食源性致病菌快檢技術(shù)研究進(jìn)展及應(yīng)用現(xiàn)狀分析

張士財(cái)，丁衛(wèi)平

（濱州市檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東 濱州 256603）

食源性致病菌依然是引起人類食源性疾病的主要原因[1]。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2021年的報(bào)告，每年約有6 億食源性疾病病例，即使是一些發(fā)達(dá)國(guó)家，如美國(guó)，每年也有1/4 的人罹患食源性疾病[2-3]。近幾年，我國(guó)不斷加大食品安全抽檢力度，由國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)督管理總局公布的食品安全監(jiān)督抽檢結(jié)果數(shù)據(jù)可以看出微生物超標(biāo)占檢測(cè)不合格項(xiàng)目的比例呈逐年下降趨勢(shì)（2019年占比28.4%，2020年占比23.03%，2021年占比22.40%）[4-5]，但仍然占較高比例，是威脅食品安全的主要因素之一。隨著我國(guó)對(duì)食品安全重視程度的提升以及科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，食源性致病菌快速檢測(cè)（以下簡(jiǎn)稱快檢）技術(shù)迅猛發(fā)展，以免疫標(biāo)記技術(shù)、核酸擴(kuò)增技術(shù)、生物傳感器技術(shù)等為基礎(chǔ)的快檢技術(shù)成為食源性致病菌檢測(cè)的主流，每種技術(shù)原理不同，但相較于傳統(tǒng)技術(shù)，因具有高效、快速、特異的優(yōu)勢(shì)而成為研究熱點(diǎn)。

1 免疫標(biāo)記技術(shù)

免疫標(biāo)記技術(shù)指利用免疫分子抗原和抗體特異結(jié)合的原理，并用熒光素、酶、膠體金等標(biāo)記物對(duì)免疫分子進(jìn)行標(biāo)記，通過(guò)檢測(cè)標(biāo)記物相關(guān)信號(hào)指標(biāo)，以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定抗原抗體的定性或定量檢測(cè)。

1.1 免疫酶技術(shù)

免疫酶技術(shù)即以酶作為標(biāo)記物，待測(cè)組分與相應(yīng)的抗原或抗體作用后，酶得以催化底物而發(fā)生顏色反應(yīng)，通過(guò)顏色變化而對(duì)待測(cè)物作定性和定量分析[6]。應(yīng)用最廣的是酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（Enzyme-Linked Immunosorbent Assays，ELISA），其抗原抗體特異性結(jié)合反應(yīng)在固相載體上進(jìn)行，實(shí)驗(yàn)步驟和操作過(guò)程更加簡(jiǎn)便。ELISA 又包括雙抗體夾心法、間接法、競(jìng)爭(zhēng)法、生物素-親和素法。向雙林等[7]利用雜交瘤技術(shù)制備了高純度的單克隆抗體6A6、2A2，并建立了具有良好敏感性的雙抗夾心ELISA 檢測(cè)方法檢測(cè)阪崎腸桿菌，其檢測(cè)限達(dá)1.0×103CFU·mL-1，與其他數(shù)種食源性致病菌無(wú)交叉效應(yīng)。

1.2 免疫熒光技術(shù)

免疫熒光技術(shù)即以熒光素作為標(biāo)記物，與特異抗體或抗原結(jié)合后產(chǎn)生熒光，通過(guò)熒光顯微鏡監(jiān)測(cè)熒光反應(yīng)來(lái)檢測(cè)目標(biāo)致病菌的一種方法。目前研究較多的熒光素有免疫熒光微球和量子點(diǎn)。梁珊[8]利用免疫磁珠技術(shù)和免疫熒光技術(shù)相結(jié)合的方式，對(duì)痕量的李斯特菌進(jìn)行特異性檢測(cè)，將具有長(zhǎng)波熒光發(fā)射的CdZnTe 量子點(diǎn)標(biāo)記檢測(cè)抗體作為特異性信號(hào)指示劑，其檢測(cè)方法具有1 ～109CFU·mL-1的寬檢測(cè)范圍和1 CFU·mL-1的低檢測(cè)限，實(shí)現(xiàn)了對(duì)李斯特菌異常靈敏的檢測(cè)。

1.3 免疫膠體金技術(shù)

免疫膠體金技術(shù)在食源性致病菌檢測(cè)中應(yīng)用最多的是膠體金免疫層析技術(shù)，是以膠體金作為標(biāo)記物標(biāo)記抗體，將需要的抗原或抗體固定在硝酸纖維素膜（NC 膜）上，待測(cè)樣品添加到樣本墊上，通過(guò)層析作用在NC 膜上向一側(cè)遷移，待檢物先與金標(biāo)抗體形成結(jié)合物，再遷移至固定的抗原或抗體的區(qū)域，發(fā)生特異性結(jié)合而聚集并顯示出膠體金的橘紅色或紫紅色，肉眼觀察即可判斷待測(cè)組分的有無(wú)[9]。山珊等[10]首先用免疫磁珠對(duì)目標(biāo)菌進(jìn)行富集，再利用膠體金標(biāo)記抗體并同時(shí)偶聯(lián)β-內(nèi)酰胺酶，當(dāng)目標(biāo)菌存在時(shí)，β-內(nèi)酰胺酶高效地水解青霉素，再將水解液滴加到免疫層析紙條上，通過(guò)間接檢測(cè)青霉素而使轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)放大，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)大腸桿菌O157 ∶H7的特異性檢測(cè)，最低檢出限為2×102CFU·mL-1，極大提高了此方法的檢測(cè)靈敏度。

免疫標(biāo)記技術(shù)基于免疫分子抗原抗體特異性結(jié)合的原理，提高了致病菌檢測(cè)的特異性，但也有一定局限性，如酶標(biāo)記物需要有一定的純度和活度，熒光標(biāo)記物則需要較高的熒光效率。此方法整個(gè)過(guò)程步驟較多，受固相載體、抗原、受檢樣品、洗滌劑、稀釋劑、作用時(shí)間以及檢測(cè)儀器等因素影響，往往導(dǎo)致結(jié)果偏差。同時(shí)，抗原抗體高度特異性結(jié)合，而食源性致病菌種類繁多，往往一個(gè)檢測(cè)試劑盒只能檢測(cè)一種抗原，也造成了檢測(cè)通量低的問(wèn)題。

2 核酸擴(kuò)增技術(shù)

核酸擴(kuò)增技術(shù)以核酸為基礎(chǔ)，在酶的作用下通過(guò)變性、退火、延伸重復(fù)循環(huán)過(guò)程實(shí)現(xiàn)核酸的體外復(fù)制擴(kuò)增，進(jìn)而達(dá)到檢測(cè)目標(biāo)致病菌DNA 或RNA 的目的[11]。近幾十年，在普通聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）基礎(chǔ)上衍生出多種技術(shù)，用于食源性致病菌檢測(cè)的方法主要有多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)、熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)、數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)以及等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。

2.1 多重聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

多重PCR 是在普通PCR 基礎(chǔ)上，在一個(gè)反應(yīng)體系內(nèi)加入多種特異性引物而同時(shí)對(duì)多個(gè)模板進(jìn)行擴(kuò)增的方法。其能夠進(jìn)行多種致病菌檢測(cè)，提高了檢測(cè)通量，縮短了檢測(cè)時(shí)間[12]。張明娟等[13]通過(guò)優(yōu)化引物設(shè)計(jì)、反應(yīng)體系、反應(yīng)條件建立了一個(gè)在PCR反應(yīng)體系中同時(shí)檢測(cè)單增細(xì)胞增生李斯特菌等10 種食源性致病菌的多重PCR 檢測(cè)方法，在人工污染樣品評(píng)價(jià)中，結(jié)果顯示出此體系特異性強(qiáng)，靈敏度高，10 種致病菌檢出限均可達(dá)10 CFU·mL-1。

2.2 熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

熒光定量PCR 是在PCR 反應(yīng)體系中加入熒光標(biāo)記的探針（常用TaqMan 探針）或者熒光染料（常用SYBR Green 染料），通過(guò)儀器來(lái)監(jiān)測(cè)PCR 反應(yīng)過(guò)程中熒光信號(hào)的積累，最后分析CT 值或者建立標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)成分定性定量分析的技術(shù)。董瑞等[14]以金黃色葡萄球菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌為測(cè)試對(duì)象，設(shè)計(jì)特異引物和探針，并與GB 4789 系列標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行比較，檢測(cè)結(jié)果與國(guó)標(biāo)一致，并能大大縮短檢測(cè)時(shí)間。

2.3 數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

數(shù)字PCR 是在熒光定量PCR 的基礎(chǔ)上，將反應(yīng)體系分布到芯片微孔中實(shí)現(xiàn)微滴化，理想狀態(tài)下每個(gè)微孔中最多只有一個(gè)核酸拷貝，通過(guò)儀器對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行泊松分布統(tǒng)計(jì)分析，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)初始樣本中核酸拷貝的含量測(cè)定。張明明等[15]在單重?cái)?shù)字PCR 基礎(chǔ)上建立了檢測(cè)傷寒沙門氏菌、金黃色葡萄球菌及單核細(xì)胞增生李斯特氏菌的三重?cái)?shù)字PCR體系，結(jié)果顯示線性相關(guān)性和重復(fù)性較好，最低檢 出 限 分 別 為0.23 copies·μL-1、0.18 copies·μL-1、 0.42 copies·μL-1。

2.4 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)

等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)即在同一恒定溫度下，對(duì)靶序列進(jìn)行特異性擴(kuò)增，使其產(chǎn)生大量拷貝以達(dá)到檢測(cè)水平的體外擴(kuò)增技術(shù)。食源性致病菌常用的等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)主要有環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（Loop-mediated Isothermal Amplification，LAMP）、 重 組 酶 介 導(dǎo)核 酸 擴(kuò) 增 技 術(shù)（Recombinase Aided Amplification，RAA）、重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)（Recombinase Polymerase Amplification，RPA）等。

LAMP 是指在60 ～65 ℃的恒定溫度，鏈置換DNA 聚合酶作用下，使用4 種不同的引物來(lái)擴(kuò)增靶基因上的6個(gè)不同區(qū)域，進(jìn)行體外核酸擴(kuò)增的技術(shù)[16]。XU 等[17]開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)單、靈敏、特異性和可視化LAMP 方法來(lái)檢測(cè)霍亂弧菌毒力相關(guān)和物種特異性基因，在可見(jiàn)光下發(fā)生顏色變化（從橙色到淺綠色），通過(guò)肉眼即可讀取陽(yáng)性結(jié)果，可用于快速篩選各種來(lái)源的水和常用的魚類樣本中的霍亂弧菌。RAA 與RPA 原理相似，皆是在等溫條件下（最適溫度37 ℃）通過(guò)重組酶、重組酶加載因子和單鏈結(jié)合蛋白與引物和靶序列的相互作用，完成核酸靶序列的體外擴(kuò)增的技術(shù)，不同點(diǎn)是兩者重組酶來(lái)源不同[18-20]。姚麗鋒等[21]建立了銅綠假單胞菌lasB 基因RAA 檢測(cè)方法，人工污染實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)特異性良好，對(duì)其他致病菌無(wú)交叉反應(yīng)，檢測(cè)時(shí)間僅需20 min，對(duì)純菌液的檢測(cè)靈敏度達(dá)到了1.7 pg·μL-1。

核酸擴(kuò)增技術(shù)以其高靈敏度，高特異性等優(yōu)勢(shì)，被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌檢測(cè)[22]。多重PCR 能夠?qū)崿F(xiàn)幾種甚至十幾種致病菌同時(shí)檢測(cè)，相比于熒光定量PCR，多重PCR 不需要合成價(jià)格較貴的探針，所需儀器及試劑費(fèi)用較低，但是其局限在需要設(shè)計(jì)多對(duì)特異性引物以防止同一體系出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增，同時(shí)需要結(jié)合下游的凝膠電泳成像技術(shù)才能得到檢測(cè)結(jié)果。熒光定量PCR 相較于多重PCR 引入探針使擴(kuò)增特異性更強(qiáng)，靈敏度更高，儀器監(jiān)測(cè)熒光信號(hào)過(guò)程結(jié)束即可分析得到檢測(cè)結(jié)果，更加便捷快速，可進(jìn)行定性和相對(duì)定量分析，但由于熒光檢測(cè)通道限制，很難實(shí)現(xiàn)高通量檢測(cè)，而且探針合成和儀器費(fèi)用較高，提高了檢測(cè)成本，在檢測(cè)樣本低拷貝以及存在抑制劑時(shí)容易出現(xiàn)假陰性等現(xiàn)象。數(shù)字PCR 相較于熒光定量PCR，具有高靈敏度、高精確度、對(duì)抑制劑高耐受性和絕對(duì)定量等優(yōu)點(diǎn)[23-24]，但與熒光定量PCR 類似具有試劑儀器費(fèi)用成本高等局限。LAMP、RAA、RPA 等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測(cè)效率高，實(shí)用價(jià)值強(qiáng)，只需要在等溫條件下，幾十分鐘即可實(shí)現(xiàn)產(chǎn)物大量擴(kuò)增。由于其所需設(shè)備簡(jiǎn)單，環(huán)境條件要求低，非常適合在基層食品安全監(jiān)測(cè)的應(yīng)用，目前我國(guó)已經(jīng)出臺(tái)多個(gè)LAMP 檢測(cè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)[25-26]。LAMP 同樣也存在著明顯的缺點(diǎn)，其只適用于擴(kuò)增較短片段，并且引物設(shè)計(jì)相較于傳統(tǒng)PCR 方法難度大，因引物多、溫度低導(dǎo)致其擴(kuò)增產(chǎn)物組成較復(fù)雜，特異性難以驗(yàn)證，反應(yīng)體系極易受到污染[27-28]。

核酸擴(kuò)增技術(shù)在靈敏度、特異性、定量檢測(cè)等方面較傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)有無(wú)可比擬的優(yōu)勢(shì)，但其以致病菌核酸為檢測(cè)對(duì)象，無(wú)法分辨死活細(xì)胞而出現(xiàn)假陽(yáng)性，因此需要結(jié)合其他檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行相互確證。

3 其他快檢技術(shù)

除了基于免疫學(xué)原理和核酸擴(kuò)增原理的快檢技術(shù)外，在食源性致病菌檢測(cè)中研究較多的還有生物傳感器技術(shù)、質(zhì)譜技術(shù)、生物芯片技術(shù)和光譜技術(shù)等。生物傳感器是對(duì)生物分子（如酶、抗體、抗原、核酸等）進(jìn)行設(shè)計(jì)或者修飾，使其能與待測(cè)物發(fā)生反應(yīng)從而產(chǎn)生濃度信號(hào)，經(jīng)過(guò)物理或化學(xué)等技術(shù)進(jìn)行信號(hào)轉(zhuǎn)換，最終輸出為可供檢測(cè)的電信號(hào)，再經(jīng)過(guò)系統(tǒng)分析處理便可得到實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，在致病菌檢測(cè)中應(yīng)用最多的是電化學(xué)生物傳感器和光化學(xué)生物傳感器[29]。質(zhì)譜技術(shù)在致病菌檢測(cè)研究最多的是基質(zhì)輔助激光解吸附電離飛行時(shí)間質(zhì)譜，其原理是基于不同致病菌帶有不同的核糖體蛋白質(zhì)，在與基質(zhì)溶液反應(yīng)后，在激光輻射下樣品發(fā)生電離，經(jīng)過(guò)飛行時(shí)間檢測(cè)器，不同質(zhì)荷比的離子分開(kāi)，形成細(xì)菌特異性的質(zhì)譜圖，與已有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)來(lái)確定細(xì)菌的種屬[30]。生物芯片是將靶標(biāo)基因的特異性序列作為探針固定在玻璃芯片、硅芯片或尼龍膜等載體上，然后與標(biāo)記的待測(cè)靶標(biāo)基因按堿基配對(duì)原理雜交，經(jīng)放射自顯影、激光共聚焦熒光檢測(cè)或酶-底物顯色系統(tǒng)等處理芯片，得到特定信號(hào)來(lái)判定是否存在目標(biāo)菌[31]。光譜技術(shù)是基于物質(zhì)與電磁輻射作用，物質(zhì)內(nèi)部發(fā)生量子化的能級(jí)躍遷而產(chǎn)生發(fā)射、吸收或散射輻射等現(xiàn)象，通過(guò)對(duì)特定波長(zhǎng)和強(qiáng)度進(jìn)行分析來(lái)檢測(cè)待測(cè)物的一種技術(shù)，研究較多的如近紅外光譜和表面增強(qiáng)拉曼光譜[32]。

4 快檢技術(shù)在基層食源性致病菌監(jiān)測(cè)中應(yīng)用現(xiàn)狀及建議

快檢技術(shù)種類繁多，在基層的應(yīng)用主要集中在食用農(nóng)產(chǎn)品農(nóng)藥殘留和獸藥殘留的監(jiān)測(cè)領(lǐng)域，對(duì)于食源性致病菌的檢測(cè)應(yīng)用較少[33-34]。目前快檢技術(shù)已有部分國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)，并已有部分地區(qū)配備了基于LAMP 的快檢儀器，但在食源性致病菌檢測(cè)結(jié)果方面不盡人意[35]。大多數(shù)快檢技術(shù)仍然處于實(shí)驗(yàn)室研究階段，為加快快檢技術(shù)基層落地發(fā)揮其優(yōu)勢(shì)，提升基層食品安全監(jiān)測(cè)水平，提出以下幾方面建議。

4.1 加快完善標(biāo)準(zhǔn)體系，為快檢提供標(biāo)準(zhǔn)支撐

由于快檢技術(shù)種類繁多，多種技術(shù)融合發(fā)展，盡管一些快檢技術(shù)已有行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)，但檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)涉及面較小，同時(shí)快檢技術(shù)所需試劑、儀器設(shè)備等缺少相應(yīng)的計(jì)量和檢定標(biāo)準(zhǔn)，大大影響了快檢技術(shù)的準(zhǔn)確性，應(yīng)加快快檢方法的標(biāo)準(zhǔn)認(rèn)定，拓展檢測(cè)范圍，為快檢技術(shù)基層落地提供法規(guī)依據(jù)。

4.2 加快產(chǎn)品研發(fā)，提高產(chǎn)品質(zhì)量

成本投入高是限制快檢技術(shù)在基層應(yīng)用的重要因素之一。雖然快檢技術(shù)多種多樣，但大多數(shù)技術(shù)只是在高校、研究院及大型實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，試劑耗材成本較高，儀器設(shè)備價(jià)格昂貴，如數(shù)字PCR 儀器、質(zhì)譜儀等，基層生產(chǎn)企業(yè)、檢測(cè)站等機(jī)構(gòu)無(wú)法承擔(dān)。目前雖有便攜化快檢儀器，但種類較少，試劑質(zhì)量穩(wěn)定性差，成本較高。因此，我國(guó)應(yīng)加快快檢商品化試劑和便攜儀器的研發(fā)，提高產(chǎn)品質(zhì)量，開(kāi)拓快檢市場(chǎng)。

4.3 加強(qiáng)人員培訓(xùn)，提高檢測(cè)水平

當(dāng)前快檢儀器和試劑生產(chǎn)、研發(fā)和應(yīng)用的專業(yè)人員不足，基層檢測(cè)室檢測(cè)人員往往是兼職從事檢測(cè)工作，一些基層雖然配備了快檢儀器，但是人員專業(yè)能力不強(qiáng)，出現(xiàn)檢測(cè)問(wèn)題無(wú)法解決，應(yīng)加強(qiáng)基層專業(yè)技術(shù)人員培訓(xùn)，組織能力驗(yàn)證，提升基層人員檢測(cè)水平。

4.4 建立快檢一體化平臺(tái)，實(shí)現(xiàn)數(shù)據(jù)共享

基層食品安全工作以及食品生產(chǎn)企業(yè)面臨不少困難，很難在食品安全監(jiān)測(cè)工作上加大投入。因此，可以加強(qiáng)市縣兩級(jí)聯(lián)動(dòng)，建立食源性致病菌監(jiān)測(cè)一體化的快檢平臺(tái)，通過(guò)人員共享、儀器共享、數(shù)據(jù)共享等實(shí)現(xiàn)快檢技術(shù)在基層落地。

5 結(jié)語(yǔ)

微生物污染在食品監(jiān)督抽檢不合格項(xiàng)目中占比較大，仍然需要加大對(duì)食品微生物指標(biāo)的監(jiān)測(cè)力度。近幾年，以免疫學(xué)、分子生物學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)、光譜學(xué)以及質(zhì)譜學(xué)等原理為基礎(chǔ)的現(xiàn)代檢測(cè)技術(shù)不斷發(fā)展。相比傳統(tǒng)技術(shù)，快檢技術(shù)在特異性、靈敏度、檢測(cè)效率等方面具有巨大優(yōu)勢(shì)，為食源性致病菌快檢技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用提供了機(jī)遇。當(dāng)前，由于受微生物本身特點(diǎn)影響，原始樣本中的菌體載量較低，需要培養(yǎng)富集是限制檢測(cè)速度的關(guān)鍵因素，快檢技術(shù)在縮短富集時(shí)間方面仍然需要進(jìn)一步探索。免疫磁珠分離技術(shù)的應(yīng)用減少了檢測(cè)時(shí)間，但免疫磁珠富集利用抗原抗體特異結(jié)合原理，往往只對(duì)一種致病菌發(fā)揮作用，很難實(shí)現(xiàn)高通量操作，商品化試劑盒的種類較多，靈敏度穩(wěn)定性方面良莠不齊[36-37]。雖然這些現(xiàn)代化技術(shù)或多或少都存在不足之處，如試驗(yàn)成本高、操作技術(shù)要求高、方法不成熟等問(wèn)題，但隨著多學(xué)科、多種技術(shù)結(jié)合等新技術(shù)的研發(fā)，快檢技術(shù)必將朝著更高效、更靈敏、更準(zhǔn)確以及更便捷的方向發(fā)展，為食品安全監(jiān)管提供技術(shù)支撐。