陳 巖,張潤(rùn)陽(yáng),蔡小雙,王祖斌,廖樹(shù)強(qiáng),劉華敏
(河南工業(yè)大學(xué) 糧油食品學(xué)院,河南鄭州 450001)
中國(guó)是世界上油料需求最大的國(guó)家之一。近年來(lái),中國(guó)油料產(chǎn)量雖連年遞增,但缺口始終很大,中國(guó)每年大豆凈進(jìn)口量約占全球總貿(mào)易量的2/3,對(duì)外進(jìn)口的依賴(lài)性非常大[1]?!坝蜕埂保–yperus esculentusL.)是油莎草的地下塊莖,具有耐鹽堿且含油量高(20%~36%)的特點(diǎn),是集糧、油、牧、飼于一體的經(jīng)濟(jì)作物。其油脂中含有75%以上的不飽和脂肪酸,具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,在油料行業(yè)應(yīng)用前景廣闊[2]。據(jù)報(bào)道,油莎豆具有降血糖、降血脂、保肝以及抗氧化等生理功能[3]。多糖作為油莎豆的主要成分之一,具有重要的生物活性,如免疫調(diào)節(jié)、降血糖、抗病毒等生物活性功能,具有較大的開(kāi)發(fā)意義[4]。
一般在多糖的提取過(guò)程中,多糖中會(huì)混有大量色素,這些色素不僅會(huì)降低多糖的純度,也會(huì)對(duì)多糖的活性和結(jié)構(gòu)鑒定造成嚴(yán)重影響,因此脫色是對(duì)多糖深入研究中必不可少的步驟。多糖脫色的方法有很多,包括活性炭脫色、雙氧水脫色、大孔樹(shù)脂脫色等[5]。不同色素脫除的難易程度和最適合的脫除方法是不同的,因此本實(shí)驗(yàn)采用了多種脫色方法對(duì)油莎豆多糖進(jìn)行脫色,并對(duì)脫色前后的多糖保留率、抗氧化活性、降血糖活性等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定,對(duì)比得出最適宜的脫色方法。而有關(guān)不同脫色方法對(duì)油莎豆多糖活性的影響在文獻(xiàn)中未見(jiàn)報(bào)道,因此本實(shí)驗(yàn)將為油莎豆多糖的深入研究和應(yīng)用提供基礎(chǔ)。
油莎豆采購(gòu)自河北滄州市場(chǎng),油莎豆經(jīng)粉碎后過(guò)40目孔徑篩,索氏抽提后得脫脂油莎豆粉[6];反式-1,2-環(huán)己二胺四乙酸、葡萄糖、濃硫酸、硫酸亞鐵、水楊酸、雙氧水、乙酸鈉、氯化鐵、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)及抗壞血酸等均為分析純;N,N-二甲基對(duì)苯二胺二鹽酸鹽(1,4-Amino-N,N-dimethylaniline,dihydrochloride,DMPD)采購(gòu)于麥克林生化科技有限公司;透析袋(1000 Da),植物總酚(Total Phenols,TP)含量檢測(cè)試劑盒,活性炭粉(CAS:7440-44-0),對(duì)硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(PNPG),D900大孔弱堿性陰離子交換樹(shù)脂,AB-8弱極性大孔吸附樹(shù)脂,XAD-2非極性大孔吸附樹(shù)脂,HPD5000極性大孔吸附樹(shù)脂,D101非極性大孔吸附樹(shù)脂,糖化酶,采購(gòu)于索萊寶科技有限公司。
HL-2B數(shù)顯恒流泵,上海滬西分析儀器有限公司;BSZ-100數(shù)顯自動(dòng)收集器,上海滬西分析儀器有限公司;LGJ18C冷凍干燥機(jī),北京四環(huán)科學(xué)儀器廠(chǎng);UV-6000PC紫外可見(jiàn)分光光度計(jì),上海元析儀器有限公司;1410101酶標(biāo)儀,賽默飛世爾科技公司等。
1.3.1 油莎豆多糖的提取
提取過(guò)程根據(jù)參考文獻(xiàn)[7],將0.05 mol/L碳酸鈉溶液與脫脂油莎豆粉按照1∶15(mL∶g)的液料比混合,攪拌24 h后在4500 r/min的條件下離心20 min,收集上清液后使用6 mol/L鹽酸調(diào)其pH值至4.5,攪拌30 min,在4500 r/min的條件下離心 20 min,舍棄下層的蛋白質(zhì)沉淀,只收集上清液,將上清液抽濾,濾液調(diào)pH值至中性,真空旋蒸濃縮至原體積的1/10,加3倍95%乙醇,4 ℃醇沉3 h[8]。沉淀溶于適量水后用1000 Da的透析袋進(jìn)行流水透析,凍干得到油莎豆粗多糖。
1.3.2 油莎豆多糖的脫色
(1)活性炭脫色。配制1 mg/mL的多糖溶液,加入1%的活性炭,在40 ℃條件下慢速攪拌3 h[9],冰水浴后在4800 r/min條件下離心30 min,取上清液在45 ℃條件下真空旋蒸濃縮,凍干即得活性炭脫色后的多糖。
(2)大孔樹(shù)脂脫色。先對(duì)樹(shù)脂進(jìn)行預(yù)處理[10],然后裝柱。配制30 mg/mL的多糖溶液,分別用5種大孔樹(shù)脂進(jìn)行脫色,蠕動(dòng)泵轉(zhuǎn)速為30 r/min,收集多糖溶液。在45 ℃條件下真空旋蒸濃縮,凍干后即得樹(shù)脂脫色后的多糖。
1.3.3 多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率的測(cè)定
以葡萄糖的濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo),以吸光度為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)[11],采用苯酚硫酸法測(cè)定多糖含量,多糖保留率按式(1)計(jì)算。
式中:m1為脫色后得到的多糖質(zhì)量,mg;m2為脫色前的粗多糖質(zhì)量,mg。
蛋白質(zhì)含量的測(cè)定采用《出口乳、蛋、豆類(lèi)食品中蛋白質(zhì)含量的測(cè)定 考馬斯亮藍(lán)法》(SN/T 3926—2014)考馬斯亮藍(lán)法,蛋白質(zhì)脫除率按式(2)計(jì)算。
1.3.4 色素去除率的測(cè)定
脫色前后的多糖配制成10 mg/mL的多糖溶液,利用紫外分光光度計(jì),在470 nm處測(cè)定吸光度,色素去除率按式(3)計(jì)算[12]。
1.3.5 總酚含量的測(cè)定
使用植物總酚(Total Phenols,TP)含量檢測(cè)試劑盒進(jìn)行測(cè)定,先繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),測(cè)定油莎豆多糖中總酚含量時(shí)取500 μL多糖溶液,加入2.5 mL檢測(cè)試劑盒中的提取液,超聲提取30 min后在4800 r/min的條件下離心10 min,取上清液,配制混合溶液,在760 nm處測(cè)定吸光度,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)進(jìn)行計(jì)算。
1.3.6 抗氧化活性的測(cè)定
(1)羥基自由基清除率的測(cè)定。分別取10 μL 0.1 mg/mL、0.5 mg/mL、1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、 3.0 mg/mL、4.0 mg/mL和5.0 mg/mL的多糖樣品溶液, 加入50 μL 1.8 mmol/L硫酸亞鐵溶液、50 μL 1.8 mmol/L 水楊酸乙醇溶液,再加入50 μL 0.3 %雙氧水啟動(dòng)反應(yīng),鋁箔紙封蓋,在37 ℃烘箱反應(yīng)35 min,于510 nm處測(cè)定吸光度[12]。以蒸餾水代替多糖樣品溶液為空白,以蒸餾水代替雙氧水為對(duì)照。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,按式(4)進(jìn)行計(jì)算。
(2)DPPH自由基清除率的測(cè)定。以無(wú)水乙醇為溶劑,配制0.1 mmol/L的DPPH溶液,取25 μL多糖溶液和50 μL 0.1 mmol/L DPPH溶液,避光反應(yīng) 30 min,于520 nm處測(cè)定吸光度。以無(wú)水乙醇代替多糖樣品溶液為空白,以無(wú)水乙醇代替DPPH溶液為對(duì)照[13]。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,按式(5)進(jìn)行計(jì)算。
(3)DMPD自由基清除率的測(cè)定。將1 mL 0.05 mol/L DMPD溶液與100 mL 0.2 mol/L醋酸鹽緩沖液混合均勻,加入0.2 mL 0.05 mol/L FeCl3溶液?jiǎn)?dòng)反應(yīng),制備成DMPD+溶液。取25 μL多糖溶液和 200 μL DMPD+溶 液,在 室 溫 下 反 應(yīng)10 min,于 510 nm處測(cè)定吸光度。以緩沖液代替多糖樣品溶液為空白,以緩沖液代替DMPD+溶液為對(duì)照[14]。以維生素C作為陽(yáng)性對(duì)照,按式(6)進(jìn)行計(jì)算。
1.3.7 α-葡萄糖苷酶抑制率的測(cè)定
取5 μL多糖溶液、25 μL 500 U/mL α-葡萄糖苷酶、140 μL 0.1 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH=6.8)混合,在37 ℃烘箱內(nèi)反應(yīng)5 min,再加入25 μL 24 mmol/L PNPG溶液,在37 ℃烘箱內(nèi)反應(yīng)15 min,最后加入100 μL 0.2 mol/L Na2CO3終止液,于405 nm處測(cè)定吸光度。以蒸餾水代替樣品溶液為空白,以蒸餾水代替α-葡萄糖苷酶為對(duì)照[15]。按式(7)進(jìn)行計(jì)算。
在多糖的提取過(guò)程中,常會(huì)有大量色素溶出并混入多糖,為了避免這些色素對(duì)多糖成品色澤、穩(wěn)定性、功能性的影響,一般要進(jìn)行脫色處理,且脫色的重要原則是多糖保留率高、色素去除率高。如圖1所示,AB-8脫色后的多糖保留率最高(71.0%),D900脫色后的多糖保留率最低(11.3%)。這是因?yàn)椴捎玫拇罂讟?shù)脂極性不同,D900是大孔弱堿性陰離子交換樹(shù)脂,其脫色后多糖保留率較低,這與D900的表面電特性和氫鍵相互作用有關(guān)[16]。AB-8是弱極性大孔吸附樹(shù)脂,它比非極性大孔吸附樹(shù)脂XAD-2和D101表現(xiàn)出更高的多糖保留率,可能是因?yàn)锳B-8在脫色過(guò)程中多糖溶液中的色素和蛋白質(zhì)易受到強(qiáng)偶極離子力的作用而被吸附,導(dǎo)致AB-8對(duì)多糖的吸附較少[17]。XAD-2是一種非極性的大網(wǎng)格樹(shù)脂,以二乙烯苯為骨架結(jié)構(gòu),對(duì)于一些性質(zhì)相近的分子和多種環(huán)狀芳香族化合物有很強(qiáng)的吸附能力。與XAD-2類(lèi)似,D101大孔吸附樹(shù)脂是苯乙烯型非極性共聚體,對(duì)于不帶極性的有機(jī)化合物有良好的吸附效果。但是二者孔徑相差很大,XAD-2的孔徑一般在0.9 μm左右,而D101的孔徑只有9~10 nm。因此,XAD-2的吸附量更大,導(dǎo)致多糖保留率低于D101。
圖1 不同脫色方法對(duì)油莎豆多糖保留率的影響
從天然產(chǎn)物中提取的多糖,常含有蛋白質(zhì),給后續(xù)多糖的分析帶來(lái)困難,大孔樹(shù)脂和活性炭在對(duì)多糖脫色的過(guò)程中還可以脫除一定量的蛋白質(zhì),因此蛋白質(zhì)脫除率也是衡量脫色效果的重要指標(biāo)。脫色前油莎豆多糖中的蛋白質(zhì)含量為1.7%,如圖2所示,AB-8脫色后的多糖蛋白質(zhì)脫除率最高(91.1%),其次是XAD-2(88.5%),不同方法脫色后的多糖蛋白質(zhì)脫除率存在差異,這與樹(shù)脂的物理結(jié)構(gòu)和被吸附物質(zhì)的物理和化學(xué)特性有關(guān)[18]。D101和XAD-2都是非極性大孔吸附樹(shù)脂,而D101脫色后的多糖蛋白質(zhì)脫除率最低(21.4%),這是因?yàn)镈101比XAD-2的孔徑小,導(dǎo)致D101對(duì)蛋白質(zhì)的吸附量少,因此蛋白質(zhì)脫除率較低。活性炭一般被認(rèn)為具有良好的脫色能力,在本研究中活性炭對(duì)多糖中的蛋白質(zhì)也有一定的脫除效果,可能因?yàn)槎嗵侵杏幸徊糠稚睾偷鞍踪|(zhì)以結(jié)合狀態(tài)存在,活性炭在吸附色素的同時(shí)脫除了部分蛋白質(zhì)[19]。
圖2 不同脫色方法對(duì)油莎豆多糖中蛋白質(zhì)脫除率的影響
如圖3所示,活性炭脫色后的多糖色素去除率最高(84.5%),其次是AB-8(75.2%),而HPD5000 脫色后的多糖色素去除率最低(60.1%)。活性炭具有較高的色素去除率,可能是由于其表面的碳原子是不飽和碳,它能與其他的原子或基團(tuán)結(jié)合形成大量的化學(xué)基團(tuán),比如羥基、羧基、酯基、羰基和氨基等,因此多糖中的色素容易被活性炭吸附,此外,活性炭因立體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)而具有較大的比表面積,這也有利于它對(duì)色素的吸附作用[20-21]。AB-8是弱極性大孔吸附樹(shù)脂,多糖中的色素可能大多數(shù)為弱極性色素,易被AB-8吸附,導(dǎo)致AB-8脫色后的多糖色素去除率高。
圖3 不同脫色方法對(duì)油莎豆多糖色素去除率的影響
同時(shí)對(duì)脫色前后10 mg/mL的油莎豆多糖溶液進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描,如圖4所示,脫色后的多糖溶液最大吸收波長(zhǎng)均小于脫色前(354 nm),這可能是因?yàn)槊撋^(guò)程中多糖、蛋白質(zhì)、色素、酚類(lèi)物質(zhì)等被不同程度地吸附脫除,導(dǎo)致脫色后的最大吸收波長(zhǎng)減小?;钚蕴亢虳101、HPD5000脫色后的多糖溶液最大吸收波長(zhǎng)分別為233 nm、243 nm、237 nm,與脫色前的相差較大,可能因?yàn)檫@些方法脫色后多糖中的酮類(lèi)或酚類(lèi)物質(zhì)損失較多[22],導(dǎo)致最大吸收波長(zhǎng)與脫色前的存在較大差別。此外,除了活性炭,脫色前后的多糖溶液在200~400 nm存在兩個(gè)吸收峰,而活性炭只在233 nm存在最大吸收峰,這可能是因?yàn)槎嗵侵械纳匚辗逶?45 nm左右,而活性炭脫色后的多糖色素去除率較高,導(dǎo)致脫色后的多糖溶液在345 nm左右未出峰。
圖4 脫色前后油莎豆多糖溶液的全波長(zhǎng)掃描
酚類(lèi)物質(zhì)大多具有抗氧化、抗癌、抗逆等作用[23]。如圖5所示,脫色后的油莎豆多糖中總酚含量低于脫色前,其中D900脫色后的多糖總酚含量損失最少,XAD-2脫色后的多糖總酚含量損失較多,XAD-2是非極性大孔吸附樹(shù)脂,可能因?yàn)槎嗵侵械姆宇?lèi)物質(zhì)大多為非極性,XAD-2對(duì)其有較強(qiáng)的吸附作用,導(dǎo)致脫色后酚類(lèi)物質(zhì)損失較多。與多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率的情況相似,同樣也是非極性大孔吸附樹(shù)脂的D101由于孔徑較小,對(duì)酚類(lèi)物質(zhì)的吸附量比XAD-2少,導(dǎo)致總酚含量大于XAD-2。同時(shí),因?yàn)榛钚蕴繉?duì)羰基、羧基、內(nèi)酯基、酚羥基等有一定的吸附作用[24],導(dǎo)致活性炭脫色后的多糖酚類(lèi)物質(zhì)損失較多。此外,與靖邊黑豆的總酚含量(5.1 mg/g)[25]、灰棗的總酚含量(8.8 mg/g)[26]相比,脫色前的油莎豆多糖中總酚含量較高(10.6 mg/g),表明油莎豆多糖具有一定營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和生物活性。
圖5 不同脫色方法對(duì)油莎豆多糖中總酚含量的影響
過(guò)量的羥基自由基是造成生物有機(jī)體氧化損傷的原因之一,并能對(duì)人體造成一定程度的危害[27]。如圖6所示,隨著油莎豆多糖濃度的增加,羥基自由基清除率也不斷增加。脫色后多糖的羥基自由基清除率總體上大于脫色前,這是脫色后多糖得到了純化和富集所導(dǎo)致的,同時(shí)也說(shuō)明了油莎豆多糖比其所含有的色素有更強(qiáng)的羥基自由基清除率[28]。多糖濃度為5 mg/mL時(shí),活性炭脫色后的多糖羥基自由基清除率為99.6%,這可能是因?yàn)榛钚蕴棵撋蟮亩嗵巧厝コ首罡?,多糖暴露出了更多的活性位點(diǎn)[12],使其對(duì)羥基自由基有良好的清除效果。相對(duì)于其他的脫色方法,D900脫色后的多糖羥基自由基清除率較低,這是因?yàn)镈900脫色后的多糖保留率低,較多的多糖被D900吸附,導(dǎo)致脫色后的多糖對(duì)羥基自由基的清除效果較差。D101和XAD-2都是非極性大孔吸附樹(shù)脂,且D101脫色后的多糖保留率大于XAD-2,但當(dāng)多糖濃度為0.5~4.0 mg/mL時(shí),D101脫色后的多糖羥基自由基清除率小于XAD-2,這可能和脫色后的多糖純度及其空間構(gòu)象等有關(guān)[29]。此外,在測(cè)定范圍內(nèi),脫色前后的油莎豆多糖清除羥基自由基的能力大于維生素C,表明其具有較強(qiáng)的清除羥基自由基的能力。
圖6 不同脫色方法對(duì)油莎豆多糖清除羥基自由基能力的影響
如圖7所示,隨著油莎豆多糖濃度的增加,DPPH自由基清除率也不斷增加。脫色后多糖的DPPH自由基清除率明顯小于脫色前,這可能是脫色前的粗多糖和色素、蛋白質(zhì)、酚等物質(zhì)的共同作用[30],使得DPPH自由基清除率較高,而脫色后這些物質(zhì)減少,DPPH自由基清除率也減小。多糖濃度為 5 mg/mL時(shí),AB-8脫色后的多糖DPPH自由基清除率較大(84.1%),這可能是因?yàn)锳B-8脫色后的多糖保留率高,活性基團(tuán)損失少,使它對(duì)DPPH自由基的清除效果比其他脫色方法更好。HPD5000脫色后的多糖保留率僅次于AB-8,但HPD5000脫色后多糖的DPPH自由基清除率最?。?2.6%),可能因?yàn)槠涿撋蟮亩嗵强偡雍枯^少,而酚類(lèi)物質(zhì)有較強(qiáng)的抗氧化活性[23]。此外,脫色前的油莎豆多糖濃度在3~5 mg/mL時(shí),DPPH自由基清除率和維生素C相當(dāng),表明脫色前的油莎豆多糖具有良好的DPPH自由基清除能力。
圖7 不同脫色方法對(duì)油莎豆多糖清除DPPH自由基能力的影響
如圖8所示,隨著油莎豆多糖濃度的增加,DMPD自由基清除率也不斷增加。除D900外,其他方法脫色后多糖的DMPD自由基清除率總體大于脫色前,與油莎豆多糖對(duì)羥基自由基的清除率類(lèi)似,這可能是脫色后多糖得到了純化和富集的結(jié)果[28]。多糖濃度為5 mg/mL時(shí),活性炭脫色后的多糖DMPD自由基清除率最大(81.3%),D900脫色后的多糖DMPD自由基清除率最?。?5.5%),不同方法脫色后的多糖DMPD自由基清除率存在一定差異,這和多糖的組成和結(jié)構(gòu)有很大關(guān)系,其因素包括單糖組成、糖苷鍵種類(lèi)、糖醛酸的含量等[31]。在測(cè)定的濃度范圍內(nèi),D900脫色后的多糖DMPD自由基清除率始終最小,這是因?yàn)镈900脫色后的多糖保留率較低,脫色過(guò)程中有較多的多糖損失,損失的多糖可能具有較強(qiáng)的DMPD自由基清除率[30]。脫色后的多糖濃度為5 mg/mL時(shí),DMPD自由基清除率最大為81.3%,對(duì)DMPD自由基有良好的清除 效果。
圖8 不同脫色方法對(duì)油莎豆多糖清除DMPD自由基能力的影響
α-葡萄糖苷酶抑制劑可延緩或者抑制葡萄糖在腸道內(nèi)的吸收,是治療糖尿病的理想物質(zhì)[32]。如圖9所示,隨著油莎豆多糖濃度的增加,α-葡萄糖苷酶抑制率增長(zhǎng)緩慢。除XAD-2外,脫色后多糖的α-葡萄苷糖酶抑制率總體小于脫色前,在測(cè)定的濃度范圍內(nèi),XAD-2脫色后的多糖α-葡萄糖苷酶抑制率最大,可能因?yàn)閄AD-2脫色后多糖中與α-葡萄糖苷酶的作用位點(diǎn)暴露出來(lái),兩者通過(guò)相互作用結(jié)合形成了復(fù)合物,同時(shí)α-葡萄糖苷酶的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)展開(kāi),使多糖對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用變得容易[31]。除XAD-2外,其他方法脫色后的多糖α-葡萄糖苷酶抑制率較小,這可能是因?yàn)槊撋蠖嗵侵械狞S酮類(lèi)物質(zhì)減少,而這類(lèi)物質(zhì)可以通過(guò)非共價(jià)作用和蛋白質(zhì)結(jié)合形成復(fù)合物,脫色前多糖中的黃酮類(lèi)物質(zhì)含量相對(duì)較多,容易通過(guò)非共價(jià)作用和α-葡萄糖苷酶結(jié)合抑制酶的活性[33]。
圖9 不同脫色方法對(duì)油莎豆多糖抑制α-葡萄糖苷酶的影響
本研究在提取油莎豆多糖后,選用6種不同的方法進(jìn)行脫色,比較脫色效果、脫色前后多糖的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制率。結(jié)果表明,AB-8綜合效果最佳,脫色后多糖保留率和蛋白質(zhì)脫除率分別為71.0%、91.1%,色素去除率為75.2%,總酚含量為8.5 mg/mL,多糖濃度為5 mg/mL時(shí),羥基自由基清除率、DPPH自由基清除率和DMPD自由基清除率分別為99.6%、84.1%、73.3%,α-葡萄糖苷酶抑制率為42.2%。脫色前后的油莎豆多糖具有一定的抗氧化活性和α-葡萄糖苷酶抑制力,且隨著多糖濃度的增加清除率和抑制力也不斷增加,其中脫色后的多糖羥基自由基清除率和DMPD自由基清除率大于脫色前,而DPPH自由基清除率和α-葡萄糖苷酶抑制率總體上小于脫色前。此外,油莎豆多糖清除羥基自由基的能力較強(qiáng),并且總酚含量較高,表明油莎豆多糖在未來(lái)有望作為天然的抗氧化劑應(yīng)用于食品和醫(yī)療行業(yè),具有廣闊的應(yīng)用前景。