng)，但TNF-α和IL-17/Th17通路在RA發(fā)病機(jī)制中并不完全融合，IL-17/Th17通路仍為RA的非冗余治療目標(biāo)[21]。因此，痹癥寧方能摒棄西藥治療疾病單一或加重某些共病的缺點(diǎn)，對(duì)于RA合并脂質(zhì)代謝紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管并發(fā)癥、乙型肝炎、非酒精性脂肪肝、炎癥性腸病等共病的治療具有天然優(yōu)勢(shì)。

痹癥寧方抗RA的關(guān)鍵基因分別為IL6、IL1B、CXCL8、IL10、VEGFA、PTGS2、JUN，主要參與的生物學(xué)過程有正向調(diào)節(jié)血管生成和發(fā)育、細(xì)胞及白細(xì)胞趨化性、神經(jīng)炎癥反應(yīng)、平滑肌細(xì)胞增殖的正調(diào)控、對(duì)脂多糖及細(xì)菌源分子的反應(yīng)等，并且經(jīng)過分子對(duì)接技術(shù)考證，提示痹癥寧方與關(guān)鍵基因有較好的聚合活性。IL6在RA中先天免疫和適應(yīng)性免疫都至關(guān)重要，IL6產(chǎn)生失調(diào)導(dǎo)致持續(xù)性炎癥，且抗IL6藥物是RA較好的候選藥物[22]。IL1B的遺傳變異與RA易感性相關(guān)，ACPA陽性RA患者中IL1B水平升高，ACPAs可以促進(jìn)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL1B[23-24]。已有研究證實(shí)RA滑膜液中IL-6、IL-8、IL-10和MCP-1濃度較高，可能通過細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用和IL-17信號(hào)通路介導(dǎo)RA中性粒細(xì)胞自噬[25]。VEGFA是新生血管形成的啟動(dòng)因子，新生血管在RA發(fā)病機(jī)制中促進(jìn)炎癥細(xì)胞的入侵和局部疼痛受體的增加，從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)損傷和疼痛[26]。RA滑膜成纖維細(xì)胞介導(dǎo)PTGS2信號(hào)上調(diào)單核細(xì)胞中TREM-1的表達(dá)，增加單核細(xì)胞的炎癥反應(yīng)微環(huán)境[27]。JUN可直接激活促炎因子環(huán)氧合酶-2，間接抑制抗炎因子精氨酸酶-1，調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞的活化狀態(tài)，促進(jìn)關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[28]。血管的生成和增殖不僅為滑膜的生長(zhǎng)提供了更多的營(yíng)養(yǎng)，而且為細(xì)胞因子和炎癥細(xì)胞提供了擴(kuò)散通道，阻斷血管生成可以抑制滑膜炎癥和血管翳的形成[29]。神經(jīng)炎癥顯著促進(jìn)從急性疼痛到慢性疼痛的過渡以及神經(jīng)病變疼痛的永久化，主要病理為血管通透性改變、白細(xì)胞聚集及釋放炎癥介質(zhì)、激活中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)及星形膠質(zhì)細(xì)胞，加重炎癥性疼痛及慢性疼痛的中樞敏感化，RA的持續(xù)性慢性關(guān)節(jié)痛與此密切相關(guān)[30-31]?？傊?，痹癥寧方的主要作用靶點(diǎn)有IL6、IL1B、CXCL8、IL10、VEGFA、PTGS2、JUN，參與血管的生長(zhǎng)發(fā)育、炎癥的觸發(fā)、形成及神經(jīng)炎癥等生物學(xué)過程，著重于延緩關(guān)節(jié)局部結(jié)構(gòu)損傷和慢性疼痛。

綜上所述，痹癥寧方可能通過調(diào)節(jié)血液微生物環(huán)境、炎癥反應(yīng)、局部氧供及代謝、表觀遺傳、應(yīng)激過程等多個(gè)方面發(fā)揮抗RA的作用；主要候選靶點(diǎn)有IL6、IL1B、CXCL8、IL10、VEGFA、PTGS2、JUN，著重于延緩關(guān)節(jié)局部結(jié)構(gòu)損傷和慢性疼痛；并對(duì)于脂質(zhì)代謝紊亂、動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病血管并發(fā)癥、炎癥性腸病等共病的治療有優(yōu)勢(shì)。本研究拓展了痹癥寧方新的作用機(jī)制，但也需要進(jìn)一步基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，可以為后續(xù)的課題研究提供新的方向和思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。