酒輕飲對模型生物解酒護肝和胃腸 保護作用的研究

岳林濤，李 英，張永杰，魏 芳，李 艷，李安平

（1.山西振東五和醫(yī)養(yǎng)堂股份有限公司，山西長治 046000；2.山西振東制藥股份有限公司，山西長治 046000）

酒，是由一些發(fā)酵微生物發(fā)酵糖類制成的一種飲料。其主要成分是乙醇[1]。白酒中含有多種風味化合物，包括酯類、醇類、酮類、醛類、酸類、萜烯類及含硫化合物等[2]。飲酒的關(guān)鍵是量的把握。酒帶來的危害主要歸因于酒精代謝中乙醛的產(chǎn)生，酒精在體內(nèi)的代謝過程中，大部分酒精是在肝臟中被酶分解代謝[3]。科學研究表明，短期大量攝入酒精易導致急性酒精中毒，長期酗酒則會導致慢性酒精中毒，引起酒精性肝損傷，輕則酒精性脂肪肝，重則肝硬化、肝細胞癌、甚至死亡[4]。

我國飲酒歷史長久，對應的也有很多解酒護肝的中藥材。桑椹味甘、酸，性寒，歸肝、腎經(jīng)；且《本草綱目》中記載桑椹具有“搗汁飲，解酒中毒；釀酒服，利水氣，消腫”的功效[5]。枸杞子味甘、性平，歸肝、腎經(jīng)[6]?，F(xiàn)代藥理學研究表明，枸杞子具有抗氧化、抗衰老、保肝明目等藥理活性[7]。葛根性涼，味甘辛，歸脾、胃、肺經(jīng)，有解表退熱、升陽止瀉及解酒之功效，具有神經(jīng)保護和解酒護肝等作用；枳椇子有止渴除煩、利尿解酒之功效[8-9]。代謝組學闡明枳椇子通過調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝、三羧酸循環(huán)等代謝通路預防腎上腺腦白質(zhì)營養(yǎng)不良（Adrenoleukodystrophy，ALD）[9-10]。上述原料配伍組合菊花、甘草及蜂蜜，各原料協(xié)同增效，既能緩解醉酒癥狀，又能保護胃腸道和肝臟等。以上述藥食同源中草藥為主要原料，經(jīng)過提取濃縮口味調(diào)整配制成一種植物飲料，對其功效進行 驗證。

1 實驗動物

動物模型常用嚙齒動物，如昆明小鼠、SD大鼠等[11]。而近年來，因與人類基因同源性高（87%）、易于進行轉(zhuǎn)基因操作等特點，斑馬魚成為了一種公認的新型模式生物[12]。斑馬魚體小、生殖周期短、繁殖力強、易飼養(yǎng)、發(fā)育快和成本低，是大鼠的 1/1000；對DMSO耐受，易通過皮膚和腔道吸收藥物，最大限度地保留了在體活體的系統(tǒng)性[13]。與傳統(tǒng)小鼠實驗評價相比較，使用斑馬魚模型進行功效評價，實驗周期縮短，克服了在體動物實驗強度大、周期較長、存在個體差異的缺陷，兼顧了在體動物模型近似人的整體生物反應，已被國內(nèi)學者廣泛 接受[13]。

1.1 實驗小鼠

選 用KM小 鼠150只，SPF級，雄 性，體 重17～20 g，購自西安交通大學醫(yī)學部動物實驗中心，許可證編號：SCXK(陜)2018-001，批號：20210419， 質(zhì)量合格證編號NO.1431。

1.2 斑馬魚

轉(zhuǎn)基因中性粒細胞綠色熒光斑馬魚，年齡為受精后3 d（3dpf），用于胃腸道黏膜保護作用評價的最大檢測濃度，即最小中毒濃度（Minimum Toxic Concentration，MTC）測定及其作用評價；野生型AB品系斑馬魚，年齡為受精后3 d（3 dpf），用于酒輕飲ALT活力降低作用評價最大檢測濃度（MTC）測定及其作用評價；年齡為受精后5 d（5 dpf），用于酒輕飲解酒作用最大檢測濃度（MTC）測定及其作用評價。

斑馬魚以自然成對交配繁殖方式進行，每實驗組為30尾，均飼養(yǎng)于28 ℃的養(yǎng)魚用水中，由杭州環(huán)特生物科技股份有限公司養(yǎng)魚中心繁殖提供，實驗動物使用許可證號為SYXK（浙）2012-0171，飼養(yǎng)管理符合國際AAALAC認證（001458）的要求[14]。

2 試劑與設備

試劑：AST、ALT測試盒（批號：20210121、20210122，南京建成）；潑尼松（批號C10016501，上海麥克林）；“RU21”（批號：25747，美國精神科學）；美他多辛（批號200401，浙江震元制藥）；三 硝 基 苯 磺 酸（Trinitro-Benzene-Sulfonic Acid，TNBS，批號：SLBT1675，Sigma）；無水乙醇（批號為20200825，國藥集團化學試劑）。

設備：旋渦混合儀（常州市萬科豐儀器，XH-T）； 臺式低速離心機（長沙維爾康湘鷹離心機，TDZ5-WS）；精密電子天平（CP214，OHAUS）；CCD相機 （VertA1，上海土森視覺科技）；行為分析儀（ZebraLab3.11， ViewPoint）；電動聚焦連續(xù)變倍熒光顯微鏡（AZ100，Nikon）；多功能酶標儀（SPARK，TECAN，Switzerland）； 體視顯微鏡（SZX7，OLYMPUS）。

3 功效實驗

3.1 小鼠實驗

小鼠分為5組，分別為正常組，模型組，低、中、高劑量組（2.5 mg/kg、5.0 mg/kg、7.5 mg/kg），按相應劑量灌胃30 d，末次給藥后測定各項指標。酗酒模型在預防性給藥7 d后，每天給酒給藥，酒灌胃量14 mL/kg bw。測定小鼠的質(zhì)量，觀察動物的皮膚毛發(fā)、情緒反應、行為狀態(tài)、活躍情況等。測前禁食16 h，按要求測定各項指標。

3.1.1 肝臟質(zhì)量指數(shù)

稱量小鼠空腹體重及肝臟質(zhì)量，計算肝臟質(zhì)量指數(shù)。

3.1.2 生化指標測定

末次給藥結(jié)束后，各組小鼠眼球取血，制備血清，依照AST、ALT測試盒說明方法進行測定。

3.1.3 解酒醒酒實驗

解酒：給藥30 min后，每只小鼠灌胃給予56度紅星二鍋頭14 mL/kg。醒酒：給酒30 min后，每只小鼠灌胃受試物。各自觀察并記錄從第1次給酒至翻轉(zhuǎn)反射消失及恢復的時間。正常組按實驗先后順序灌胃二鍋頭及等量生理鹽水。翻轉(zhuǎn)時間：灌酒完成至翻正反射消失的時間；恢復時間：翻正反射消失至翻正反射再次出現(xiàn)的時間。

3.2 斑馬魚實驗

3.2.1 胃腸黏膜保護作用評價

隨機選取360尾3 dpf轉(zhuǎn)基因中性粒細胞綠色熒光斑馬魚于六孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚。除正常組外，其余各實驗組均水溶給予TNBS建立斑馬魚胃腸黏膜損傷模型。28 ℃處理2 d后，移除TNBS，分別水溶給予酒輕飲3.91 μL/mL、 7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、 125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1000 μL/mL濃度，陽性組潑尼松15.0 μg/mL濃度，同時設置模型組和正常組（養(yǎng)魚用水處理），每孔容量為3 mL。處理結(jié)束后，觀察統(tǒng)計各實驗組斑馬魚的死亡數(shù)量和毒性反應情況，確定酒輕飲的MTC；取MTC及以下共3個濃度組：陽性組、模型組和正常組，每組隨機選取10尾斑馬魚在熒光顯微鏡下拍照并保存圖片，用NIS-Elements D3.20高級圖像處理軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚腸腔面積（A），以腸腔面積的統(tǒng)計學分析結(jié)果評價酒輕飲胃腸道黏膜保護作用。在拍攝分辨率及相關(guān)參數(shù)相同情況下，像素點越多，面積越大，故用像素作為單位，不再計算實際面積。

3.2.2 解酒作用評價

隨機選取360尾5 dpf野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚，水溶給予無水乙醇建立斑馬魚興奮期醉酒模型。分別水溶給予酒輕飲3.91 μL/mL、7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1000 μL/mL濃 度，陽 性 組“RU21” 100 μg/mL濃度，同時設置模型組和正常組（養(yǎng)魚用水處理斑馬魚），每孔容量為3 mL。處理結(jié)束后，觀察統(tǒng)計各實驗組斑馬魚的死亡數(shù)量和毒性反應情況，確定酒輕飲的MTC；取MTC及以下共3個濃度組、陽性組、正常組和模型組，每組隨機選取12尾斑馬魚，用行為分析儀軟件分析并采集數(shù)據(jù)，分析斑馬魚總運動距離（S），以總運動距離的統(tǒng)計學分析結(jié)果評價酒輕飲解酒作用。

3.2.3 ALT活力降低作用評價

隨機選取360尾3 dpf野生型AB品系斑馬魚于六孔板中，每孔（實驗組）均處理30尾斑馬魚。分別水溶給予酒輕飲3.91 μL/mL、7.81 μL/mL、15.6 μL/mL、 31.3 μL/mL、62.5 μL/mL、125 μL/mL、250 μL/mL、500 μL/mL和1000 μL/mL濃度，陽性組美他多辛149 μg/mL濃度，同時設置模型組和正常組（養(yǎng)魚用水處理斑馬魚），每孔容量為3 mL。除正常組外，其余各實驗組均水溶給予無水乙醇建立斑馬魚酒精性肝損傷模型。處理結(jié)束后，觀察統(tǒng)計各實驗組斑馬魚的死亡數(shù)量和毒性反應情況，確定酒輕飲的MTC；取MTC及以下共3個濃度組、陽性組、模型組和正常組，用ALT試劑盒通過多功能酶標儀檢測斑馬魚體內(nèi)ALT活力（H），以ALT活力的統(tǒng)計學分析結(jié)果評價酒輕飲ALT活力降低作用。

3.3 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)以mean±SE表示，采用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理，采用方差分析及LSD-t檢驗。

4 實驗結(jié)果

4.1 小鼠實驗結(jié)果

小鼠實驗結(jié)果如表1所示。①肝臟指數(shù)。模型組與正常組比較存在顯著性差異。劑量組與模型組比較，中劑量組存在差異性，低、高劑量組無統(tǒng)計學意義。②ALT、AST活性。模型組與正常組比較，無統(tǒng)計學意義。③解酒醒酒。劑量組與正常組比較，高劑量組解酒恢復時間和中、高劑量組醒酒恢復時間存在差異性。

表1 小鼠實驗結(jié)果

4.2 斑馬魚實驗結(jié)果

4.2.1 MTC

由表2可知，在胃腸道黏膜保護作用實驗中，酒輕飲濃度達到62.5 μL/mL時，斑馬魚并未出現(xiàn)明顯異常，高于此濃度后，死亡率直線上升；在解酒作用實驗中，酒輕飲濃度達到31.3 μL/mL時，斑馬魚出現(xiàn)異常，較模型組狀態(tài)差，高于250 μL/mL濃度后出現(xiàn)死亡，死亡率直線上升；在ALT活力降低作用實驗中，酒輕飲濃度達到15.6 μL/mL時，并未出現(xiàn)明顯異常，高于此濃度后，死亡率直線上升。可知本實驗條件下，胃腸道黏膜保護作用評價MTC為62.5 μL/mL；解酒作用評價MTC為15.6 μL/mL；ALT活力降低作用評價MTC為15.6 μL/mL。

表2 酒輕飲濃度摸索實驗結(jié)果

4.2.2 作用結(jié)果

根據(jù)MTC設計濃度梯度進行實驗，見圖1，陽性對照組、31.3 μL/mL及62.5 μL/mL組別均可顯著降低斑馬魚腸腔面積，可提升腸胃黏膜保護作用。由表3可知，與模型組相較而言，陽性對照及劑量組均可提升總運動距離，興奮期明顯延長，解酒效果明顯；降低ALT活力，對酒精引起的臟器保護作用明顯。

表3 酒輕飲作用（未見異常組）實驗結(jié)果

圖1 酒輕飲處理后斑馬魚腸腔面積典型圖

5 結(jié)論與討論

酒精中毒是指乙醇飲用過量而導致的機體損傷，尤其作用于神經(jīng)中樞和肝臟[11]。急性酒精中毒過程常分為3個階段，即興奮期、共濟失調(diào)期、昏睡期[11]。興奮期采用斑馬魚模型，MTC檢測可清楚分辨興奮期，準確確定劑量，對興奮期斑馬魚總運動距離和ALT活性進行檢測?；杷诓捎眯∈竽Ｐ?，進行肝指數(shù)、ALT、AST和翻正反射消失實驗，此實驗是觀察處于異常體位的動物是否能恢復正常體位來確定動物的反射狀況，是判斷動物是否醉酒的經(jīng)典方法[11]。肝組織作為解酒的重要器官。酒精引發(fā)肝脂肪變性，導致肝指數(shù)上升，肝組織中的ALT、AST酶流入血液，檢測此3項可反應機體對酒精的處理情況及肝保護情況。乙醇刺激可導致胃腸黏膜損傷，長期過量刺激可導致急慢性胃腸炎，實驗采用斑馬魚胃腸黏膜損傷模型，研究對于胃腸黏膜的保護 作用。

由上述實驗結(jié)果可知，在興奮期，劑量組與模型組比較，斑馬魚總運動距離明顯降低，斑馬魚進入興奮期推遲，機體解酒能力提升；體內(nèi)ALT活力檢測結(jié)果7.81 μL/mL 及15.6 μL/mL劑量組明顯下降，斑馬魚肝損傷程度下降，ALT活力降低作用明顯。昏睡期，中高劑量組，翻正反射恢復時間存在顯著性縮短，體內(nèi)轉(zhuǎn)化乙醇能力增強。ALT、AST活力無顯著性。肝指數(shù)中劑量組明顯下降，肝臟器官病變腫大情況減弱。胃腸保護作用研究中，斑馬魚腸腔面積變化明顯，酒輕飲對于TNBS引起的胃腸黏膜損傷有很好的保護作用。

本實驗在不同實驗方向選用動物品種和模型不同，期望從多角度研究酒輕飲的作用。但結(jié)果不盡人意，未達到預期效果，顯著性不同。酒輕飲對于小鼠模型檢測效果不佳，生化檢測指標無顯著性，行為檢測結(jié)果存在顯著性，但劑量關(guān)聯(lián)不明確，由數(shù)據(jù)看，可能存在劑量設計不合理問題，待后續(xù)繼續(xù)研究；對3種模型斑馬魚的保護作用顯著，與斑馬魚同尾產(chǎn)出，個體差異小結(jié)果效果顯著相符，但作用效果與劑量關(guān)系關(guān)聯(lián)不明確[13]。本實驗方案雖結(jié)合小鼠及斑馬魚動物模型，但小鼠及斑馬魚無法相互驗證，斑馬魚實驗在酒精中毒興奮期進行檢測，而小鼠實驗翻正反射在昏睡期進行。由斑馬魚實驗可知，酒輕飲可以起到保護胃腸黏膜，解酒護肝的功效，但在毒理和量效關(guān)系上需進一步進行研究。