祛瘀解毒方調(diào)節(jié)炎癥微環(huán)境抗結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用及機(jī)制研究

趙紅偉，肖 茜，孫玲玲，吳健彬，林麗珠

(1． 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 510405；2． 廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，廣東 廣州 510405；3． 深圳市中醫(yī)院，廣東 深圳 518033；4. 江門市五邑中醫(yī)院，廣東 江門 529000)

結(jié)直腸癌是世界上最常見的惡性腫瘤之一，在所有惡性腫瘤中其發(fā)病率位居第三，病死率位居第二[1]。肝臟是結(jié)直腸癌血行轉(zhuǎn)移最常見的解剖部位，據(jù)統(tǒng)計超過50%的結(jié)直腸癌患者會發(fā)生肝轉(zhuǎn)移，結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者最常見的死亡原因[2]。炎癥是惡性腫瘤的一個標(biāo)志，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[3-4]。既往研究顯示，結(jié)直腸癌患者的中醫(yī)證型與炎癥因子表達(dá)具有相關(guān)性，其中瘀毒內(nèi)阻證結(jié)直腸癌患者的炎癥因子水平更高[5]。在中醫(yī)理論中，“瘀”和“毒”被認(rèn)為是兩種關(guān)鍵的致病因素?！墩f文解字》中說：“瘀，積血也?！倍居袃?nèi)毒和外毒之分，外毒為有形之毒，內(nèi)毒為臟腑功能失調(diào)產(chǎn)生的病理產(chǎn)物，惡性腫瘤的毒被歸屬為內(nèi)毒。祛瘀解毒方是林麗珠教授根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)總結(jié)的經(jīng)驗(yàn)方，廣泛用于瘀毒內(nèi)阻證結(jié)直腸癌患者的治療，有助于改善中晚期結(jié)直腸癌患者的生活質(zhì)量，提高患者的生存率，延長生存時間[6-9]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究以腫瘤炎癥微環(huán)境為切入點(diǎn)，通過動物實(shí)驗(yàn)探討了祛瘀解毒方對結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用及其可能機(jī)制。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1動物 雌性BALB/c小鼠20只，SPF級，6～8周齡，體重17～20 g，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證：SCXK(京)2016-0006。所有動物飼養(yǎng)于廣東藥科大學(xué)SPF 級實(shí)驗(yàn)動物中心。本實(shí)驗(yàn)已通過廣東藥科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會審查(gdpulacSPF2017265)。

1.2細(xì)胞 采用BALB/c小鼠同源的、熒光素酶標(biāo)記的小鼠結(jié)腸癌細(xì)胞CT26.WT-luc，購于南京科佰生物科技有限公司(ADCC細(xì)胞源)。于37 ℃下5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3藥物 祛瘀解毒方由桃仁12 g、苦參12 g、土茯苓24 g、地榆15 g、槐花15 g、薏苡仁30 g、蒲公英30 g、土鱉蟲6 g組成，藥材均購于廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院。所有藥材混勻后加水浸泡30 min，武火煮沸后改為文火，微沸慢煎40 min，過濾后收集一煎藥液，同法二煎30 min，2次藥液混合即為祛瘀解毒方湯劑。紗網(wǎng)過濾后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓旋蒸(65 ℃，45～50 r/min)，得到祛瘀解毒方浸膏。將浸膏置于-20 ℃冷凍過夜，用真空冷凍干燥機(jī)凍干[生藥：凍干粉=9.756，小鼠等效劑量為2.22 mg/(g·d)]，-20 ℃密封保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4主要試劑與儀器 Beetle Luciferin(Potassium Salt)(E1605)購于Promega。白細(xì)胞介素-1β(IL-1β，MEA563Mu)、白細(xì)胞介素-10(IL-10，MEA056Mu)、白細(xì)胞介素-6(IL-6，MEA079Mu)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α，MEA133Mu)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β，MEA124Mu)、CXC型趨化因子配體2(CXCL2，MEA603Mu)、CC型趨化因子配體2[CCL2，即單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1),MEA087Mu]、CC型趨化因子配體3樣蛋白1[CCL3L1, 即巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)， MEA092Mu]ELISA檢測試劑盒購于武漢優(yōu)爾生科技有限公司；Anti-E-鈣黏蛋白(E-cadherin)抗體(GB11082)、Anti-波形蛋白(Vimentin)抗體(GB11192)購于武漢賽維爾生物技術(shù)有限公司；Anti-細(xì)胞增殖標(biāo)志物(Ki67)抗體(ab16667)、重組Anti-趨化因子C-C-基元受體2(CCR2)抗體(ab273050)購于Abcam。冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司，SCIENTZ-10N)；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(ThermoFisher，4111FO)；全自動細(xì)胞計數(shù)儀(NEXCELOM，MINI-004-0205)；小動物活體成像儀(PERKINELMER，PerkinElmer IVIS Spectrum)；組織勻漿儀(MP Biomedicals Co. Ltd.， FastPrep-24)；酶標(biāo)儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司， Multiskan Mk3型)；倒置顯微鏡(OLYMPUS，IX73)。

1.5實(shí)驗(yàn)方法 將20只BALB/c小鼠按體重隨機(jī)分成模型組、祛瘀解毒方低劑量組、祛瘀解毒方中劑量組、祛瘀解毒方高劑量組，每組5只。4組小鼠均建立結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移模型：術(shù)前禁食12 h,用2%阿佛丁(每10 g體重給藥170 μL)腹腔注射麻醉，術(shù)野皮膚脫毛。固定小鼠呈右側(cè)臥位，依次用碘酒和75% 酒精各消毒術(shù)野1次，采用左上腹斜切口，長度約1.0 cm，逐層開腹，用組織鑷將脾臟從腹腔中輕輕牽出少許，必要時可輕輕牽拉脾臟周圍脂肪，以便更好地暴露脾臟。用胰島素注射器從小鼠脾臟上極進(jìn)針約3 mm，進(jìn)針方向與脾臟長軸平行，將CT26.WT-luc細(xì)胞懸液緩慢注入小鼠脾臟，每只小鼠注射細(xì)胞懸液5×105/50 μL，可見脾臟包膜腫脹、變白，注射時間2～3 min。輕輕拔出針頭，用75%酒精棉簽按壓針眼處2 min以壓迫止血及避免癌細(xì)胞外滲造成腹腔內(nèi)種植轉(zhuǎn)移。確認(rèn)進(jìn)針處無出血，將脾臟輕輕送回原位，隨后全層縫合腹壁。手術(shù)過程嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作原則。術(shù)后第3天開始，祛瘀解毒方低、中、高劑量組小鼠分別給予2.22 mg/(g·d)、4.44 mg/(g·d)、8.88 mg/(g·d)的祛瘀解毒方灌胃，模型組小鼠給予等體積的生理鹽水灌胃，均1次/d，給藥體積均為10 μL/g，連續(xù)灌胃14 d。

1.6檢測指標(biāo)及方法

1.6.1肝轉(zhuǎn)移瘤形成情況 術(shù)后第17天，各組小鼠按照10 μL/g(即10 g的小鼠，注射100 μL 1.5 mg的熒光素底物)的劑量腹腔注射15 mg/mL Beetle Luciferin(Potassium Salt)工作液，約5 min后異氟烷氣體吸入麻醉，約10 min小鼠麻醉完成，行小鼠活體成像，計算肝區(qū)熒光光子通量，評估結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移情況。次日同法注射底物及麻醉后處死小鼠，取出小鼠肝臟，置于6孔板中，成像儀檢測肝臟的熒光光子通量，進(jìn)一步明確肝臟轉(zhuǎn)移瘤的形成情況。

1.6.2肝組織病理觀察 取各組小鼠部分肝組織，用10%中性福爾馬林固定液固定后行石蠟包埋，切片機(jī)切成厚4 μm的薄層，行常規(guī)HE染色，脫水封片，鏡下觀察肝組織的病理形態(tài)。

1.6.3肝轉(zhuǎn)移瘤組織中相關(guān)蛋白表達(dá)情況 取各組小鼠液氮凍存肝轉(zhuǎn)移瘤組織，免疫組織化學(xué)法檢測組織中Ki67、E-cadherin、Vimentin、CCR2蛋白表達(dá)情況。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析圖片的累積光密度值(IOD)以及組織的像素面積(Area)，計算面密度(面密度=IOD/Area)。

1.6.4肝轉(zhuǎn)移瘤組織中相關(guān)炎癥因子及趨化因子含量 采用酶聯(lián)免疫法檢測各組小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤組織中炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α、TGF-β、IL-10及趨化因子CXCL2、CCL2、CCL3L1的含量，所有操作嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。采用Sigma Plot 12.0軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算待測樣品的濃度值。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移情況 活體成像顯示，祛瘀解毒方各組小鼠的肝區(qū)熒光光子通量均較模型組低，其中祛瘀解毒方低劑量組與模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。肝臟體外成像顯示，祛瘀解毒方各組小鼠肝臟的熒光光子通量均明顯低于模型組(P均<0.05)，見圖2。

圖1 術(shù)后第17天各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠活體成像生物發(fā)光情況及肝臟熒光光子通量

圖2 術(shù)后第18天各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠體外肝臟熒光光子通量

2.2各組小鼠肝臟HE染色情況 術(shù)后第18天，各組小鼠肝臟中均可觀察到轉(zhuǎn)移瘤的形成。見圖3。

圖3 術(shù)后第18天各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝臟HE染色表現(xiàn)(×100)

2.3各組肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中Ki67表達(dá)情況 祛瘀解毒方低、高劑量組肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中Ki67表達(dá)面密度明顯低于模型組(P均<0.05)，祛瘀解毒方中劑量組也呈降低趨勢，但與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 術(shù)后第18天各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中Ki67表達(dá)情況(×400)

2.4各組肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中E-cadherin表達(dá)情況祛瘀解毒方中、高劑量組肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中E-cadherin面密度均明顯高于模型組(P均<0.05)。見圖5。

圖5 術(shù)后第18天各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中E-cadherin表達(dá)情況(×400)

2.5各組肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中Vimentin表達(dá)情況各組小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中Vimentin表達(dá)面密度比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖6。

圖6 術(shù)后第18天各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中Vimentin表達(dá)情況(×400)

2.6各組肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中CCR2表達(dá)情況 祛瘀解毒方各組小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中CCR2表達(dá)面密度均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖7。

圖7 術(shù)后第18天各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中CCR2表達(dá)情況(×400)

2.7各組肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中炎癥因子表達(dá)情況祛瘀解毒方低劑量組IL-6含量、祛瘀解毒方中劑量組TNF-α和IL-10含量、祛瘀解毒方高劑量組IL-10含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，各組IL-1β、TGF-β含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖8。

圖8 術(shù)后第18天各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中各炎癥因子含量

2.8各組肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中趨化因子表達(dá)情況祛瘀解毒方各組CXCL2含量、祛瘀解毒方中劑量組和高劑量組CCL2含量均明顯低于模型組(P均<0.05)，各組間CCL3L1含量比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見圖9。

圖9 術(shù)后第18天各組結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤組織中各趨化因子含量

3 討 論

結(jié)直腸癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，防治結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌診療過程中最具挑戰(zhàn)性的任務(wù)之一。炎癥在多個層面上影響腫瘤的侵襲、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和細(xì)胞遷移等[10]。細(xì)胞核Ki67蛋白反映了細(xì)胞的增殖狀態(tài)，其在腫瘤細(xì)胞中常高度過表達(dá)，是廣泛運(yùn)用的腫瘤增殖預(yù)后指標(biāo)之一[11-12]。本實(shí)驗(yàn)證實(shí)祛瘀解毒方具有抑制結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用，并且顯著降低了腫瘤細(xì)胞的增殖能力。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化是指上皮細(xì)胞獲得間質(zhì)特征的過程，與腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化通常由上皮標(biāo)志物E-cadherin的丟失和間質(zhì)標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)增加來標(biāo)識。E-cadherin是上皮細(xì)胞中的特異性蛋白，可介導(dǎo)鈣依賴性同型細(xì)胞之間的黏附，具有維持組織結(jié)構(gòu)完整性的作用，其低表達(dá)提示腫瘤具有更強(qiáng)的轉(zhuǎn)移傾向。在結(jié)直腸癌細(xì)胞中,由于p53基因變異導(dǎo)致E-cadherin表達(dá)下調(diào)，使腫瘤細(xì)胞更易發(fā)生局部浸潤和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[13]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，祛瘀解毒方可以上調(diào)小鼠肝臟轉(zhuǎn)移瘤中E-cadherin蛋白的表達(dá)，調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。

腫瘤轉(zhuǎn)移是由諸多復(fù)雜因素相互作用引起的，受異常表達(dá)的細(xì)胞因子、生長因子和異常激活的癌基因的調(diào)節(jié)[14-15]。當(dāng)荷瘤小鼠的腫瘤免疫功能發(fā)生紊亂時，促炎細(xì)胞因子IL-6分泌增加，進(jìn)而促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移定植[16]。TGF-β參與正常組織細(xì)胞增殖、分化、免疫調(diào)節(jié)、凋亡和維持體內(nèi)平衡等多種過程，在腫瘤形成的晚期階段，TGF-β對惡性腫瘤和間質(zhì)細(xì)胞具有促進(jìn)作用，表現(xiàn)為促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，祛瘀解毒方各組轉(zhuǎn)移瘤中IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β含量均有不同程度降低，表明祛瘀解毒方的抑瘤作用與調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中炎癥因子水平有關(guān)。

近年來，越來越多的證據(jù)支持趨化因子及其受體在癌癥中的重要作用，通過調(diào)節(jié)腫瘤組織中趨化因子的表達(dá)，可影響腫瘤免疫逃逸和腫瘤轉(zhuǎn)移[17-18]。CXCL2又叫生長調(diào)節(jié)致癌基因β(GROβ)，其是一種原癌基因編碼蛋白，來源于單核細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞，CXCL2是CXCR2的配體，具有趨化中性粒細(xì)胞、初始T淋巴細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的作用。最近研究表明，中性粒細(xì)胞和髓源性抑制細(xì)胞可通過CXCL/CXCR2信號促進(jìn)腫瘤的進(jìn)展[19]。CXCL2和巨噬細(xì)胞遷移抑制因子(MIF)通常在腫瘤微環(huán)境中過度表達(dá)，并與腫瘤浸潤白細(xì)胞的募集相關(guān)[20]。在膀胱癌中，腫瘤細(xì)胞通過CXCL2/MIF-CXCR2信號通路，誘導(dǎo)骨髓來源的抑制性細(xì)胞聚集到腫瘤微環(huán)境中，引起免疫抑制，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)展，并且CXCL2的表達(dá)量越高，疾病分期和患者預(yù)后越差[21]。CCL2主要由內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、髓樣細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和成纖維細(xì)胞分泌，是CCR2的配體，其對單核細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞具有很強(qiáng)的趨化作用，與腫瘤的病情和預(yù)后密切相關(guān)。有文獻(xiàn)報道，腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(CAFs)和組織中常駐成纖維細(xì)胞可以通過炎癥激活I(lǐng)L-6及CCL2，形成促進(jìn)結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的微環(huán)境[22]。CCL3L1又叫巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)，來源于單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、肥大細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，是CCR1、CCR3和CCR5的配體，對單核細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞具有趨化作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，祛瘀解毒方各組小鼠肝轉(zhuǎn)移瘤中CXCL2、CCL2含量及CCR2表達(dá)面密度均低于模型組，提示祛瘀解毒方可以干擾趨化因子及其受體的表達(dá)。

綜上所述，本研究通過小鼠活體成像、體外成像及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、炎癥微環(huán)境角度初步證實(shí)了祛瘀解毒方具有抑制小鼠結(jié)直腸癌肝轉(zhuǎn)移的作用，機(jī)制與降低肝轉(zhuǎn)移瘤中炎癥因子IL-6、TNF-α、IL-10和趨化因子CXCL2、CCL2的含量，下調(diào)趨化因子受體CCR2的表達(dá)有關(guān)，為后續(xù)進(jìn)一步研究祛瘀解毒方的作用機(jī)制提供了思路。但本實(shí)驗(yàn)中尚未觀察到祛瘀解毒方明顯的劑量梯度效應(yīng)，其抗肝轉(zhuǎn)移的最優(yōu)劑量仍有待進(jìn)一步研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。