單細胞測序技術(shù)在兒童肝母細胞瘤中的應(yīng)用前景

郭敬杰，王建堯，王斌（通信作者）

1.中國醫(yī)科大學深圳市兒童醫(yī)院，廣東 深圳 518026；2.深圳市兒童醫(yī)院 普外科，廣東 深圳 518026

0 引言

肝母細胞瘤（hepatoblastoma，HB）作為兒童期最常見的原發(fā)性肝臟惡性腫瘤之一，占5歲以下兒童肝臟腫瘤的90%以上，占兒科腫瘤的1%，發(fā)病率為1.2～1.5/百萬兒童[1]。近年來隨著早產(chǎn)兒和低體重嬰兒存活率增加，HB的發(fā)病率有所增加。HB患兒一般表現(xiàn)為較大腹部包塊和異常增高的甲胎蛋白水平，患兒出現(xiàn)明顯的臨床癥狀一般較晚，腫瘤體積一般較大，大部分患兒錯過了一期手術(shù)切除的機會，目前的診療方案主要是新輔助化療聯(lián)合化療后手術(shù)切除。

目前對HB研究主要認為Wnt/β-連環(huán)蛋白信號通路在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用，在HB中β-連環(huán)蛋白的突變率高達50%～90%[1-2]。HB的DNA顯示全局低甲基化，伴隨著特異性腫瘤抑制基因的高甲基化也是研究的熱點內(nèi)容[3]。在腫瘤發(fā)生發(fā)展中，腫瘤微環(huán)境會發(fā)生變化，其中免疫細胞會出現(xiàn)急劇的變化。單細胞測序可以在細胞層面進行研究，對不同細胞類群的變化、基因表達的上下調(diào)非常敏感，探究免疫逃逸發(fā)生的機制，可以為免疫靶點治療提供指導。

1 ScRNA-seq在腫瘤中的應(yīng)用

自從2009年，Tang等在Nature Methods雜志上發(fā)表關(guān)于ScRNA-seq的文章，ScRNA-seq廣泛應(yīng)用于各種動植物、微生物的研究，實現(xiàn)了組織到細胞的飛躍，目前scRNA-seq也提升到了三代測序，廣泛應(yīng)用于各種研究，比如了解肺癌患者和結(jié)直腸癌患者腫瘤微環(huán)境特征、乳腺癌免疫細胞表型在腫瘤微環(huán)境中的特征、腎癌細胞的特征、產(chǎn)前診斷等[4]。

目前應(yīng)用ScRNA-seq在HB中的實例很少，有研究前景；例如Bondoc等通過對腫瘤組織、背景肝臟、患者來源的異種移植物（PDX）進行單細胞測序?qū)Ρ妊芯?，清晰鑒定了不同來源的細胞類群。PDX中鑒定出腫瘤驅(qū)動細胞簇（Tr2）以及腫瘤維持細胞群（Tr0、Tr3、Tr5和Tr4/1），在未來可能應(yīng)用于控制腫瘤生長[5]。

2 ScRNA-seq技術(shù)

ScRNA-seq不同于傳統(tǒng)的測序技術(shù)，傳統(tǒng)的測序技術(shù)也可以實現(xiàn)對基因表達量的研究，是對總體樣本的研究，無法實現(xiàn)異質(zhì)性研究。而ScRNA-seq是對單個細胞層面的研究，包括基因組、轉(zhuǎn)錄組、表觀遺傳學等方面，可以精確分析每一個細胞的變化，同時隨著測序技術(shù)的提升，基因表達量的獲取也越來越多，廣泛應(yīng)用于各個方面。ScRNA-seq的步驟大致包括：分離單細胞、制備乳濁液、破乳、擴增序列、測序及分析[6]。

ScRNA-seq首先需要制備細胞懸浮液，之后進行細胞計數(shù)和細胞活率檢測，將制備好的細胞懸浮液利用微流控芯片，將帶有細胞標簽序列（cell barcode）的膠珠（bead）和細胞包裹在液滴中，構(gòu)成了油包水的結(jié)構(gòu)，將細胞裂解，使得細胞中的mRNA與bead上面的cell barcode相連，形成Single Cell GEMs（Gel Bead-in-Emulsions），在液滴中進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，進行cDNA的文庫構(gòu)建。

通過文庫序列上的cell barcode可以區(qū)分目標序列來自哪一個細胞，通過序列上的UMI可以區(qū)分來源于哪個DNA分子。scRNA-seq的測序信息能反映出細胞間基因表達差異。通過特殊barcodes對同一個細胞的轉(zhuǎn)錄本進行標記，使得擴增之后也可以準確區(qū)分每一個細胞的單細胞信息。UMI標記每一個細胞當中的每一個轉(zhuǎn)錄本，每個DNA分子都有自己的UMI序列，一個UMI對應(yīng)了一種DNA，在PCR擴增的時候產(chǎn)生的多個reads兼并成一個原始的cDNA分子，可以在很大程度上糾正擴增造成的結(jié)果偏倚[7]。

ScRNA-seq獲得每一個細胞的表達量信息之后需要進行質(zhì)控，目的是去除不合理的測序細胞。

（1）低質(zhì)量的細胞或空的液滴中含有基因較少。

（2）細胞雙重態(tài)或多重態(tài)檢測到異常高基因。

（3）線粒體基因占比較高的細胞。

質(zhì)控后的數(shù)據(jù)進行主成分分析（PCA），根據(jù)主成分結(jié)果選擇細胞類群；通過細胞的markgene對細胞進行聚類分析和細胞類別的鑒定，不同樣本的對比分析，可以實現(xiàn)細胞異質(zhì)性研究，即使不同類群的細胞也可以在同一層面進行研究，從單細胞水平獲得基因的表達譜，揭示特定的生物學過程和疾病發(fā)生過程的分子調(diào)節(jié)機制[8]。

3 單細胞測序技術(shù)在研究腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤微環(huán)境方面的優(yōu)勢

3.1 研究腫瘤的異質(zhì)性，探討腫瘤發(fā)生發(fā)展規(guī)律

Wu等通過對42個晚期非小細胞肺癌腫瘤活組織進行scRNA-seq，鑒定出以往研究不同的細胞類型，例如濾泡樹突狀細胞和輔助性T細胞17細胞，來自不同患者的腫瘤組織在細胞組成、染色體結(jié)構(gòu)、發(fā)育軌跡方面具有較大的異質(zhì)性，同時揭示了異質(zhì)性與腫瘤相關(guān)嗜中性粒細胞的關(guān)系[9]。為了研究乳腺癌原位腫瘤組織和轉(zhuǎn)移腫瘤組織中腫瘤細胞拷貝數(shù)變異（CNV）差異，Gao等應(yīng)用單細胞測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)大量的CNA在腫瘤進化的早期短時間內(nèi)獲得，并且隨著腫瘤克隆擴張而保持高度穩(wěn)定，克隆多樣化發(fā)生在腫瘤進展的最早階段，產(chǎn)生一個或多個克隆穩(wěn)定擴增，符合“大爆炸”模型；同時揭示了乳腺癌的發(fā)展過程，轉(zhuǎn)移灶是經(jīng)過淋巴和血道轉(zhuǎn)移形成的[10-11]。

3.2 描述腫瘤免疫微環(huán)境，尋找免疫治療靶點

ScRNA-seq全面地展現(xiàn)了腫瘤微環(huán)境中各組成部分的特有特征，并明確腫瘤細胞與微環(huán)境各組分之間的相互作用，尤其是腫瘤與免疫細胞的關(guān)系，有助于探索腫瘤免疫治療的潛在新靶點。腫瘤相關(guān)巨噬細胞、肥大細胞、T淋巴細胞、B淋巴細胞、自然殺傷細胞等細胞亞群構(gòu)成了腫瘤免疫微環(huán)境；這些免疫細胞不僅發(fā)揮著腫瘤細胞的殺傷作用，同時又促進腫瘤進展、免疫逃逸[12]?？贵w阻滯細胞毒性T淋巴細胞相關(guān)抗原-4（CTLA-4）、程序性死亡受體-1（PD-1）等免疫治療的藥物就是解除CD8+T細胞免疫抑制的靶向藥物，黑色素瘤、淋巴瘤、Merkel細胞癌等腫瘤對靶向治療藥物反應(yīng)良好，但是對有些腫瘤效果不佳，如卵巢癌、胰腺癌等，我們還需要進一步對腫瘤的免疫微環(huán)境進行研究，找到每個腫瘤特異的治療靶點。為了解肝癌患者腫瘤微環(huán)境的特征，Zheng等對5063個人類肝癌T細胞進行了scRNA-seq，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行細胞分類，發(fā)現(xiàn)了大量功能紊亂的殺傷性CD8+T細胞和抑制性T細胞存在于腫瘤細胞內(nèi)，同時基因Layilin對CD8+T細胞的殺傷功能有抑制作用，可能成為潛在免疫治療靶點[13]。

3.3 突破樣本量的限制，實現(xiàn)信息最大化

ScRNA-seq可以突破樣本量的限制，如超聲引導下穿刺樣本、外周血循環(huán)腫瘤細胞等都是應(yīng)用最小的樣本實現(xiàn)最大化。外周血循環(huán)腫瘤細胞（CTCs）是從原發(fā)或繼發(fā)腫瘤病灶脫落進入外周血的腫瘤細胞[14]。有觀點認為其具有在遠處器官啟動腫瘤生長的能力，傳統(tǒng)的方法無法實現(xiàn)對脫落腫瘤細胞的研究，而單細胞水平的研究可以實現(xiàn)。D_Avola等通過單細胞測序檢測到肝癌患者血液中的CTCs，CTCs中表達的基因[長非編碼RNA（HULC）、SPINK1，IGF2]是肝癌中的特異基因，也說明其來源于肝癌組織；CTCs高表達IGF2，20% 的早期肝癌患者也高表達IGF2。該研究基于單細胞技術(shù)對肝癌患者CTCs的研究，發(fā)現(xiàn)了潛在生物標志物IGF2，為肝癌患者的診斷提供參考[15]。

4 展望

HB是一種原發(fā)于肝臟的實體惡性腫瘤，近年來發(fā)病率有所增加。目前的主要治療方法包括化學療法、手術(shù)切除和肝移植，高?；純旱念A(yù)后不佳。目前尚缺乏有效的免疫及靶向治療方案，對于腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程以及免疫機制等都不太清楚。ScRNA-seq作為一項細胞水平的技術(shù)，可以實現(xiàn)腫瘤異質(zhì)性的研究以及腫瘤微環(huán)境的探索，其在實體腫瘤中的廣泛應(yīng)用證明了研究前景，應(yīng)用此項技術(shù)研究HB是可行的，將來我們可能找到精準的免疫及靶向治療方案，為HB患兒帶去希望。