表面等離子體共振傳感器生物識別分子的固定化方法

萬 紅，趙 釗，梁花蕾，崔海容，劉虎威

（武昌理工學院 生命科學學院，湖北 武漢 430223）

表面等離子體共振（Surface plasma resonance，SPR）是一種光學生物傳感技術［1］，當光從光密介質(zhì)進入光疏介質(zhì)時，會發(fā)生反射與折射，而SPR共振角度會隨著反射光折射率的變化而改變。當偶聯(lián)在傳感芯片表面的生物分子與其它分子發(fā)生相互作用時，會引起反射光折射率的改變，通過實時監(jiān)測SPR共振角的變化，即可記錄樣品與固定在SPR芯片上的生物識別分子之間的特異性結合情況［2］。SPR具有無需標記樣品，樣品前處理簡單，樣品用量少，檢測靈敏度高，能實時檢測生物分子間的相互作用，并獲得分子間結合與解離的信息等優(yōu)點［3-4］，因而被廣泛應用于藥物篩選［5-6］、生物檢測［7］和食品分析［8］等領域。

構建合適的SPR生物傳感界面是提高檢測靈敏度和選擇性的重要途徑。構筑SPR芯片需要考慮如下因素［9-12］：（1）根據(jù)生物分子的特性和目標分析物的性質(zhì)以及二者間的相互作用機理，功能化修飾SPR芯片表面，以固定生物識別分子；（2）功能化的芯片表面須具有生物相容性，以保持固定分子的生物活性；（3）提高生物識別分子的負載量，以增加其與目標分子特異性反應的量；（4）防止芯片表面的非特異性結合，減少其它分子的干擾。

構筑SPR芯片的主要步驟是首先將芯片表面的金功能化修飾，然后通過吸附或化學偶聯(lián)的方法在金表面固定生物識別分子。生物識別分子與目標分子的相互作用是利用分子中特定的點位或片段與目標分子進行特異性結合。根據(jù)生物識別分子的分布和空間取向，生物識別分子的固定方法分為非定向固定和定向固定兩種。生物識別分子的非定向固定是指通過化學偶聯(lián)方法固定在SPR芯片表面的生物識別分子處于隨機分布狀態(tài)，且分子識別片段的取向也是隨機的；生物識別分子的定向固定是指通過一定的化學或生物化學反應，使生物識別分子均勻地固定在SPR芯片表面，且分子識別片段的取向一致。

1 基于化學偶聯(lián)的非定向固定法

1.1 自組裝單層膜法

自組裝單層膜法（Self-assembled monolayer，SAM）是利用雙官能團分子的一端巰基與金的共價鍵作用，在芯片表面形成有序單分子組裝體的方法。雙官能團分子的另一端通常為羧基官能團，經(jīng)碳二亞胺活化后，可偶聯(lián)生物識別分子［13］。

自組裝單層膜法能在金表面形成高度有序且致密的單分子膜，通過調(diào)節(jié)雙官能團分子碳鏈的長度，可以調(diào)控生物識別分子與目標分析物之間相互作用的效果［14］。自組裝單層膜的厚度較薄，其優(yōu)點是對金表面SPR影響較小，但缺點是生物識別分子的負載量較小，檢測靈敏度受影響。為克服這一問題，Melaine和Kim等人分別利用單鏈/雙鏈DNA［15］、抗原/抗體形成的三明治結構［16］，負載納米金粒子，從而增強SPR信號。

自組裝單層膜也可使用巰基化的聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）作為自組裝分子。巰基化的聚乙二醇由于具有巰基烷烴的柔性和有序特性，且羥基（—OH）具有親水性，因此能夠有效地固定生物識別分子，被用于構筑SPR芯片的有線性PEG6［17］（圖1）、二巰基化PEG（DSPEG2）［18］和羧基功能化的二巰基PEG（S2PEGCOOH）［19］等。

圖1 自組裝膜法固定生物識別分子示意圖［17］Fig．1 Schematic diagram of immobilizing bioreceptor by SAM［17］

為增加表面生物識別分子的負載量，可使用兩種或多種自組裝分子形成自組裝混合膜，以調(diào)節(jié)膜端基的官能團密度，更多地錨定分子量較大的生物識別分子，從而提高檢測的靈敏度［20-21］。

1.2 多維聚合物膜法

如前所述，SPR芯片表面的自組裝單層膜有序可控，但生物識別分子的負載量較小。因此，可通過在SPR芯片表面修飾多維聚合物膜來提高生物識別分子的負載量。一些高分子聚合物由于含有多個活性官能團，這些官能團既能在芯片表面形成穩(wěn)定的薄膜，同時活化后又能偶聯(lián)生物識別分子，因此在SPR芯片制備中得到廣泛的應用。

羧甲基化葡聚糖（Carboxymethyl dextran，CMD）常被用于SPR芯片表面形成多維聚合物膜。CMD分子的終端有許多羧基官能團，活化后可以化學偶聯(lián)生物識別分子。其負載量比自組裝單層膜高，主要原因是CMD分子的羧基官能團與芯片表面的結合位點大大增加［22］。He等［23］用羧甲基葡聚糖在芯片表面制備了多維聚合物。經(jīng)EDC/NHS（1-（3-Dimethylaminopropyl）-3-ethylcarbodiimide hydrochloride/NHydroxysuccinimide）活化后，固定蛋白偶合物（卵清蛋白）與抗原。由此制備的SPR傳感芯片可用于檢測生物標志物3-硝基酪氨酸，檢測結果表明SPR生物傳感器的分析性能比酶聯(lián)免疫方法更好。Xia等［24］用CMD聚合物修飾的芯片易于同時共價固定2種生物識別分子，且能高效再生；研究表明采用EDC/NHS活化后固定2種抗體，可同時檢測牛奶和血清中的慶大霉素與三聚氰胺。

由于SPR的感應范圍有限，平均穿透深度小于200 nm，靈敏度隨著芯片表面膜厚度的增加呈指數(shù)級下降，聚合物的使用可能會使芯片表面的基質(zhì)層厚度達200 nm，從而極大地影響了SPR的分析性能［25］。Wang等［26］比較了SAM和CMD功能化芯片的SPR分析性能，發(fā)現(xiàn)SAM功能化芯片具有更高的靈敏度，主要原因是SAM膜更薄，金表面的SPR響應信號更強。

聚多巴胺（PDA）薄膜也廣泛應用于制備SPR生物傳感器。在弱堿性的水溶液中，多巴胺發(fā)生自發(fā)聚合反應，能在各種有機和無機基底表面形成穩(wěn)定的聚多巴胺薄膜。聚多巴胺中的醌基能與生物分子中的胺基或巰基通過邁克爾加成或Schiff堿反應形成共價鍵，從而固定生物識別分子。Lee等［27］的研究表明，只需將多巴胺溶液滴加在金表面，多巴胺便可實時聚合，聚多巴胺層的厚度可通過改變沉積時間進行控制。此外，端基為胺基的DNA可直接偶聯(lián)到聚多巴胺膜表面，無需添加額外試劑［28］。Toma等［29］在溫和反應條件下，在金芯片表面制備了聚多巴胺薄膜，結果表明在不使用任何偶聯(lián)試劑的條件下，聚多巴胺薄膜表面可共價偶聯(lián)抗體，且抗體偶聯(lián)反應速率較快，并可實時調(diào)控（圖2）。

圖2 聚多巴胺固定生物識別分子示意圖［29］Fig．2 Schematic diagram of the PDA immobilization of bioreceptors［29］

與傳統(tǒng)SAM耦合方法相比，將抗體固定到聚多巴胺薄膜可增大生物識別分子的負載量，原因是薄膜表面結合位點增加，空間位阻減小，且抑制了EDC/NHS的水解問題［30］。

基于自組裝單層膜法和多維聚合物膜法實現(xiàn)功能化的芯片均可偶聯(lián)DNA、抗體、生物素和蛋白質(zhì)等生物識別分子，但固定的生物識別分子的取向是隨機的，不利于與目標分析分子的有效結合。生物識別分子的定向固定，是使識別分子的取向適合與目標分子結合，從而充分利用芯片表面固定的生物識別分子，提高SPR傳感的靈敏度。此外，影響SPR檢測選擇性的主要因素是檢測樣品中物質(zhì)在芯片表面的非特異性吸附。在定向固定法中，芯片表面往往形成的是單分子層膜，且分子取向一致，增加了特異性反應，降低了非特異性吸附，從而提高檢測的選擇性；非定向固定法中，芯片表面往往形成的是多層膜，且分子取向隨機，導致非特異性吸附較強，但檢測的選擇性較低。因此，生物識別分子的定向固定成為研究熱點，也是提高分析靈敏度和選擇性的重要途徑。

2 基于生物識別分子親和性的定向固定法

2.1 利用DNA定向固定生物識別分子

巰基化的單鏈DNA可在SPR芯片的金表面形成自組裝膜，然后與生物分子（如抗體、生物素）標記的DNA通過堿基配對互補關系雜交形成雙鏈DNA，從而固定目標生物分子。Ladd等［31］首先在金芯片上用標記生物素巰基烷烴形成自組裝膜，然后用親和素偶聯(lián)單鏈DNA，再通過雜交將DNA標記的人絨毛膜促性腺激素抗體固定在SPR表面（如圖3A），由此制備的SPR芯片對人絨毛膜促性腺激素的檢出限為0．5 ng/mL。Bombera等［32］設計并構建了一種用于細胞實時分選的DNA-DNA-抗體SPR生物芯片，研究了定向化的分子和細胞之間的相互作用。Leroy等［33］采用DNA定向偶聯(lián)抗CD19和抗CD90IgG，分別捕獲B淋巴細胞和T淋巴細胞，使用限制性內(nèi)切酶切割DNA-蛋白偶聯(lián)物，監(jiān)測細胞的釋放（如圖3B）。

DNA與低分子量抗原偶合物也可用于構建SPR生物傳感器，Tort等［34］將類固醇半抗原-DNA偶合物，通過基因雜交偶聯(lián)至SPR芯片表面，實驗結果表明其對抗血清（As147、As170和As138）有較好的識別作用（如圖3C）。

DNA折紙是指通過長的單鏈DNA支架，與數(shù)百條與之互補配對的短鏈DNA相互配對后，折疊成一定形狀，具有很好的生物相容性的DNA微觀結構。這種DNA微觀結構不僅能定向固定生物識別分子，而且可以形成生物識別分子陣列，大大提高芯片表面的負載量。利用DNA折紙技術［35］，將結合凝血酶的核酸適配體定向固定至DNA微觀結構中，檢測凝血酶的量可低至6．1 nmol（如圖3D）。

圖3 DNA定向構建SPR芯片F(xiàn)ig．3 SPR chips constructed by DNA-directed immobilization

2.2 利用蛋白A/G定向固定生物識別分子

蛋白A（Protein A）來源于金黃色葡萄球菌的一個株系，含有多個可與免疫球蛋白（IgG）分子的Fc段特異性結合的結構域。蛋白G（Protein G）是從G類鏈球菌中分離出的胞壁蛋白，不僅可結合IgG的Fc段，還能結合IgG的Fab段，對于大多數(shù)哺乳動物的IgG有著更高的親和力。在芯片表面先用巰基羧酸自組裝膜，再用EDC/NHS試劑活化羧基，然后通過偶聯(lián)的方法將免疫球蛋白固定在芯片表面，得到的免疫球蛋白的特異位點是隨機分布的。如果活化羧基后，先偶聯(lián)蛋白G［36］，再固定人體生長激素免疫球蛋白，便可實現(xiàn)免疫球蛋白的定向固定，使芯片表面固定的人體生長激素抗體增加2．6倍。為了有效地克服芯片在洗滌過程中抗原/抗體的離解，使用化學交聯(lián)劑交聯(lián)抗原/抗體后，可使人體生長激素抗體的檢測靈敏度增加3．5倍。Paiva等［37］用二硫化碳作為交聯(lián)劑與蛋白A的胺基相聯(lián)，通過硫元素與金表面形成共價鍵固定蛋白A。另外加入納米金，可以負載更多的蛋白A。用蛋白A固定IgG能夠使IgG的結合位點取向一致，二硫化碳還起到防止IgG非特異性吸附的作用（如圖4），可使檢測抗體的量增加2．6倍。

圖4 二硫化碳功能化蛋白A定向固定受體示意圖［37］Fig．4 Schematic diagram of functionalization of protein A with carbon disulfide and direct immobilization of the receptor［37］

值得注意的是，由于蛋白A和蛋白G作用于免疫球蛋白分子特異性結合的結構域，將會影響抗原、抗體的相互作用，從而影響檢測的靈敏度。

2.3 利用“點擊化學”定向固定生物識別分子

“點擊化學”（Click chemistry）的代表反應是由疊氮化物和炔烴作用形成共價鍵。該反應條件溫和，特異性高，穩(wěn)定性好，甚至能在活細胞中進行，且能保持生物分子的生物活性。Van't Veer等［38］研究發(fā)現(xiàn)，將疊氮基團引入重鏈抗體分子中，然后在芯片表面引入環(huán)辛炔，通過銅（Ⅰ）催化疊氮化物-炔烴環(huán)發(fā)生加成反應后，再將重鏈抗體定向固定在芯片表面，制備的SPR芯片檢測靈敏度可提高10倍以上（見圖5）。為消除催化劑銅（Ⅰ）鹽對生物分子的毒性，避免生物分子因結構改變而失活，可在無銅條件下實現(xiàn)點擊化學。Trilling等［39］用含疊氮基團的青霉素結合蛋白質(zhì)（Penicillin-binding proteins，PBPs），通過疊氮化物-炔烴環(huán)加成反應，將PBPs均勻地固定在二芐基環(huán)辛炔涂層表面，結果顯示，定向固定的PBPs仍保持生物活性，與特異性蛋白結合后SPR信號顯著增強。

圖5 疊氮修飾重鏈抗體分子固定示意圖［38］Fig．5 Schematic diagram of orientation of immobilized VHHs with tailor-made modifications［38］

2.4 利用氨基三乙酸定向固定生物識別分子

氨基三乙酸（Nitrilotriacetic acid，NTA）可用于蛋白質(zhì)定向固定化，其原理是NTA分子和金屬離子（如Ni2+、Co2+、Zn2+、Cu2+）之間形成4配位的螯合物，螯合物中金屬離子的另2個游離態(tài)結合位點與六組氨酸（Hexa-histidine，His6）標記蛋白質(zhì)的2個連續(xù)的組氨酸形成配位鍵。His6是融合重組蛋白純化和檢測的常用標簽，可重組到蛋白質(zhì)中的特定位置，因此可在SPR芯片表面均勻地定向固定His6標記蛋白，用于分子識別。Wasserberg等［40］重組了帶有His6標簽的紅色熒光蛋白（TagRFP），用（His6）-Ni2+∶NTA方法在芯片表面固定TagRFP（圖6）。結果表明，固定在芯片表面的TagRFP穩(wěn)定性增加了1個數(shù)量級，且所有TagRFP生物活性位點的取向一致。由于蛋白質(zhì)的3D空間結構較為復雜，帶有1種His6標簽的蛋白質(zhì)可能因NTA螯合物錨點較少而不夠穩(wěn)定，無法確保蛋白質(zhì)在表面定向固定。因此，可在蛋白質(zhì)分子中引入多個His6標簽，但要注意引入的幾個His6標簽必須結合在特定位置，因此對于蛋白質(zhì)結構的設計要求更高。

圖6 NTA定向固定生物受體示意圖［40］Fig．6 Schematic diagram of NTA strategy for oriented immobilization of bioreceptors［40］

為增加蛋白質(zhì)配位復合物的穩(wěn)定性，His6標記蛋白質(zhì)可附著在羧甲基化葡聚糖膜上，并使用交聯(lián)劑固定，使用此方法可獲得穩(wěn)定的高密度定向生物識別分子的SPR芯片。用固定His6標記的人碳酸酐酶檢測藥物4-羧基苯磺酰胺，檢出限為14 nmol/L，具有較高靈敏度［41］。

為提高在SPR生物傳感芯片上固定His6標記蛋白質(zhì)的均勻性和負載量，可使用其他NTA復合物。如將三氨五乙酸硫醇（DPTA）或甲苯二吡咯硫醇（DPM）與形成銅（Ⅱ）的配合物自組裝至SPR金芯片表面，可實現(xiàn)His6標記的Janus激酶2（GST-His6-JAK2）的定向固定［42］。實驗結果表明，與用DPTACu（Ⅱ）定向固定蛋白相比，用DPM-Cu（Ⅱ）配合物定向固定的GST-His6-JAK2蛋白的動力學和熱力學參數(shù)均有較好的提升，主要原因是DPM的空間位阻更小。

3 結論與展望

利用表面化學原理和納米技術設計與制備功能化的芯片，定向固定生物識別分子，是提高SPR生物傳感器檢測靈敏度和選擇性的有效途徑。將來應努力開發(fā)通用的定向固定方法，以廣泛應用于不同的SPR傳感器。

（1）將氧化石墨烯等2D納米材料應用于SPR生物傳感器的研究取得了一些進展［43-44］，但局限于增加芯片表面立方體空間，需引入納米金粒子，以增強SPR響應。要進一步開發(fā)各種2D納米材料，修飾芯片表面，以增加定向固定化生物識別分子的負載量，提高檢測的靈敏度。

（2）利用蛋白本身的結構特性，開發(fā)出針對特定類別的蛋白固定技術。如針對常見的帶有組氨酸殘基的蛋白，捕獲鎳離子常用的配體是三齒配體氨基三乙酸［45-46］，有關二齒配體亞氨基二乙酸的報道并未應用于SPR技術中，而一般認為由于二齒配體相對于三齒配體的空間位阻較小，在蛋白固定中可能會表現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢。

（3）利用生物技術，如定點突變、從頭設計、蛋白質(zhì)融合等重組蛋白［47-48］，在生物識別分子表面引入固定化基團，達到一步定向固定生物識別分子的目的。

總之，SPR技術的發(fā)展不僅使人們能高效快速地篩選藥物，研究生物分子的相互作用，而且有可能提供更靈敏的環(huán)境污染物監(jiān)測、癌癥標志物監(jiān)測和食品安全分析方法。在SPR傳感芯片上有效固定生物分子是一個重要的研究領域。我們相信，隨著各種固定化技術的完善及新技術的出現(xiàn)，SPR技術必將得到更快的發(fā)展，為科學研究和社會經(jīng)濟發(fā)展提供更強大的分析手段。