膜蛋白質(zhì)復(fù)合物提取方法研究進展

褚宏偉，鄭詩穎，趙群，趙寶鋒，梁振，張麗華*，張玉奎

（1．中國科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所，中國科學(xué)院分離分析化學(xué)重點實驗室，國家色譜研究分析中心，遼寧 大連 116023；2．大連理工大學(xué) 張大煜學(xué)院，遼寧 大連 116024；3．中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049）

膜蛋白質(zhì)作為細胞膜結(jié)構(gòu)和功能的主要承擔(dān)者，參與分子轉(zhuǎn)運、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細胞間交流等生物學(xué)過程［1］。目前約60%的藥物靶標均為膜蛋白質(zhì)［2-3］。其功能的發(fā)揮大多依賴與其他蛋白質(zhì)相互作用形成的膜蛋白質(zhì)復(fù)合物（Membrane protein complexes，MPCs）［4］。除鑒定蛋白質(zhì)種類并研究其含量的動態(tài)變化外，解析蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（Protein-protein interactions，PPIs）也是理解細胞生物過程的重要信息來源［5-7］。由于大多數(shù)膜蛋白質(zhì)的豐度低，且疏水性強，使得對MPCs的過表達和純化面臨諸多挑戰(zhàn)。因此亟需發(fā)展既能從細胞中直接高效提取MPCs，且能維持PPIs穩(wěn)定性的方法［4，8］。本文針對MPCs的提取方法及其應(yīng)用進展進行綜述，并對其發(fā)展前景加以展望。

1 基于表面活性劑的MPCs提取

表面活性劑是一類具有疏水和親水基團的兩親性分子，可通過自組裝形成膠束，進而模擬脂質(zhì)雙分子層與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)結(jié)合，從而實現(xiàn)MPCs的高效提?。?-10］。然而，為確保在提取過程中復(fù)合物結(jié)構(gòu)的完整性，目前多采用比較溫和的表面活性劑。

以聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）、乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P-40，NP-40）和n-十二烷基-β-D-麥芽糖苷（n-Dodecyl-β-D-maltopyranoside，DDM）為代表的非離子型表面活性劑，能破壞脂類-脂類和脂類-蛋白質(zhì)間的相互作用但不破壞PPIs，常被用于MPCs的溶解和提?。?1］。Zheng等［12］使用NP-40裂解液對Rat-2細胞中表皮生長因子受體（EGFR）復(fù)合物提取后進行免疫共沉淀-質(zhì)譜（co-Immunoprecipitation-mass spectrometry，co-IP-MS）分析，鑒定到EGFR復(fù)合物中41種相互作用蛋白，參與蛋白質(zhì)磷酸化、脂質(zhì)代謝和內(nèi)吞作用等多條信號通路。Tian等［13］采用NP-40裂解液提取細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標記技術(shù)（Stable isotope labeling with amino acids in cell culture，SILAC）標記的Jurkat細胞，結(jié)合co-IP-MS分析，構(gòu)建膜蛋白質(zhì)CD28的相互作用網(wǎng)絡(luò)和信號通路，鑒定到28種CD28的相互作用蛋白，其中超過50%的蛋白參與免疫信號通路。為全面了解CD28的相互作用網(wǎng)絡(luò)，研究人員進一步在STRING和BioGRID數(shù)據(jù)庫中查詢了上述28種蛋白的相互作用蛋白，獲得93種蛋白質(zhì)，高度富集在細胞內(nèi)信號級聯(lián)和肌動蛋白-細胞骨架組織中。研究還發(fā)現(xiàn)，擴展的CD28相互作用網(wǎng)絡(luò)圍繞PI3K家族、STAT家族、GRB2、CD2AP、CIN85以及CBL等蛋白質(zhì)形成清晰的磷酸化依賴性相互作用中心。Carlson等［14］比較了3種不同的非離子型表面活性劑（DDM、N，N-二甲基十二烷基胺-N-氧化物和辛基-β-D-葡萄糖苷）以及1種離子型表面活性劑（脫氧膽酸鈉）對大腸桿菌（Escherichia coli，E.coli）MPCs的提取效果，基于十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）和考馬斯亮藍染色對內(nèi)膜蛋白質(zhì)標記物MsbA提取效率的評價，最終選擇DDM為最佳提取體系。Lorenzen等［15］使用DDM裂解HEK293細胞，并通過在膜蛋白質(zhì)周圍形成膠束環(huán)境，維持了GPCR-RAMP復(fù)合物在提取過程中的結(jié)構(gòu)完整性。Lee等［16］研究了DDM和辛基葡萄糖苷對前列腺癌細胞PC3-mm2中膜蛋白質(zhì)Cad11復(fù)合物提取的影響，發(fā)現(xiàn)DDM不會干擾mAb 1A5與Cad11的結(jié)合，而辛基葡萄糖苷則會干擾二者結(jié)合。以DDM提取分離PC3-mm2細胞中的Cad11復(fù)合物，通過膠上酶解-MS分析復(fù)合物中的蛋白質(zhì)。使用1%FDR檢索并扣除常見污染蛋白，重復(fù)鑒定出20種Cad11相互作用蛋白質(zhì)。此外，通過iTRAQ定量分析比較了DDM、Triton X-100和膽酸鈉對Cad11復(fù)合物的提取能力，發(fā)現(xiàn)DDM和Triton X-100對已知的Cad11相互作用蛋白質(zhì)的提取能力相當(dāng)，均優(yōu)于膽酸鈉（圖1）。

圖1 基于表面活性劑的Cad11復(fù)合物提取及其相互作用蛋白分析［16］Fig．1 Experimental flowchart for extraction of Cad11 complexes by detergents and analysis of interacting proteins［16］

盡管非離子型表面活性劑目前應(yīng)用最為廣泛，但該類溶劑的溫和性質(zhì)影響了其對MPCs的提取能力［12，17］。因此，采用多種表面活性劑的組合逐漸受到人們關(guān)注。Greenblatt等［17］利用Triton X-100、DDM和八甘醇單正十二烷基醚3種表面活性劑的組合，從釀酒酵母中鑒定了1 726種由膜蛋白參與的PPIs以及501種MPCs。Emili等［18］采用上述相同的組合從E.coli中提取，并結(jié)合親和純化MS分析，不僅鑒定了785種MPCs，而且從鑒定到的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)中發(fā)現(xiàn)了新的復(fù)合物。盡管上述研究采用表面活性劑的組合在一定程度上提高了MPCs的鑒定覆蓋率，但對復(fù)合物的穩(wěn)定性仍有影響，并增加了蛋白質(zhì)聚集的可能性［9，19-21］。

以SDS為代表的陰離子型表面活性劑，其長烷基鏈尾部可與蛋白質(zhì)的疏水區(qū)相互作用，而帶負電的親水頭部與蛋白質(zhì)側(cè)鏈正電荷結(jié)合，可協(xié)同促進對蛋白質(zhì)的溶解和提取能力。然而該類表面活性劑的提取能力強，會破壞PPIs，因此無法直接用于MPCs的提取和分析?；瘜W(xué)交聯(lián)可通過在近端氨基酸殘基之間形成共價鍵來捕獲瞬態(tài)蛋白質(zhì)相互作用，有效地固定低親和力與瞬時蛋白質(zhì)相互作用［22］?；瘜W(xué)交聯(lián)與MS的結(jié)合已成為獲得蛋白質(zhì)復(fù)合物動態(tài)構(gòu)象和相互作用界面的強大技術(shù)［23-24］。Bruce等［25］報道了蛋白質(zhì)相互作用報告基因（Protein interaction reporter，PIR）技術(shù)，其交聯(lián)劑結(jié)合胺基反應(yīng)基團、MS可斷裂和親和富集標簽，且具有透膜性；進一步將PIR交聯(lián)用于多藥耐藥鮑曼不動桿菌（Acinetobacter baumannii，A.baumannii）菌株AB5075中蛋白質(zhì)相互作用的原位解析［26］。交聯(lián)后采用4%SDS裂解，MS分析鑒定了2 068對交聯(lián)肽，包含245種分子內(nèi)和398種分子間相互作用，涉及94種膜蛋白、230種可溶性蛋白和103種未表征的蛋白。其中MPCs構(gòu)成了725對交聯(lián)肽，為膜蛋白質(zhì)相互作用結(jié)構(gòu)解析提供了數(shù)據(jù)支撐。此外，Gao等［27］開發(fā)的一種雙琥珀酰亞胺酯交聯(lián)劑BSP具有細胞膜通透性，可在5 min內(nèi)實現(xiàn)活細胞內(nèi)蛋白質(zhì)復(fù)合物的高效快速交聯(lián)。借鑒該思路，可以設(shè)計合成具有不透膜性，且對膜蛋白具有強反應(yīng)活性的交聯(lián)劑，通過化學(xué)交聯(lián)的方式先在活細胞水平原位固定MPCs的PPIs，再采用SDS等具有強提取能力的溶劑體系提取蛋白質(zhì)復(fù)合物，有望為實現(xiàn)MPCs的深度覆蓋分析提供新的策略。

對于大多數(shù)生物學(xué)研究來說，為了分離感興趣的MPCs，依賴非離子型表面活性劑提取的方法使用較為廣泛，但它們形成的膠束環(huán)境與天然細胞膜之間的物理性質(zhì)還存在一定差異，難以兼顧MPCs的高效溶解和結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定?？煽紤]改變表面活性劑中烷基鏈長或組合不同功能基團，開發(fā)新型表面活性劑，在保證提取效率的前提下，提高MPCs的穩(wěn)定性。

2 基于離子液體輔助的MPCs提取

離子液體（Ionic liquids，ILs）是指在低于100℃時呈現(xiàn)液態(tài)的有機熔融鹽類，由大且不對稱的有機陽離子和有機/無機陰離子組成［28-32］。作為新興的綠色、可設(shè)計、環(huán)境友好的溶劑，ILs因具有溶解能力強、結(jié)構(gòu)可設(shè)計性等優(yōu)點，近年來已被用于蛋白質(zhì)提取等研究中。在前期工作中，本課題組通過對不同結(jié)構(gòu)ILs的分子動力學(xué)模擬和實驗評價，篩選出適用于蛋白質(zhì)組高效提取且與后續(xù)胰蛋白酶酶活兼容的IL—1-十二烷基-3-甲基咪唑氯化物（1-Dodecyl-3-methylimidazolium chloride，C12Im-Cl），并建立了深度覆蓋的膜蛋白質(zhì)組和全蛋白質(zhì)組分析方法［33-37］。然而由于C12Im-Cl與蛋白質(zhì)間的相互作用力強，在蛋白質(zhì)復(fù)合物提取過程中會破壞其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

Chu等［38］篩選出能夠保持PPIs穩(wěn)定性的IL—三乙胺乙酸鹽（Triethylamine acetate，TEAA），并通過分子對接模擬，發(fā)現(xiàn)TEAA會占據(jù)蛋白質(zhì)之間的反競爭性結(jié)合位點，通過疏水相互作用和鹽橋維持PPIs穩(wěn)定?；诖耍l(fā)展了TEAA輔助NP-40的提取體系i-TAN，提高了對MPCs的提取能力。與傳統(tǒng)的NP-40提取體系相比，采用i-TAN體系可將從HeLa細胞中鑒定的EGFR相互作用蛋白數(shù)目由73種提高到90種。此外，從曲妥珠單抗敏感和耐藥的乳腺癌細胞中鑒定到74種EGFR相互作用蛋白質(zhì)，其中13種蛋白質(zhì)在敏感細胞中豐度更高，41種蛋白質(zhì)在耐藥細胞中豐度更高。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，除了ERBB信號通路及其下游PI3K通路的激活會影響曲妥珠單抗治療響應(yīng)以外，AP-2接頭復(fù)合蛋白的上調(diào)也會促進網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，使得ERBB2的表達和下游信號通路的活性下調(diào)，導(dǎo)致曲妥珠單抗耐藥細胞對曲妥珠單抗的響應(yīng)不佳，為理解乳腺癌曲妥珠單抗耐藥機制提供了新的思路。此外，Chu等［39］將定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)用于肝癌（Hepatocellular carcinoma，HCC）索拉非尼耐藥機制研究，發(fā)現(xiàn)在Huh7耐藥細胞中膜蛋白質(zhì)FOLR1顯著高表達；進一步利用i-TAN體系提取結(jié)合co-IPMS分析，鑒定到124種FOLR1相互作用蛋白。對FOLR1相互作用蛋白質(zhì)進行了分析以及后續(xù)生物學(xué)驗證，發(fā)現(xiàn)FOLR1過表達可能影響葉酸異常轉(zhuǎn)運，促進細胞自噬，進而引起索拉非尼耐藥，為通過抑制FOLR1預(yù)防索拉非尼耐藥提供了新的思路。

與傳統(tǒng)的表面活性劑提取體系相比，離子液體輔助的提取方法形成的膠束環(huán)境更加均一，并且可占據(jù)蛋白質(zhì)之間的結(jié)合位點，促進MPCs的穩(wěn)定和提取?；陔x子液體陰陽離子結(jié)構(gòu)的可設(shè)計性，結(jié)合分子對接等理論模擬技術(shù)，有望篩選最優(yōu)化的離子液體，并建立基于離子液體（不含表面活性劑）的MPCs提取體系。

3 基于變性劑的交聯(lián)MPCs提取

以尿素為代表的變性劑通過氫鍵、疏水相互作用和靜電作用等促進蛋白質(zhì)分子氨基酸殘基的伸展，從而改變蛋白質(zhì)的高級結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)蛋白質(zhì)的溶解和提?。?0-42］。由于變性劑會破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)使PPIs發(fā)生變化，因此無法直接用于MPCs的提取。Wang等［23］先通過具有透膜性的甲醛交聯(lián)細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)復(fù)合物，然后使用8 mol/L尿素提取，并結(jié)合尺寸排阻色譜（Size exclusion chromatography，SEC）分離和數(shù)據(jù)非依賴性采集MS分析，從HEK293細胞中共鑒定到272種蛋白質(zhì)復(fù)合物。Bruce等［43］將定量化學(xué)交聯(lián)應(yīng)用于紫杉醇處理的SILAC標記HeLa細胞，再采用8 mol/L尿素進行提取，分析細胞中的蛋白質(zhì)相互作用組變化。通過SILAC定量分析獲得了746種交聯(lián)蛋白中683種的相對豐度水平。對關(guān)鍵蛋白進行分析，發(fā)現(xiàn)其中定位于質(zhì)膜且在酪氨酸激酶信號通路中起作用的PHB蛋白與PHB2蛋白之間有8對交聯(lián)肽。此外，研究發(fā)現(xiàn)交聯(lián)水平的變化大于PHB或PHB2蛋白水平的增加，這可能表明PHB-PHB2復(fù)合物水平增加或反映了亞細胞定位的變化。Huang等［44］先利用開發(fā)的具有透膜性、可富集性和MS可斷裂性的交聯(lián)劑Alkyne-A-DSBSO對HEK293細胞交聯(lián)后，再采用8 mol/L尿素進行提取，鑒定到2 484種蛋白質(zhì)（接近12%的蛋白質(zhì)具有質(zhì)膜定位）之間的6 439種相互作用。上述研究為挖掘生物體內(nèi)MPCs原位信息以及構(gòu)建實時、準確的蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

化學(xué)交聯(lián)固定化天然的MPCs后再提取的方法，為原位解析MPCs的組成提供了新方案。雖然能夠用于蛋白質(zhì)組學(xué)分析，但難以獲得天然的膜蛋白復(fù)合物用于其他的生物學(xué)應(yīng)用。因此，仍亟需發(fā)展新型高效的MPCs提取技術(shù)，用于提升MPCs的提取效率和MPCs結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，以適應(yīng)蛋白質(zhì)組學(xué)和生物學(xué)研究的需求。

4 基于膜模擬兩親物的MPCs提取

近年來由于可提供保持MPCs穩(wěn)定的微環(huán)境，磷脂納米盤和兩親聚合物等膜模擬兩親物在MPCs結(jié)構(gòu)和功能研究中發(fā)揮了重要作用。

磷脂納米盤是由雙層磷脂組成的合成雙層系統(tǒng)，如棕櫚酰-油酰-磷脂酰膽堿被2個相同的兩親性α-螺旋膜支架蛋白包圍，提供面向脂質(zhì)的疏水表面和面向溶劑的親水表面，可用于穩(wěn)定被組裝的MPCs［45-47］。磷脂納米盤高度溶于水，為研究配體與膜蛋白以及PPIs的結(jié)合活性創(chuàng)造了類似天然的脂質(zhì)環(huán)境，已被成功用于E.coli核糖體質(zhì)膜上的SecYEG復(fù)合物的冷凍電鏡結(jié)構(gòu)表征［48］。磷脂納米盤可通過使用不同長度的膜支架蛋白以滿足對不同尺寸的膜蛋白質(zhì)穩(wěn)定需求，然而較大的磷脂納米盤（直徑＞15 nm）通常較不穩(wěn)定［4］。為解決這一問題，Carlson等［14］開發(fā)了一種新型膜模擬支架——肽盤來保持MPCs的穩(wěn)定性，并采用DDM實現(xiàn)了E.coli膜蛋白相互作用組的提取。在最大限度保證MPCs提取效率和結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的前提下，共鑒定到1 209個蛋白質(zhì)（含591種膜蛋白）組成的4 911種相互作用，其中包含很多新發(fā)現(xiàn)的和瞬時的PPIs，在細胞包膜的運輸過程和生物發(fā)生機制中發(fā)揮重要作用。

兩親聚合物通過在跨膜區(qū)域周圍形成致密層實現(xiàn)MPCs的提取和穩(wěn)定［4］。已有研究將兩親聚合物用于牛線粒體超復(fù)合物Ⅰ中電子傳遞鏈組分的Ⅰ1Ⅲ2Ⅳ1的提取；其可與膜蛋白緊密結(jié)合，覆蓋1．5~2．0 nm層中的疏水表面積，穩(wěn)定膜蛋白并保持其在溶液中的活性，有助于后續(xù)對復(fù)合物進行結(jié)構(gòu)解析［49］。D?rr等［50］利用兩親共聚物—苯乙烯-馬來酸共聚物（Styrene-maleic acid copolymers，SMAs）直接從E.coli膜中分離了四聚體鉀通道KcsA。SMAs不會完全破壞脂質(zhì)雙層，而是自發(fā)地插入并提取完整的膜片；其形式為納米大小的盤狀顆粒，可保留原始的生物膜組分。此外，SMAs能夠直接提取含有大型功能性蛋白質(zhì)復(fù)合物（如參與細胞分裂［51］和光合作用［52］的蛋白質(zhì)，以及ABC轉(zhuǎn)運蛋白家族的成員［53］）的天然磷脂納米盤。Korotych等［54］利用SMAs從植物類囊體中分離超分子MPCs。通過考察12種具有不同物理化學(xué)性質(zhì)的SMAs從菠菜類囊體膜中提取MPCs的能力，發(fā)現(xiàn)SMA? 1440、XIRAN? 25010、XIRAN? 30010、SMA?17352和SMA?PRO 10235的效率最高；進一步用于從菠菜和豌豆類囊體膜中分離超分子MPCs，發(fā)現(xiàn)XIRAN? 30010和SMA? PRO 10235相較于其他3種，偏向提取具有較小尺寸或較低密度的MPCs（圖2）。

圖2 基于5種SMAs的菠菜和豌豆類囊體膜中超分子MPCs的提?。?4］Fig．2 Extraction of supramolecular MPCs from Spinacia oleracea and Pisum sativum by five SMAs［54］

新型膜模擬兩親物的開發(fā)，譬如通過在磷脂納米盤內(nèi)重建膜模擬環(huán)境，或使用SMA保護MPCs局部的膜環(huán)境，均取得了顯著的效果，并且與冷凍電鏡兼容，有助于實現(xiàn)特定MPCs的提取和結(jié)構(gòu)解析。但目前尚無法模仿整個膜環(huán)境，還有待開發(fā)更大尺寸且穩(wěn)定的膜模擬兩親物。

5 基于超聲處理的MPCs提取

超聲處理是采用不同頻率的聲波交替破壞細胞結(jié)構(gòu)，從而提取蛋白質(zhì)。近年來，Robinson等［55-56］報道了在維持細胞膜完整性的前提下，適用于MS分析的脂質(zhì)囊泡超聲處理方法（Sonication of lipid vesicles for mass spectrometry，SoLVe-MS）。利用不同來源的膜制備脂質(zhì)囊泡，在醋酸銨中進行超聲處理，破壞并濃縮包裹MPCs的囊泡，將其引入質(zhì)譜儀中電離，進而實現(xiàn)MPCs的原位質(zhì)譜解析（圖3）。該研究可揭示天然膜中未被表征的相互作用，譬如E.coli外膜中FOF1ATP酶-SecYEG復(fù)合物（與FO中的c亞基結(jié)合），以往研究顯示其在表面活性劑提取過程中丟失或在其他方法中被過濾掉［57］；發(fā)現(xiàn)E.coli內(nèi)膜中CydX和AppX能夠同時與CydAB相互作用形成異源四聚體。此外，還在牛線粒體內(nèi)膜中鑒定到復(fù)合物Ⅲ和Ⅳ。研究結(jié)果體現(xiàn)了天然膜環(huán)境對于保留膜蛋白質(zhì)組的小分子結(jié)合、亞基相互作用和相互作用蛋白的重要性。

圖3 E.coli內(nèi)外膜上SoLVe-MS分析的關(guān)鍵步驟［56］Fig．3 Key steps in the process of SoLVe-MS performed on E.coli inner and outer membranes［56］

該方法無需傳統(tǒng)的化學(xué)干預(yù)及處理（例如使用表面活性劑），也無需構(gòu)建復(fù)雜的MPCs過表達體系，為MPCs解析提供了新的思路。值得注意的是，盡管這些天然膜囊泡盡可能地模擬蛋白質(zhì)的天然環(huán)境，但它們并未完全概括天然膜的所有特性。此外，一些膜囊泡很難純化或大量生產(chǎn)，如真核細胞質(zhì)膜，可能過于復(fù)雜而無法分析。隨著樣品變得更加復(fù)雜并由更多的蛋白質(zhì)組成，將需要大量的生物材料。這可能會成為該方法使用受限的原因之一。

6 總結(jié)與展望

MPCs因其所處的天然膜環(huán)境相對疏水，在提取過程中易解離，穩(wěn)定性較差。本文介紹了5種MPCs提取方法，其中基于非離子型表面活性劑和離子液體輔助的提取方法可以很好的與生物學(xué)研究兼容，促進MPCs關(guān)鍵生物功能的挖掘；基于化學(xué)交聯(lián)固定化后再提取以及超聲處理的方法為深度覆蓋的原位膜蛋白相互作用解析提供了新的策略；基于膜模擬兩親物的提取方法為MPCs的結(jié)構(gòu)解析提供了有力支撐。針對不同方法的適用性，可根據(jù)需求選擇合適的提取方法。目前對于MPCs的提取和鑒定還明顯落后于可溶性蛋白質(zhì)，在未來研究中，整合多種提取方法實現(xiàn)MPCs的深度覆蓋分析，解析全景式膜蛋白相互作用組值得進一步探索。此外，針對分布在特定亞細胞器的MPCs以及特定功能性MPCs的提取，還需要開發(fā)相應(yīng)的靶向提取策略，不僅要具備足夠的提取能力和維持復(fù)合物中PPIs的穩(wěn)定性，而且要提升對特定MPCs的靶向選擇性。隨著提取方法的不斷發(fā)展，對MPCs的鑒定和認識也會逐步深入，將會發(fā)現(xiàn)更多與疾病相關(guān)的靶標膜蛋白質(zhì)，為臨床藥物開發(fā)提供理論支撐。