小青龍湯對過敏性鼻炎大鼠Th1/Th2細胞因子失衡及SP、Annexin1、VCAM-1表達的影響

王金鳳，王 楓，趙桂芝，于興娟，祝建材

(山東中醫(yī)藥高等?？茖W校，山東 煙臺 264199)

過敏性鼻炎又稱變應(yīng)性鼻炎，是特應(yīng)性機體接觸變應(yīng)原后產(chǎn)生的由免疫球蛋白E(IgE)介導(dǎo)的I型超敏反應(yīng)，多種炎細胞浸潤是其主要病理特征[1-2]?，F(xiàn)代醫(yī)學多采用抗組胺藥、糖皮質(zhì)激素等對癥處理，短期療效好，但不良反應(yīng)大，易復(fù)發(fā)，嚴重影響人們的生活質(zhì)量。中醫(yī)學認為過敏性鼻炎屬“鼻鼽”“鼻嚏”范疇，其是一種以突然和反復(fù)發(fā)作的鼻癢、噴嚏、流清涕為主要特征的鼻病，主要因臟腑功能虛損在先，繼而感受風寒而引發(fā)，是正虛與邪侵共同作用的結(jié)果，目前公認的證型有肺氣虛寒證、脾氣虛弱證、腎陽不足證和肺經(jīng)伏熱證4種，其中肺氣虛寒證所占比例最高[3-4]。小青龍湯是治療鼻鼽肺氣虛寒型的基本方[5]，既往對于其作用機制的研究主要集中在平衡Th1/Th2、抑制樹突狀細胞的活化和成熟，進而調(diào)節(jié)免疫功能方面，對其抗炎機制研究較少[6-7]。本實驗通過觀察小青龍湯對過敏性鼻炎大鼠炎癥介質(zhì)P物質(zhì)(SP)、膜聯(lián)蛋白1(Annexin1)、血管細胞黏附分子-1(VCAM-1)的影響，進一步探討了小青龍湯治療過敏性鼻炎的作用機制，旨在為其臨床應(yīng)用提供更多理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雌性SD大鼠48只，5～6周齡，體重160～180 g，由濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，合格證編號：370726211100170223，許可證號：SCXK(魯)20190003。所有動物均在山東中醫(yī)藥高等?？茖W校醫(yī)學實驗中心動物觀察室內(nèi)飼養(yǎng)、造模、取材，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，環(huán)境溫度18～20 ℃，相對濕度60%～70%，光照時間固定，24 h晝夜循環(huán)光照，所有動物自由飲水飲食。本實驗方案符合山東中醫(yī)藥高等?？茖W校動物實驗倫理規(guī)定。

1.2儀器與設(shè)備 KD-BM Ⅲ型電腦生物組織包埋機、KD-BL Ⅲ型包埋機冷凍臺、KD-2258輪轉(zhuǎn)式切片機、KD-TH Ⅰ型電腦生物組織攤烤烘片機(浙江省金華市科迪儀器設(shè)備有限公司)；DP-72光學顯微鏡(日本Olympus公司)；MK3酶標儀(賽默飛世爾上海儀器有限公司)。

1.3藥物與試劑 小青龍湯(由麻黃9 g、芍藥9 g、細辛3 g、干姜6 g、炙甘草6 g、桂枝9 g、半夏9 g、五味子6 g組成)飲片購自山東中醫(yī)藥高等?？茖W校附屬醫(yī)院中藥房，經(jīng)鑒定均為真品，飲片加入蒸餾水500 mL浸泡1 h，煮沸30 min，濾過，藥渣加入蒸餾水300 mL，繼續(xù)煎煮，煮沸20 min，兩液混合后用紗布過濾，水浴濃縮至60 mL，即為小青龍湯水煎劑，生藥含量為1 g/mL；蒼耳子鼻炎膠囊(四川森科制藥股份有限公司，國藥準字Z20064301，規(guī)格：0.4 g/粒，批號：201105)；卵白蛋白、氫氧化鋁粉(美國Sigma公司，批號：SLCH2414，MKCM1237)；大鼠白細胞介素-4(IL-4)、干擾素-γ(IFN-γ) ELISA試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號：1281728416，961743416)；大鼠IgE ELISA試劑盒(Solarbio，批號：20210416)；兔抗大鼠VCAM-1單克隆抗體、兔抗大鼠Annexin1多克隆抗體(武漢博士德生物工程有限公司，批號：17274289，9L117)；兔抗大鼠SP多克隆抗體(Affinity，批號：53q1907)；即用型SABC-POD試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司，批號：16B07A)。

1.4分組、模型制備與干預(yù) 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機數(shù)字表法分為正常組、模型組、蒼耳子鼻炎膠囊組和小青龍湯高、中、低劑量組，每組8只。除正常組大鼠外，其余組大鼠參照文獻[8-9]方法建立過敏性鼻炎模型?；A(chǔ)致敏：每只大鼠于腹腔內(nèi)注射由卵白蛋白0.3 mg、氫氧化鋁30 mg和生理鹽水1 mL制成的混懸液，隔天1次，共7次；滴鼻激發(fā)：配制5%卵白蛋白生理鹽水液，從基礎(chǔ)致敏結(jié)束后的第2天(正式實驗第15天)開始滴鼻，每側(cè)鼻孔50 μL，連續(xù)7 d。于末次滴鼻30 min內(nèi)觀察大鼠撓鼻、噴嚏、流涕情況，通過疊加量化計分法[10]進行統(tǒng)計，積分≥5分即為造模成功，具體評分標準見表1。建模成功后，隔天給予大鼠卵白蛋白1 g/L滴鼻以維持對鼻黏膜的刺激?；A(chǔ)致敏后各組開始灌胃干預(yù)(給藥量根據(jù)人的臨床劑量按照體重折算[11])：蒼耳子鼻炎膠囊組給予蒼耳子鼻炎膠囊溶液0.28 g/kg(相當于人臨床等效劑量的7倍)灌胃，小青龍湯高、中、低劑量組分別給予小青龍湯14 g/kg、7 g/kg、3.5 g/kg(相當于人臨床等效劑量的14，7，3.5倍)灌胃，正常組和模型組灌胃等體積生理鹽水，均每日1次，連續(xù)14 d。

表1 過敏性鼻炎大鼠行為學評分標準

1.5觀察指標與方法

1.5.1大鼠行為學評分 于末次灌胃后30 min內(nèi)觀察各組大鼠撓鼻、噴嚏、流涕情況，進行行為學評分。

1.5.2血清IgE、IL-4、IFN-γ水平 大鼠末次灌胃后禁食不禁水16 h，10%水合氯醛(0.003 mL/g)麻醉后腹主動脈取血5 mL,置于不含抗凝劑試管中，室溫下放置20 min，3 000 r/min離心20 min，分離血清,按ELISA試劑盒說明書采用雙抗體夾心法測定血清中IgE、IL-4、IFN-γ水平。

1.5.3鼻黏膜組織病理學表現(xiàn) 大鼠取血后去除面部皮毛，掀開鼻骨，打開鼻腔，用鑷子夾取鼻頭分離鼻中隔黏膜，經(jīng)4%多聚甲醛固定、梯度乙醇脫水、二甲苯透明，然后浸蠟包埋，切片。取部分切片，二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、蘇木素染色、鹽酸乙醇分化、伊紅染色、乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，最后進行顯微鏡觀察。

1.5.4鼻黏膜組織中SP、Annexin1、VCAM-1表達情況 采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合物(SABC)法測定，按SABC試劑盒說明書嚴格操作。具體步驟：鼻黏膜切片經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度乙醇水化、3%過氧化氫滅活、微波修復(fù)、5%BSA封閉，一抗4 ℃孵育過夜(兔抗大鼠SP、Annexin1多克隆抗體、兔抗大鼠VCAM-1單克隆抗體稀釋濃度分別是1∶100，1∶200，1∶80，以PBS代替一抗作為空白對照)，二抗37 ℃孵育30 min，SABC 37 ℃孵育30 min后，DAB顯色、蘇木素復(fù)染、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片，顯微鏡下觀察，組織上出現(xiàn)棕黃色即為陽性。每張切片取3個400倍不同視野，應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)進行半定量分析，記錄平均光密度值。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠行為學評分比較 正常組、模型組、蒼耳子鼻炎膠囊組及小青龍湯高、中、低劑量組大鼠行為學評分分別為(0.75±0.46)分、(6.13±0.83)分、(1.78±0.83)分、(1.65±0.89)分、(2.38±0.5)分、(3.00±0.76)分，模型組大鼠行為學評分明顯高于正常組(P<0.05)，小青龍湯各組和蒼耳子鼻炎膠囊組大鼠行為學評分均明顯低于模型組(P均<0.05)，且小青龍湯高劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組均明顯低于小青龍湯中、低劑量組(P均<0.05)，小青龍湯高劑量組與蒼耳子鼻炎膠囊組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

2.2各組大鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比較與正常組比較，模型組大鼠血清IgE、IL-4水平均明顯升高(P均<0.05)，血清IFN-γ水平明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，小青龍湯各組和蒼耳子鼻炎膠囊組血清IgE、IL-4水平均明顯降低(P均<0.05)，血清IFN-γ水平均明顯升高(P均<0.05)；與小青龍湯中、低劑量組比較，小青龍湯高劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組血清IgE、IL-4水平均更低(P均<0.05)，血清IFN-γ水平均更高(P均<0.05)，小青龍湯高劑量組與蒼耳子鼻炎膠囊組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2 正常組和過敏性鼻炎各組大鼠血清IgE、IL-4、IFN-γ水平比較

2.3各組大鼠鼻黏膜組織病理學表現(xiàn) 正常組大鼠鼻黏膜上皮細胞排列整齊，纖毛完整，可見少量杯狀細胞(箭頭所示)；模型組大鼠鼻黏膜上皮不連續(xù)，纖毛倒伏、脫落，杯狀細胞數(shù)量明顯增多，并見嗜酸性粒細胞為主的大量炎細胞浸潤；與模型組比較，小青龍湯各組和蒼耳子鼻炎膠囊組大鼠鼻黏膜上皮細胞的形態(tài)和纖毛的完整性不同程度恢復(fù)正常,嗜酸性細胞數(shù)量不同程度減少。見圖1。

圖1 正常組和過敏性鼻炎各組大鼠鼻黏膜組織HE染色表現(xiàn)(×200)

2.4各組大鼠鼻黏膜組織中SP、Annexin1、VCAM-1表達情況 與正常組比較，模型組大鼠鼻黏膜組織中SP、VCAM-1平均光密度值均明顯升高(P均<0.05)，Annexin1平均光密度值明顯降低(P<0.05)。與模型組比較，小青龍湯高、中劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組大鼠鼻黏膜組織中SP、VCAM-1平均光密度值均明顯降低(P均<0.05)，Annexin1平均光密度值均明顯升高(P均<0.05)；小青龍湯低劑量組大鼠鼻黏膜組織中SP、VCAM-1平均光密度值無明顯變化(P均>0.05)，Annexin1平均光密度值明顯升高(P<0.05)。與小青龍湯中、低劑量組比較，小青龍湯高劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組大鼠鼻黏膜組織中SP、VCAM-1平均光密度值均更低(P均<0.05)，Annexin1平均光密度值均更高(P均<0.05)，小青龍湯高劑量組與蒼耳子鼻炎膠囊組各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義(P均>0.05)。見圖2～4及表3。

表3 正常組和過敏性鼻炎各組大鼠鼻黏膜組織中SP、Annexin1、VCAM-1平均光密度值比較

圖2 正常組和過敏性鼻炎各組大鼠鼻黏膜組織中SP表達情況 (IHC，×400)

3 討 論

過敏性鼻炎是臨床最常見的過敏性疾病之一，其是一種由變應(yīng)原激發(fā)、IgE介導(dǎo)、肥大細胞和嗜酸性粒細胞等多種細胞共同參與的鼻黏膜非感染性慢性炎性疾病，發(fā)病機制復(fù)雜，與環(huán)境、免疫調(diào)控失衡和炎癥有關(guān)。IgE在過敏性鼻炎發(fā)生發(fā)展過程中扮演著重要角色，總IgE水平增高可用于判斷患者是否為特應(yīng)性體質(zhì)，也是過敏性鼻炎的主要診斷指標和治療靶標[12]。Th1/Th2失衡是過敏性鼻炎發(fā)病的重要病理環(huán)節(jié)[13]。IFN-γ、IL-4分別是Th1和Th2細胞的代表因子，在T細胞分化過程中發(fā)揮重要作用。IL-4可促進Th0細胞轉(zhuǎn)化為Th2細胞，活化后的Th2細胞可產(chǎn)生更多的IL-4，進而誘導(dǎo)B細胞產(chǎn)生IgE，促進過敏性鼻炎發(fā)生；IFN-γ由Th1產(chǎn)生，是IL-4的拮抗劑，在過敏性鼻炎中起負調(diào)節(jié)作用[14]。

圖3 正常組和過敏性鼻炎各組大鼠鼻黏膜組織中Annexin1表達情況(IHC，×400)

圖4 正常組和過敏性鼻炎各組大鼠鼻黏膜組織中VCAM-1表達情況(IHC，×400)

目前研究認為，炎癥介質(zhì)SP、Annexin1、VCAM-1表達異常與過敏性鼻炎的發(fā)病及相關(guān)病理學改變有關(guān)。SP是由分布于肥大細胞周圍的肽能神經(jīng)纖維所釋放的一種神經(jīng)肽，其可導(dǎo)致血管通透性增加、黏膜水腫、血漿外溢，肥大細胞和嗜酸性粒細胞浸潤，引起炎癥反應(yīng)，在過敏性鼻炎發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用[15-16]。Annexin1是最早發(fā)現(xiàn)的鈣依賴的膜磷脂結(jié)合蛋白超家族成員，能刺激巨噬細胞產(chǎn)生抗炎因子IL-10，抑制磷脂酶活性，進而抑制炎癥因子合成[17]；可干擾粒細胞黏附、遷移和聚集，誘導(dǎo)中性粒細胞凋亡，增強巨噬細胞的吞噬作用，抑制炎性介質(zhì)的合成和釋放，具有很強的抗炎作用[18]。VCAM-1是免疫球蛋白超家族成員，其在血管內(nèi)皮細胞上表達，能選擇性的將嗜酸性粒細胞黏附到血管內(nèi)皮細胞上，從而使嗜酸性粒細胞遷移至炎癥區(qū)域，誘發(fā)超敏反應(yīng)[19]。研究發(fā)現(xiàn)，過敏性鼻炎患者VCAM-1水平較健康人顯著升高，表明其參與了過敏性鼻炎的病理過程[20]。

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠經(jīng)卵白蛋白腹腔注射致敏、雙側(cè)鼻腔滴鼻激發(fā)后出現(xiàn)撓鼻、噴嚏、流涕等過敏性鼻炎典型癥狀，病理學觀察可見鼻黏膜上皮不連續(xù)，纖毛倒伏、脫落，杯狀細胞數(shù)量明顯增多，并見嗜酸性粒細胞為主的大量炎細胞浸潤；血清IgE、IL-4水平明顯升高，血清IFN-γ水平明顯降低；鼻黏膜組織中SP、VCAM-1表達明顯升高，Annexin1表達明顯降低。表明過敏性鼻炎大鼠存在Th1/Th2細胞因子失衡，炎癥介質(zhì)SP、VCAM-1、Annexin1表達異常，與過敏性鼻炎患者臨床特征相似[21]，提示模型復(fù)制成功。

小青龍湯源自漢代張仲景的《傷寒雜病論·辨太陽病脈證并治》篇之兩條，一條為“傷寒表不解，心下有水氣，干嘔，發(fā)熱而咳，或渴，或利，或噎，或小便不利、少腹?jié)M，或喘者，小青龍湯主之”，另一條為“傷寒，心下有水氣，咳而微喘，發(fā)熱不渴。服湯已渴者，此寒去欲解也。小青龍湯主之”。小青龍湯是治療“外寒內(nèi)飲證”的代表方，被臨床廣泛應(yīng)用于呼吸系統(tǒng)疾病的治療，如過敏性哮喘、慢性阻塞性肺疾病、過敏性鼻炎等[22]。方中麻黃、桂枝發(fā)汗散寒以解表邪，且麻黃兼能宣發(fā)肺氣而平喘咳，桂枝溫陽以利內(nèi)飲；干姜、細辛溫肺化飲，兼助麻、桂解表；五味子酸斂護肺；芍藥酸斂合營；半夏燥濕化痰，和胃降逆；炙甘草益氣和中；諸藥合用，共奏解表散寒、溫肺化飲之效。現(xiàn)代藥理學研究表明小青龍湯具有抗過敏作用，其抗過敏的物質(zhì)基礎(chǔ)是麻黃素和兒茶素[23]。網(wǎng)絡(luò)藥理學分析顯示麻黃、甘草的共有活性成分槲皮素，麻黃、白芍、細辛、甘草共有活性成分山柰酚可作用于炎性因子，參與調(diào)節(jié)免疫功能[24]。蒼耳子鼻炎膠囊的主要成分包括蒼耳子浸膏粉、石膏浸膏粉、白芷浸膏粉、辛夷揮發(fā)油等，是臨床治療過敏性鼻炎的常用中成藥[25]。

本實驗結(jié)果顯示，與模型組比較，小青龍湯高、中劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組大鼠行為學評分明顯降低，病理學觀察見鼻黏膜上皮細胞的形態(tài)和纖毛的完整性不同程度恢復(fù)正常，嗜酸性細胞數(shù)量減少，血清IgE、IL-4水平及鼻黏膜組織中SP、VCAM-1平均光密度值均明顯降低，血清IFN-γ水平及鼻黏膜組織中Annexin1平均光密度值均明顯升高，小青龍湯高劑量組和蒼耳子鼻炎膠囊組各指標改善更明顯且2組間各指標比較差異均無統(tǒng)計學意義，小青龍湯低劑量組SP、VCAM-1改善不明顯。說明小青龍湯可減輕過敏性鼻炎癥狀，影響過敏性鼻炎大鼠炎癥介質(zhì)表達，調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子產(chǎn)生，以中、高劑量療效為佳，且呈劑量依賴性，高劑量小青龍湯與蒼耳子鼻炎膠囊藥效相當。

綜上所述，小青龍湯可明顯改善過敏性鼻炎大鼠的鼻黏膜炎性癥狀，其作用機制可能與抑制炎癥介質(zhì)SP、VCAM-1表達，上調(diào)Annexin1表達和調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子失衡有關(guān)，為經(jīng)方臨床推廣治療過敏性鼻炎提供了依據(jù)，但其具體的作用機制有待后續(xù)深入研究。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。