蒙古馬母體與胎兒胃腸道NF-κB 信號通路相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)水平研究

藺雅楠，趙 媛，蘇少鋒，，趙俊利，李雅靜，陶金山，張建強，翁雅娟，武 慧，王秀美，趙一萍

（1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院/內(nèi)蒙古自治區(qū)馬屬動物遺傳育種與繁殖重點實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部馬屬動物遺傳育種與繁殖科學(xué)觀測實驗站/內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)馬屬動物研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；3.呼和浩特市行政審批和政務(wù)服務(wù)局綜合保障中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

腸道作為機體最大和最重要的免疫器官，對維持動物生長發(fā)育和機體健康具有重要意義［1］。機體中大多數(shù)免疫細(xì)胞來自腸道， 約70%的IgA在腸道產(chǎn)生， 超過90%的感染性疾病的產(chǎn)生與腸道有關(guān)［2］。 腸上皮細(xì)胞在腸道免疫系統(tǒng)中扮演重要角色， 通過產(chǎn)生抗菌化合物和細(xì)胞因子等對機體產(chǎn)生免疫作用，保護(hù)機體健康［2］。 腸上皮細(xì)胞與腸道相關(guān)的淋巴組織中的免疫細(xì)胞直接接觸。 腸道免疫系統(tǒng)主要由腸道菌群、腸上皮細(xì)胞、腸上皮內(nèi)淋巴細(xì)胞、 固有層淋巴細(xì)胞及派氏淋巴結(jié)等構(gòu)成，通過細(xì)胞因子、抗菌肽、代謝產(chǎn)物和眾多調(diào)節(jié)分子的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)緊密相連［3］。 腸上皮細(xì)胞表達(dá)特異性受體，例如Nod 樣受體和Toll 樣受體等，這些受體被激活后可誘導(dǎo)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)， 進(jìn)一步激活核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）途徑［4］。NFκB 在大部分細(xì)胞中均有表達(dá)， 尤其是在小腸部位。當(dāng)機體受到外界刺激時，NF-κB 可以通過調(diào)節(jié)細(xì)胞因子基因的表達(dá)，參與機體免疫應(yīng)答，此外，NF-κB 在炎癥反應(yīng)和抗病原體過程中也發(fā)揮重要作用［5］。 NF-κB 家族包括p65 （RelA）、NF-κB1（p50/p105）、NF-κB2 （p52/p100）、RelB 和c-Rel，這些蛋白之間可以相互作用， 并且結(jié)合形成同源或異源二聚體，激活或抑制多種基因的表達(dá)［6］，來自抗原受體、 模式識別受體、TNF 和IL-1 細(xì)胞因子家族成員的受體以及其他多種信號可誘導(dǎo)NFκB 異二聚體的差異激活［7-9］。 NF-κB 信號通路激活因子主要包括TNF-α、IL-1β、IL-8 等［10-12］。

研究表明， 腸道免疫功能在動物胎兒時期就已經(jīng)開始建立并且逐漸形成［13-14］。 在母馬妊娠期間，胎兒的免疫系統(tǒng)就已經(jīng)產(chǎn)生IgM［15］和IgG［16］。成年馬的免疫成分似乎都存在于馬駒身上［17］，成年馬有60%以上基因的表達(dá)水平高于新生馬駒［18］。馬胎兒的免疫系統(tǒng)從開始建立到趨于完善是一個復(fù)雜的過程， 更好地了解其形成過程對于解析馬多種疾病的發(fā)病機制是必要的。目前，關(guān)于母馬和新生馬駒的免疫研究較多［15-17］，幾乎沒有關(guān)于妊娠母馬與胎兒免疫的研究， 圍繞馬胎兒時期腸道免疫功能的研究更少。 蒙古馬作為我國優(yōu)良的地方馬品種，具有耐粗飼、抗性強等特點［19］。 鑒于腸道在機體免疫功能中的重要作用， 該研究采用實時熒光定量PCR 方法（qPCR）檢測蒙古馬母體及胎兒胃腸道不同區(qū)段組織中NF-κB 信號通路6個相關(guān)基因的mRNA 相對表達(dá)水平， 分析這些基因在母體及胎兒胃腸道組織中的表達(dá)譜， 比較其在母體及胎兒胃腸道組織中表達(dá)水平的差異，以期為豐富蒙古馬母體及胎兒免疫系統(tǒng)的研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗動物

從內(nèi)蒙古包頭市達(dá)爾罕茂明安聯(lián)合旗某養(yǎng)殖場隨機選取3 匹懷孕的健康蒙古馬， 母馬平均年齡（8.17±2.75）歲，胎兒平均日齡（165±30）d。

1.1.2 主要試劑

Trizol 試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司；硼酸，北京市新光化學(xué)試劑廠產(chǎn)品；瓊脂糖，Life Technologies Corporation 公 司 分 裝； 核 酸 染料，Bioteke Gorporation 公司分裝；DNA Marker DL 2 000、PrimeScriptTMRT Master Mix （Perfect Real Time） 試劑盒、TB Green?Premix ExTaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試劑盒等分子生物學(xué)試劑，購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.1.3 主要儀器

實時熒光定量PCR 儀（型號：CFX96 Touch）、凝膠成像系統(tǒng)（型號：Gel Doc XR+），美國Bio-Rad公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀（型號：DYY-11），北京六一儀器廠產(chǎn)品； 酶標(biāo)儀 （型號：NanoDrop 2000C），美國Thermo 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品采集

將3 匹懷孕蒙古馬屠宰， 屠宰過程中取出胎兒，分別采集母體及胎兒的胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、結(jié)腸（大結(jié)腸、小結(jié)腸）和直腸組織，于超低溫冰箱（-80 ℃）中保存。

1.2.2 總RNA 提取及質(zhì)量檢測

采用Trizol 法提取蒙古馬母體及胎兒胃腸道不同區(qū)段組織的總RNA。 稱取0.1 g 組織樣品研磨成粉末狀態(tài)，加入1 mL Trizol 裂解，渦旋混勻，室溫靜置10 min，加入0.2 mL 氯仿混勻，室溫靜置15 min，4 ℃12 000 r/min 離心15 min， 留上清液加入0.5 mL 異丙醇混勻，室溫靜置10 min，4 ℃12 000 r/min 離心10 min， 棄上清液， 加入1 mL 75%乙醇， 渦旋振蕩，4 ℃7 500 r/min 離心5 min，干燥10 min，使用無RNA 酶水100 滋L 反復(fù)吹打幾次。 檢測提取的樣本總RNA 質(zhì)量和濃度，樣品的OD260nm/OD280nm值在1.8～2.0 時可用于后續(xù)試驗。

1.2.3 cDNA 的合成

按照PrimeScriptTMRT Master Mix（Perfect Real Time） 試劑盒說明書進(jìn)行cDNA 的合成， 合成方法、反應(yīng)體系和條件參照參考文獻(xiàn)［20］中報道的方法。 總反應(yīng)體系為10 滋L， 制備后立即進(jìn)行反應(yīng)，反轉(zhuǎn)錄條件為：37 ℃15 min，85 ℃5 s，溫度降至4 ℃終止反應(yīng)，cDNA 合成后于-80 ℃保存。

1.2.4 qPCR 引物設(shè)計

以β-actin 基因作為內(nèi)參基因， 選取NF-κB信號通路上的6 個相關(guān)基因NF-κB p50、NF-κB p65、NFKBIA、IL-1β、TNF-琢 和IL-8 作為目的基因。 根據(jù)NCBI 的GenBank 數(shù)據(jù)庫中收錄的基因序列，使用Primer Premier 3.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計，利用NCBI 的Primer-BLAST 功能驗證設(shè)計引物的特異性。引物序列、參考序列及目的片段長度如表1 所示。該研究所用引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 qPCR 引物信息

1.2.5 qPCR 檢測基因mRNA 相對表達(dá)量

使用實時熒光定量PCR 儀對不同組織各基因的mRNA 相對表達(dá)量進(jìn)行分析。 按照TB Green?Premix ExTaqTMⅡ（Tli RNaseH Plus）試 劑盒說明書操作， 反應(yīng)體系總計20 滋L：TB Green Premix ExTaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×conc.）10 滋L，正向引物（10 滋mol/L）0.8 滋L，反向引物（10 滋mol/L）0.8 滋L，cDNA 模板1.0 滋L，DNase/RNase-Free 去離子水7.4 滋L。qPCR 反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變 性60 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，40 個循環(huán)。最終在4 ℃下保存?zhèn)溆?，每個樣品的各基因均進(jìn)行3 次擴增， 分別得出各樣品各基因的Ct 值。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理

以β-actin 基因為內(nèi)參基因，采用2-△Ct（△Ct=目的基因的Ct 值-內(nèi)參基因Ct 值） 定量分析方法，對NF-κB 信號通路上目的基因的mRNA 相對表達(dá)量進(jìn)行定量分析。采用SPSS 9.0 統(tǒng)計學(xué)軟件，應(yīng)用單因素方差分析法對單個基因的mRNA 相對表達(dá)量在不同組織間的差異進(jìn)行顯著性檢驗，利用LSD 法進(jìn)行多重比較； 采用t 檢驗法分析母體和胎兒相同組織中單個基因的mRNA 相對表達(dá)量差異。P＜0.05 表示差異顯著，P＜0.01 表示差異極顯著，P≥0.05 表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 蒙古馬母體胃腸道NF-κB 信號通路相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)量

檢測的6 個基因 （NF-κB p50、NF-κB p65、NFKBIA、IL-1β、TNF-琢 和IL-8） 在蒙古馬母體胃腸道不同區(qū)段（胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、大結(jié)腸、小結(jié)腸和直腸）組織中均有表達(dá)（見圖1A）。8 個組織中NF-κB p65、NF-κB p50 和NFKBIA 基因的mRNA 相對表達(dá)量均較高， 而其他3 個基因的mRNA 相對表達(dá)量普遍較低。 各基因的mRNA相對表達(dá)量在不同組織之間存在差異， 但均未達(dá)到顯著（P≥0.05）水平（見圖1B）。NF-κB p50 基因在胃中表達(dá)量最高， 其次是盲腸和直腸；NF-κB p65 基因在胃中表達(dá)量最高， 其次是盲腸；NFKBIA 基因在胃中表達(dá)量最高，其次是盲腸和回腸；IL-1β 基因在直腸中表達(dá)量最高；TNF-琢基因在胃中表達(dá)量最高，其次是盲腸；IL-8 基因在盲腸中表達(dá)量最高。

圖1 NF-κB 信號通路相關(guān)基因在蒙古馬母體胃腸道不同區(qū)段組織中的mRNA 相對表達(dá)量

2.2 蒙古馬胎兒胃腸道NF-κB 信號通路相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)量

NF-κB 信號通路的6 個基因 （NF-κB p50、NF-κB p65、NFKBIA、IL-1β、TNF-琢 和IL-8）在蒙古馬胎兒胃腸道的8 個組織（胃、十二指腸、空腸、回腸、盲腸、大結(jié)腸、小結(jié)腸和直腸）樣品中均有表達(dá)（見圖2A）。 總體來看，在8 個組織中，NF-κB p50、NF-κB p65 和NFKBIA 基因的mRNA 相對表達(dá)量均較高， 而IL-1β、TNF-琢 和IL-8 基因的mRNA 相對表達(dá)量均較低。 各基因的mRNA 相對表達(dá)量在不同組織之間存在差異， 但均未達(dá)到顯著（P≥0.05）水平（見圖2B）。NF-κB p50 基因在直腸中表達(dá)量最高， 在回腸中表達(dá)量最低；NF-κB p65 基因在胃中表達(dá)量最高， 在大結(jié)腸中表達(dá)量最低；NFKBIA 基因在小結(jié)腸中表達(dá)量最高，在空腸中表達(dá)量最低；IL-1β 基因在直腸中表達(dá)量最高，在小結(jié)腸中表達(dá)量最低；TNF-琢基因在空腸中表達(dá)量最高，在盲腸中表達(dá)量最低；IL-8 基因在空腸中表達(dá)量最高，在小結(jié)腸中表達(dá)量最低。

圖2 NF-κB 信號通路相關(guān)基因在蒙古馬胎兒胃腸道不同區(qū)段組織中的mRNA 相對表達(dá)量

2.3 母體與胎兒胃腸道NF-κB 信號通路相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)量差異分析

由圖3 可知， 檢測的6 個基因在不同胃腸道組織的mRNA 相對表達(dá)量大部分是母體高于胎兒。 除直腸外，NF-κB p50 基因在母體胃腸道不同區(qū)段組織中的mRNA 相對表達(dá)量均高于胎兒，在回腸和盲腸中的表達(dá)量差異達(dá)到顯著（P<0.05）水平。 除空腸和回腸外，NF-κB p65 基因在母體胃腸道不同區(qū)段組織中的mRNA 相對表達(dá)量均高于胎兒，在大結(jié)腸中的表達(dá)量差異達(dá)到顯著（P<0.05）水平。 NFKBIA 基因在母體胃腸道不同區(qū)段組織中的mRNA 相對表達(dá)量均高于胎兒， 在大結(jié)腸中的表達(dá)量差異達(dá)到顯著（P<0.05）水平。 除空腸外，IL-1β 基因在母體胃腸道不同區(qū)段組織中的mRNA 相對表達(dá)量均高于胎兒，但表達(dá)量差異均未達(dá)到顯著（P≥0.05）水平。 除空腸和直腸外，TNF-琢基因在母體胃腸道不同區(qū)段組織中的mRNA 相對表達(dá)量均高于胎兒， 但表達(dá)量差異均未達(dá)到顯著（P≥0.05）水平。IL-8 基因在母體胃腸道不同區(qū)段組織中的mRNA 相對表達(dá)量均高于胎兒， 在大結(jié)腸中的表達(dá)量差異達(dá)到顯著（P<0.05）水平。

圖3 蒙古馬母體與胎兒胃腸道不同區(qū)段組織中NF-κB 信號通路相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)量

3 討論

NF-κB 家族轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)細(xì)胞分化、增殖、存活、凋亡、免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)等多種生物學(xué)過程中起著重要作用［21］。 典型的NF-κB 被激活后可調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄，以應(yīng)對各種外部刺激，導(dǎo)致相應(yīng)生理病理變化［22］。 NF-κB p50 異源二聚體主要受IκBα 蛋白調(diào)控， 該蛋白的基因表達(dá)形式是NFKBIA 基因［9］。 趙一萍等［23］采用qPCR 技術(shù)分析了蒙古馬肝臟、脾臟、肺和血液中的NF-κB 信號通路上7 個基因的表達(dá)情況， 發(fā)現(xiàn)NF-κB p50、NF-κB p65 和NFKBIA 基因在4 個部位有較高表達(dá)， 而IL-1β、TNF-α 和IL-8 基因的mRNA 相對表達(dá)量均較低。 該研究對蒙古馬母體及胎兒胃腸道組織中NF-κB 信號通路的6 個基因mRNA 相對表達(dá)量的測定結(jié)果與趙一萍等的研究結(jié)果基本一致，即NF-κB p50、NF-κB p65 和NFKBIA 基因在胃腸道8 個部位有較高表達(dá)， 而IL-1β、TNF-α和IL-8 基因的mRNA 相對表達(dá)量均較低，這可以說明NF-κB p50、NF-κB p65 和NFKBIA 基因在蒙古馬免疫調(diào)控中發(fā)揮重要作用。Collado-Romero等［24］和Li 等［25］使用qPCR 技術(shù)對豬不同部位免疫系統(tǒng)中相關(guān)基因的mRNA 相對表達(dá)水平進(jìn)行定量分析，分別發(fā)現(xiàn)NF-κB p50 基因的表達(dá)量為回腸＞空腸＞結(jié)腸和NF-κB p65 基因的表達(dá)主要集中在小腸部位。 該研究對蒙古馬母體腸道組織中NFκB p50 和NF-κB p65 基因mRNA 相對表達(dá)量的測定結(jié)果與Collado-Romero 等和Li 等的研究結(jié)果基本一致， 即NF-κB p50 基因在回腸中的表達(dá)量最高，其次為空腸和結(jié)腸，而NF-κB p65 基因基因在母體和胎兒的小腸部位有較高的表達(dá)量，說明NF-κB p50 和NF-κB p65 基因在蒙古馬腸道免疫調(diào)節(jié)中占據(jù)不可忽視的地位。 NF-κB 被激活后會誘導(dǎo)產(chǎn)生大量的促炎細(xì)胞因子，例如IL-1β、TNF-α、IL-8 等，進(jìn)而誘導(dǎo)炎癥發(fā)生［26］。Lindenberg等［27］通 過qPCR 測 量 編 碼IL-6，IL-10 和TNF-α等基因在24 匹健康馬的回腸、盲腸和結(jié)腸均有表達(dá)。 該研究對蒙古馬母體及胎兒胃腸道組織中NF-κB 信號通路的TNF-α 基因mRNA 相對表達(dá)量定量分析， 發(fā)現(xiàn)其在回腸、 盲腸和結(jié)腸均有表達(dá)，與Lindenberg 等研究結(jié)果基本一致，但表達(dá)量很低，這與選取的試驗動物體況健康，沒有發(fā)生腸道感染性疾病有關(guān)。研究表明IL-1β［28］、TNF-α［24］、IL-8［24］基因在不同組織中的表達(dá)量存在差異。 該研究檢測到IL-1β、IL-8 和TNF-α 基因在蒙古馬母體及胎兒胃腸道不同區(qū)段組織中的mRNA 相對表達(dá)量均較低，這可能與選取的馬匹體況健康、沒有發(fā)生炎癥有關(guān)，也可能說明腸道作為免疫器官，在蒙古馬母體和胎兒的生長發(fā)育中扮演重要角色，胎兒和母體的腸道免疫可能存在潛在聯(lián)系。該研究檢測的6 個基因在不同胃腸道區(qū)段組織中的mRNA 相對表達(dá)量基本表現(xiàn)為母體高于胎兒，這可能是由于母體的胃腸道發(fā)育比較完善， 而胎兒的腸道免疫正在建立， 并且母體腸道可能受到外源刺激，進(jìn)而觸發(fā)機體腸道免疫系統(tǒng)，產(chǎn)生連鎖反應(yīng)， 導(dǎo)致母體的基因表達(dá)量高于胎兒。 在該研究中， 對比母體和胎兒不同部位相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)量的差異發(fā)現(xiàn)，NF-κB p50 基因在母體和胎兒的盲腸及回腸中的表達(dá)量差異顯著 （P<0.05），NF-κB p65 基因和NFKBIA 基因在大結(jié)腸中的表達(dá)量差異顯著（P<0.05），并且3 個基因的表達(dá)量均為母體高于胎兒，充分說明NF-κB p50、NF-κB p65 和NFKBIA 基因在腸道免疫調(diào)節(jié)中的重要性。

4 結(jié)論

NF-κB 信號通路上6 個基因在蒙古馬母體和胎兒胃腸道8 個組織中均有表達(dá)， 且存在一定差異； 母體部分腸道區(qū)段組織中的NF-κB p50、NFκB p65、NFKBIA 基因mRNA 相對表達(dá)量顯著高于胎兒。