瓜類細(xì)菌性果斑病生防菌的篩選、鑒定及發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性研究

王雪妍， 岳丹丹， 潘夢詩， 張志龍， 張英濤

（河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450008）

瓜類細(xì)菌性果斑病是由燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N（Acidovorax avenaesubsp.citrulli）引起的種傳性細(xì)菌病害，可侵染葉子也可侵染果實(shí)［1-2］. 目前該病害的防治手段主要以化學(xué)防治為主，但化學(xué)防治手段不利于環(huán)境保護(hù)，且殘留的藥物會危害人畜健康，因此生物防治成為解決化學(xué)防治弊端的重要措施. 本試驗(yàn)從土壤中分離篩選得到一株瓜類細(xì)菌性果斑病的生物防治菌株BP-12，并對其進(jìn)行了鑒定，又從溫度耐受性、pH耐受性以及紫外照射時間耐受性3個方面對該菌株發(fā)酵液的抑菌穩(wěn)定性展開研究.

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品來源

土壤樣品取自河南省周口市種植西瓜的土壤. 病原菌來自中國農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心，菌種編號ACCC05732.

1.1.2 培養(yǎng)基

NB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.3.

NA培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂18 g/L，pH 7.3.

KB培養(yǎng)基：蛋白胨20 g/L、K2HPO41.5 g/L、MgSO4·7H2O 1.5 g/L、瓊脂18 g/L、甘油10 mL/L，pH 7.2.

1.2 方法

1.2.1 生物防治菌株的篩選

初篩：取10 g 土壤樣品，加入裝有90 mL 無菌水和8～10 個已滅菌的玻璃珠的三角瓶中，180 r/min 振蕩30 min，充分打散土樣，梯度稀釋后取100 μL涂布于NA平板，30 ℃，培養(yǎng)1～2 d；挑取具有明顯差異的菌落，經(jīng)平板劃線純化后，編號并保藏備用.

復(fù)篩：挑取病原菌種于NB培養(yǎng)基中，30 ℃，180 r/min，培養(yǎng)48 h；吸取病原菌液2 mL于KB平板上，輕輕晃動平板，將菌液布滿整個平板，放置5～10 min；將平板傾斜吸出多余的菌液，開蓋在無菌環(huán)境中晾干培養(yǎng)基平板表面［3］，將初篩得到的菌株點(diǎn)種到平板上，30 ℃，培養(yǎng)48 h；篩選出具有抑菌圈的菌株，并將其進(jìn)行多次繼代培養(yǎng)，選擇拮抗作用穩(wěn)定且效果較好的菌株.

1.2.2 菌株的鑒定

形態(tài)學(xué)觀察及生理生化鑒定：將初篩出來的菌株BP-12接種于NA培養(yǎng)基上，30 ℃，培養(yǎng)24 h；肉眼觀察菌株菌落形態(tài)，再在顯微鏡下觀察菌體形態(tài)，并參照《常見細(xì)菌鑒定手冊》進(jìn)行生理生化特征試驗(yàn)［4］.

分子生物學(xué)鑒定：提取菌株的基因組DNA，采用通用引物27F/1492R 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物為27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’；1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR擴(kuò)增體系為25.0 μL，包括無菌雙蒸水17.0 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，正向和反向引物各1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，Taq DNA 聚合酶0.3 μL. PCR 反應(yīng)條件為95 ℃，4 min；95 ℃，1 min；52 ℃，30 s；72 ℃，2 min；30 個循環(huán)；72 ℃10 min. 將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后測序，測序結(jié)果在GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST比對，做相似性分析.

系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建：測序獲得的16S rRNA部分序列經(jīng)BLAST同源比對后，從GenBank中獲取同源性較高且相鄰的種、屬的序列，同時查找相鄰種、屬中模式種的16S rRNA序列，使用MEGA6軟件進(jìn)行構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹.

1.2.3 發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性研究

熱穩(wěn)定性試驗(yàn)：將菌株BP-12發(fā)酵液均分5份，分別在40、50、60、70、80 ℃條件下處理30 min. 待發(fā)酵液降至室溫后，取不同溫度處理下的發(fā)酵液100 μL在涂有病原菌的KB平板上打孔點(diǎn)樣，以未處理的發(fā)酵液為陽性對照，NB培養(yǎng)基為空白對照，每個處理重復(fù)3次，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察抑菌圈的大小.

pH穩(wěn)定性試驗(yàn)：用1 mol/L的HCl和1 mol/L的NaOH將菌株BP-12發(fā)酵液的pH值分別調(diào)節(jié)為3、4、5、6、7、8、9、10，室溫下靜置12 h；再將這些發(fā)酵液的pH值調(diào)回到其初始pH值7.3. 取不同pH值處理?xiàng)l件下的發(fā)酵液100 μL在涂有病原菌的KB平板上打孔點(diǎn)樣，以未處理的發(fā)酵液為陽性對照，NB培養(yǎng)基為空白對照，每個處理重復(fù)3次，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察抑菌圈的大小.

紫外線穩(wěn)定性試驗(yàn)：將菌株BP-12發(fā)酵液于紫外燈下靜置照射，波長254 nm，功率36 W，高度25 cm，照射時間分別為1、2、3、4、5、6 h. 取不同紫外照射時間處理下的發(fā)酵液100 μL在涂有病原菌的KB平板上打孔點(diǎn)樣，以未處理的發(fā)酵液為陽性對照，NB培養(yǎng)基為空白對照，每個處理重復(fù)3次，30 ℃靜置培養(yǎng)48 h，觀察抑菌圈的大小.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選與鑒定

從土樣中分離得到的菌株BP-12對病原菌的抑菌圈直徑達(dá)20.3 mm，30 ℃條件下，在NA平板上培養(yǎng)48 h，肉眼觀測到菌落呈白色圓形不透明狀，表面無褶皺（圖1）；顯微鏡下觀察呈桿狀，產(chǎn)芽孢，革蘭染色陽性；生理生化特性見表1. 提取菌株BP-12基因組DNA，采用細(xì)菌16S rRNA基因通用引物擴(kuò)增菌株的16S rRNA基因片段，將測序結(jié)果通過BLAST 軟件進(jìn)行同源性比較，并選取同源性較高的參考菌株的16S rRNA 序列，通過MEGA6軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）. 菌株BP-12為芽孢桿菌屬，且與解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）親緣關(guān)系較近.

圖1 菌株BP-12菌落形態(tài)結(jié)果Fig.1 The colony morphology of the strain BP-12

表1 菌株BP-12的生理生化特性Tab.1 Physiological and biochemical characteristics of strain BP-12

圖2 基于16S rRNA序列構(gòu)建的菌株BP-12的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of strain BP-12 based on 16S rRNA sequence

2.2 發(fā)酵液抑菌穩(wěn)定性研究

2.2.1 熱穩(wěn)定性

菌株BP-12 發(fā)酵液經(jīng)不同溫度處理后的抑菌圈變化如圖3 所示. 由圖可知，菌株BP-12 發(fā)酵液經(jīng)40、50、60 ℃處理30 min后，抑菌圈直徑與未處理的發(fā)酵液相比差別不明顯；當(dāng)溫度升高到70 ℃和80 ℃時，抑菌圈直徑變小. 由此說明，隨著溫度的升高，菌株BP-12發(fā)酵液的抑菌活性逐漸降低.

圖3 溫度對菌株BP-12發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.3 Influence of temperature on antimicrobial activity of strain BP-12 fermentation broth

2.2.2 pH穩(wěn)定性

菌株BP-12發(fā)酵液經(jīng)不同pH處理后的抑菌圈變化如圖4所示. 當(dāng)pH＜5和pH=10時，菌株BP-12發(fā)酵液的抑菌圈直徑較小，說明抑菌效果不理想；pH值在5～9的范圍內(nèi)，菌株BP-12發(fā)酵液的抑菌圈直徑與對照相比差別不明顯. 由此說明，菌株BP-12發(fā)酵液在弱酸、中性以及弱堿條件下能保持相對穩(wěn)定的抑菌活性.

圖4 pH對菌株BP-12發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.4 Influence of pH on antimicrobial activity of strain BP-12 fermentation broth

2.2.3 紫外線穩(wěn)定性

菌株BP-12 發(fā)酵液經(jīng)不同時間紫外線照射后的抑菌圈變化如圖5 所示. 隨著紫外線照射時間的增加，菌株BP-12 發(fā)酵液的抑菌圈變化不明顯，當(dāng)紫外照射時間達(dá)到6 h 時，抑菌圈直徑仍能達(dá)到19.8 mm.由此說明，菌株BP-12發(fā)酵液對紫外線照射有較好的穩(wěn)定性.

圖5 紫外照射對菌株BP-12發(fā)酵液抑菌活性的影響Fig.5 Influence of ultraviolet irradiation on antimicrobial activity of strain BP-12 fermentation broth

3 討論與結(jié)論

目前，已報道的瓜類細(xì)菌性果斑病的生防菌有酵母菌（Pichia anomala）、熒光假單胞菌（Pseudomonas Fluorescens）工程菌株（染色體整合了2，4-二乙?；g苯三酚）以及芽孢桿菌等［5-7］. 本試驗(yàn)通過梯度稀釋和平板對峙試驗(yàn)相結(jié)合的方法篩選得到一株對瓜類細(xì)菌性果斑病有拮抗作用的菌株BP-12，抑菌圈直徑20.3 mm. 利用形態(tài)學(xué)、生理生化以及分子生物學(xué)相結(jié)合的方法對其進(jìn)行分類學(xué)地位的確定，鑒定該菌株為解淀粉芽孢桿菌（B.amyloliquefaciens）. 芽孢桿菌是一類種類多、分布廣的好氧性革蘭陽性菌，是土壤和植物微生態(tài)中的優(yōu)勢種群，在植物病害生物防治研究中占有重要地位［8-9］. 其中解淀粉芽孢桿菌能夠防治多種真菌和細(xì)菌病害，能夠產(chǎn)生抑菌物質(zhì)，且營養(yǎng)要求簡單，繁殖速度快，是公認(rèn)的植物病害的生防細(xì)菌［10］. 張鳳杰等研究發(fā)現(xiàn)，生防菌解淀粉芽孢桿菌B15的發(fā)酵液對23種植物病原菌具有抑制作用，且對香菇爛筒病、蘋果腐爛病以及黃瓜枯萎病等5種病原真菌的抑制率在90%以上，具有廣譜抑菌性［11］；賈慧慧等從杏樹根系土壤中分離到一株解淀粉芽孢桿菌BJ-6，經(jīng)研究該菌對甜瓜細(xì)菌性果斑病病原菌有很好的抑制作用，并對甜瓜苗有很好的促生作用［12］.

相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，生防菌株的抑菌穩(wěn)定性易受到周圍環(huán)境因素的影響，因此，抑菌的穩(wěn)定性對于實(shí)際應(yīng)用中的防治效果具有重要作用［13］. 吳艷清等［14］研究發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌YQ5 發(fā)酵液在溫度高于100 ℃時，抑菌率仍高于50%，另對極端pH 環(huán)境以及紫外線照射均不敏感；張亮等［15］研究表明，多黏類芽孢桿菌LRS-1在30～60 ℃范圍內(nèi)對辣椒疫霉病病原菌的抑菌率達(dá)60%以上，且在中堿性中抑菌效果保持穩(wěn)定. 本研究篩選到的解淀粉芽孢桿菌BP-12 對瓜類細(xì)菌性果斑病病原菌具有良好的抑制作用，發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液經(jīng)40、50、60 ℃處理后活性穩(wěn)定，當(dāng)溫度升高到70 ℃和80 ℃時，抑菌活性降低；發(fā)酵液pH 值為5～9 時，其抑菌圈直徑仍能達(dá)到18.3 mm 以上；經(jīng)紫外照射6 h 后，發(fā)酵液的抑菌圈直徑不受影響，表明菌株BP-12 發(fā)酵液具有較好的抗紫外線能力.

綜上，解淀粉芽孢桿菌BP-12在瓜類細(xì)菌性果斑病的防治方面具有良好的應(yīng)用前景.