微波消解-原子熒光法測(cè)定牛乳中 硒含量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)

周 歡，夏忠悅，錢成林，范光彩，黃漫蓉

（新希望乳業(yè)股份有限公司，四川成都 610023）

硒具有提高人體免疫力、消除自由基、保護(hù)心臟和肝臟等功能，但是我國(guó)大部分地區(qū)處于低硒帶，因此加強(qiáng)對(duì)硒的攝入比較重要[1]。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)機(jī)硒（比如亞硒酸鈉等）不易被人體吸收，生物有效性低且毒副作用較大，而存在于生物體中的硒（尤其是植物來(lái)源的有機(jī)硒）是人們攝取硒的主要來(lái)源[2-3]。牛奶中含有痕量硒，對(duì)牛奶進(jìn)行硒強(qiáng)化有利于人體吸收。因此，快速準(zhǔn)確地測(cè)定牛奶中的硒含量具有重大意義。目前測(cè)定牛奶中的硒含量可采用濕法消解或微波消解結(jié)合原子熒光法、原子吸收光譜法[4]，其中微波消解操作簡(jiǎn)單、快速，被廣泛應(yīng)用于測(cè)定食品中的硒含量，但是標(biāo)準(zhǔn)中對(duì)趕酸溫度與時(shí)間等并未進(jìn)行說(shuō)明，因此有必要對(duì)條件進(jìn)行優(yōu)化。本研究用硝酸∶過氧化氫（4∶1）消化樣品，對(duì)實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化，利用氫化物發(fā)生-原子熒光光譜法（Hydrid Generation-Atomic Fluorescence Spectrometry，HG AFS）同時(shí)測(cè)定了不同產(chǎn)地牛奶中硒的含量，為快速準(zhǔn)確測(cè)定牛奶中的硒含量提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生牛乳（四川新華西乳業(yè)有限公司）；優(yōu)級(jí)純鹽酸（HCl）；進(jìn)口分析純硝酸（HNO3）；優(yōu)級(jí)純雙氧水（H2O2）；優(yōu)級(jí)純鐵氰化鉀[K3Fe(CN)6]；優(yōu)級(jí)純氫氧化鈉（NaOH）；優(yōu)級(jí)純硼氫化鈉（NaBH4）。

1.2 儀器與設(shè)備

Kylin-S12型原子熒光光度計(jì)（北京吉天儀器有限公司）；TOPEX+型微波消解儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；趕酸儀（上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司）；UPR-Ⅱ-20 L型超純水儀（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

（1）硒標(biāo)準(zhǔn)中間液（10 mg/L）。準(zhǔn)確量取濃度為 1000 mg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL于100 mL容量瓶中，用5%鹽酸定容至刻度，混勻制成10 mg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)中間液。

（2）硒標(biāo)準(zhǔn)使用液（1 mg/L）。準(zhǔn)確量取濃度為 10 mg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)中間液10 mL于100 mL容量瓶中，用5%鹽酸定容至刻度，混勻制成1 mg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)使用液。

（3）硒上機(jī)工作液（20 μg/L）。準(zhǔn)確量取濃度為 1 mg/L的硒標(biāo)準(zhǔn)使用液2 mL于100 mL容量瓶中，加入5 mL鐵氰化鉀（100 g/L），用5%鹽酸定容至刻度，混勻制成20 μg/L的硒上機(jī)工作液。

1.3.2 樣品前處理

準(zhǔn)確稱取1.00 g（精確至0.0001 g）混合均勻的各牛奶樣品置于消解罐中加入4 mL硝酸，1 mL雙氧水，振搖混合均勻，于微波消解儀中消化，待消解結(jié)束，將消解罐放在趕酸儀上繼續(xù)加熱至近干，加5 mL鹽酸溶液（6 mol/L），繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)榍辶翢o(wú)色并伴有白煙出現(xiàn)，冷卻，轉(zhuǎn)移至25 mL比色管中，加入 2.5 mL鐵氰化鉀溶液（100 g/L），純水定容，混勻待測(cè)，同時(shí)做空白實(shí)驗(yàn)[5]。

1.3.3 微波消解程序

微波消解程序見表1。

表1 微波消解程序

1.3.4 儀器參數(shù)

負(fù)高壓340 V；燈電流100 mA；原子化溫度800 ℃；爐高8 mm；載氣流速500 mL/min；屏蔽氣流速1000 mL/min；測(cè)量方式為標(biāo)準(zhǔn)曲線法；讀數(shù)方式為峰面積；延遲時(shí)間1 s；讀數(shù)時(shí)間15 s；加液時(shí)間8 s；進(jìn)樣體積1 mL。

1.3.5 條件優(yōu)化

（1）通過比對(duì)牛奶試樣在微波消解時(shí)最高溫度（200 ℃）的保溫時(shí)間，驗(yàn)證試樣在經(jīng)過消解后硒的檢測(cè)回收率。

（2）本實(shí)驗(yàn)參考常見的趕酸溫度及相關(guān)耗材的最高耐受溫度，對(duì)比選用120 ℃、150 ℃和180 ℃ 3個(gè)趕酸溫度，同步趕酸30 min，測(cè)定硒的加標(biāo)回收率。

（3）相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道原子熒光檢測(cè)載流劑濃度差異對(duì)檢測(cè)影響較大，本實(shí)驗(yàn)選用5%和10%兩組載流劑濃度進(jìn)行對(duì)比實(shí)驗(yàn)。

1.3.6 優(yōu)化后方法的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和測(cè)試

采用優(yōu)化后的方法測(cè)定2種樣品，觀察其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差和加標(biāo)回收率，測(cè)試該方法的穩(wěn)定性；采用該方法對(duì)不同產(chǎn)地生牛乳的硒含量進(jìn)行測(cè)定，比較各產(chǎn)地生牛乳中硒含量的高低。

2 結(jié)果與分析

2.1 消解時(shí)間優(yōu)化

表2為200 ℃下消解不同時(shí)間的生牛乳中硒含量的測(cè)定結(jié)果。由表2可知，隨著消解時(shí)間的減少，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差顯著降低（P＜0.05），回收率明顯增加，為93.04%，這可能是由于硒是熱敏性物質(zhì)，長(zhǎng)時(shí)間消解會(huì)導(dǎo)致硒損失。因此，為確保樣品消解完全，本實(shí)驗(yàn)確定消解時(shí)間為10 min。

表2 消解時(shí)間對(duì)回收率的影響

2.2 趕酸溫度優(yōu)化

基于硒的熱敏性，對(duì)趕酸溫度進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果見表3。硝酸分解的中間產(chǎn)物能導(dǎo)致熒光淬滅及熒光強(qiáng)度降低，從而影響測(cè)定[6]。消解結(jié)束待冷卻后，將消解罐放在趕酸儀上加熱趕酸至近干，同等條件下150 ℃，50 min能將樣液中的硝酸除去，時(shí)間較短而且硒濃度值穩(wěn)定。加入鹽酸后再次趕酸，在鹽酸介質(zhì)中，樣液中六價(jià)硒充分還原成四價(jià)硒，四價(jià)硒與NaBH4反應(yīng)生成氫化物，提高鹽酸濃度能減少共存元素的干擾并有利于硒元素的還原[7-9]。在用鹽酸預(yù)還原時(shí)，不用蒸太長(zhǎng)時(shí)間，只要看到有白煙冒出即可停止加熱。當(dāng)趕酸溫度控制在150 ℃，13～17 min 時(shí)就能看到有白煙冒出，液體略帶黃色，但冷卻后液體即變成清亮無(wú)色，此條件下硒濃度值穩(wěn)定，加標(biāo)回收率較高。為實(shí)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)的可操作性和穩(wěn)定性，最終確定選用150 ℃條件下趕酸15 min。

表3 趕酸溫度對(duì)回收率的影響

2.3 載流劑濃度優(yōu)化

戴瑞平等[10]研究發(fā)現(xiàn)，載流劑鹽酸濃度影響硒的測(cè)定，隨著鹽酸濃度的增大，熒光強(qiáng)度也隨之增大。本實(shí)驗(yàn)對(duì)5%和10%的鹽酸濃度進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)（見表4），其他條件一致，載流劑濃度對(duì)回收率無(wú)顯著性影響（P＞0.05），載流劑鹽酸濃度為5%時(shí)，回收率為96.39%，鹽酸濃度為10%時(shí)，回收率為97.07%。綜合考慮所用鹽酸濃度越大對(duì)儀器損傷越大的影響。因此，本實(shí)驗(yàn)選用濃度為5%的鹽酸為載流劑。

表4 載流劑濃度對(duì)回收率的影響

2.4 優(yōu)化后方法的穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

采用優(yōu)化后方法測(cè)定2種樣品。如表5所示，不同樣品的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差控制在5%以內(nèi)，加標(biāo)回收率在93.04%～97.06%，重復(fù)性及精確度良好。

表5 不同生牛乳的測(cè)定值及回收率

2.5 優(yōu)化后的方法測(cè)定不同產(chǎn)地生牛乳的硒含量

由表6可知，采用優(yōu)化后的方法對(duì)不同產(chǎn)地生牛乳的硒含量進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，山東產(chǎn)地的硒含量最高，達(dá)47.94 μg/L，明顯高于其他生牛乳。

表6 不同產(chǎn)地生乳中的硒含量

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)在采用國(guó)標(biāo)方法的基礎(chǔ)上對(duì)樣品微波消解處理后，在150 ℃條件下趕酸50 min，再補(bǔ)加 5 mL 6 mol/L的鹽酸，繼續(xù)趕酸15 min，在該處理?xiàng)l件下檢測(cè)牛奶中硒含量的結(jié)果穩(wěn)定且加標(biāo)回收率高。采用此參數(shù)條件對(duì)陜西、四川、山東等地的生乳硒含量進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)除山東高于其他產(chǎn)地外，其余地域生牛乳中硒含量差異不明顯。