1 株羊源溶血性曼氏桿菌的分離鑒定、藥敏試驗及致病性研究

宋 越，王 娜，張 帆，張月梅，戴伶俐，白 帆，李曉艷，格根寶樂日，劉雙翼，王根云，趙世華

（1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2. 呼和浩特市動物疫病防控中心， 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010020）

近年來， 隨著我國養(yǎng)殖業(yè)規(guī)模化水平的不斷提高，家畜養(yǎng)殖密度不斷增加，由溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）引起的動物呼吸道疾病發(fā)病率不斷升高［1］。 溶血性曼氏桿菌原名為溶血性巴氏桿菌，為巴氏桿菌科曼氏桿菌屬成員［2］。 溶血性曼氏桿菌是引起牛、 羊等反芻動物呼吸道疾病的重要細(xì)菌性病原之一［3］。 溶血性曼氏桿菌屬于條件性致病菌， 當(dāng)家畜機體受到應(yīng)激或病原體侵襲導(dǎo)致免疫力下降時在體內(nèi)增殖。 在現(xiàn)有已定名的5 種曼氏桿菌中溶血性曼氏桿菌的致病性最強，而且是唯一能夠發(fā)酵L-阿拉伯糖的革蘭陰性菌［4］。 溶血性曼氏桿菌共有12 個血清型，在羊呼吸道中以A1 和A2 型最常見。 溶血性曼氏桿菌為兩端鈍圓、有莢膜的革蘭陰性短桿菌［5-6］。 綿羊與山羊感染溶血性曼氏桿菌可造成不定期的暴發(fā)性肺炎［7］。 目前，國內(nèi)外對溶血性曼氏桿菌引起的綿羊和山羊發(fā)病、死亡病例報道較多［8-9］，可見溶血性曼氏桿菌是在世界范圍內(nèi)具有較大危害性的羊呼吸道病原菌。 該研究通過對從某養(yǎng)殖場采集的發(fā)病山羊呼吸道組織臨床樣本進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定、藥敏試驗及致病性分析，確定造成該養(yǎng)殖場發(fā)生羊只死亡的致病菌， 通過藥敏試驗為指導(dǎo)臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

致病性試驗所用羔羊為2 月齡薩能奶山羊3只，購自內(nèi)蒙古呼和浩特市某養(yǎng)殖場。

1.2 病料來源

某養(yǎng)殖場發(fā)病山羊， 臨床表現(xiàn)為鼻腔內(nèi)有膿性分泌物，由于呼吸困難造成死亡，現(xiàn)場剖檢后采集氣管及肺臟組織。

1.3 主要試劑

TSA 固體培養(yǎng)基、TSB 液體培養(yǎng)基、細(xì)菌生化鑒定管， 購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；馬血清，購自北京索萊寶科技有限公司；細(xì)菌全基因組DNA 提取試劑盒， 購自天根生化科技 （北京） 有限公司；Trans2K Plus ⅡDNA Marker、2×EasyTaq PCR SuperMix， 購自北京全氏金生物技術(shù)有限公司。 左氧氟沙星、土霉素、環(huán)丙沙星、替米考星、阿奇霉素、慶大霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、泰樂菌素標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國食品藥品檢定研究院。

1.4 主要儀器設(shè)備

生物安全柜（型號：AC2-4S1），新加坡藝斯高有限責(zé)任公司產(chǎn)品；生化培養(yǎng)箱（型號：C18-90），上海申光儀器儀表有限公司產(chǎn)品； 恒溫?fù)u床 （型號：TS-2112B）， 上海比朗儀器制造有限責(zé)任公司產(chǎn)品；高速離心機（型號：pico17），賽默飛世爾科技（中國） 有限責(zé)任公司產(chǎn)品； 恒溫金屬?。ㄐ吞枺篊HB-T2）， 杭州博日科技有限公司產(chǎn)品；PCR 儀（型號：ABI9902）、電泳儀（型號：HE99X）、全自動凝膠成像儀（型號：TypeT2A），美國伯樂有限責(zé)任公司產(chǎn)品；恒溫水浴鍋（型號：SH-WB-6GDN3），韓國三興有限責(zé)任公司產(chǎn)品；旋渦振蕩器（型號：VM-10），大韓科學(xué)有限公司產(chǎn)品。

1.5 病原菌分離鑒定

1.5.1 病原菌分離

在無菌條件下，酒精擦拭消毒樣品表面，使用無菌剪子、鑷子小心剪開樣品表面，選取病變交界處組織用無菌鑷子取出后涂布于TSA 固體培養(yǎng)基，于培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h。

1.5.2 病原菌表型鑒定

1.5.2.1 革蘭染色鏡檢

對分離到的菌株純化培養(yǎng)3 次， 過夜培養(yǎng)后從平板上選取單菌落進(jìn)行革蘭染色鏡檢， 若鏡檢時鏡下視野內(nèi)細(xì)菌單一， 則挑取該菌落接種于TSB 液體培養(yǎng)基， 于恒溫?fù)u床37 ℃過夜培養(yǎng)，凍存菌液。

1.5.2.2 生化鑒定

使用一次性接種環(huán)挑取經(jīng)純化培養(yǎng)的分離菌株，接種至生化反應(yīng)管，具體操作按照生化鑒定管說明書， 接種后放置于生化培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24～48 h，判定生化反應(yīng)結(jié)果。

1.5.3 病原菌分子生物學(xué)鑒定

1.5.3.1 基因組DNA 提取

吸取培養(yǎng)24 h 的菌液1 mL，12 000 r/min 離心2 min，棄上清液，后續(xù)步驟參照細(xì)菌全基因組DNA 提取試劑盒說明書操作。

1.5.3.2 細(xì)菌16S rDNA 擴增及測序

使用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴增，上游引物（27F）序列：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，下游引物（1492R）序列：5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′，目的片段預(yù)期大小為1 500 bp。 PCR 擴 增 反 應(yīng) 體 系 為50 μL：2×EasyTaq PCR SuperMix 25 μL，ddH2O 21 μL，上、下游引物各1 μL，DNA 模板2 μL； 陰性對照反應(yīng)體系內(nèi)模版為ddH2O， 陽性對照反應(yīng)體系內(nèi)模版為已經(jīng)鑒定過的溶血性曼氏桿菌基因組DNA。 PCR反應(yīng)結(jié)束后， 吸取5 μL 擴增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，剩余產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測序。

1.5.3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹構(gòu)建及同源性分析

將測序獲得的序列登錄NCBI 網(wǎng)站， 利用BLAST 模塊進(jìn)行序列比對， 在獲得分離菌株同源性比對信息的同時， 下載大腸桿菌（Escherichia coli）、馬鏈球菌（Streptococcus equi）、多殺性巴氏桿菌（Pasteurella multocida）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumonia）、 溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）菌株的16S rDNA 序列，對分離菌株的16S rDNA 序列使用MegAlign 8.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹并進(jìn)行同源性分析。

1.6 藥敏試驗

依據(jù)美國臨床和實驗室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2013 年發(fā)布的《動物源細(xì)菌抗菌藥物敏感性試驗紙片法與稀釋法執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》（VET01-A4）進(jìn)行藥敏試驗及敏感性判定。將左氧氟沙星、土霉素、環(huán)丙沙星、替米考星、阿奇霉素、慶大霉素、恩諾沙星、氟苯尼考、泰樂菌素用TSB 液體培養(yǎng)基以5 120 μg/mL 為起始濃度進(jìn)行系列倍比稀釋。采用微量肉湯稀釋法，于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)， 第1～11 孔按照濃度由高到低的順序加入50 μL 稀釋藥液，并在第12 孔加入MH 液體培養(yǎng)基作為陰性對照。 將培養(yǎng)24 h 的羊源溶血性曼氏桿菌分離株菌懸液用MH 液體培養(yǎng)基稀釋至濃度約為1×106CFU/mL， 分別加入第1～11 孔，每孔100 μL。加樣完畢后加蓋振蕩1 min，封口膜密封后置于培養(yǎng)箱內(nèi)37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果。 在培養(yǎng)后的細(xì)胞培養(yǎng)板中加入5 g/mL 的紅四氮唑（TTC）溶液5 μL/孔，置于37 ℃培養(yǎng)1～2 h，觀察結(jié)果。 加入TTC 溶液是為準(zhǔn)確判斷最低抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC）值，當(dāng)孔內(nèi)不顯示紅色時即為細(xì)菌生長的MIC 值［5］。

1.7 致病性試驗

于TSB 液體培養(yǎng)基內(nèi)復(fù)蘇凍存的羊源溶血性曼氏桿菌分離株，經(jīng)3 次傳代后，將處于對數(shù)生長期的菌液稀釋至濃度約為1×106CFU/mL， 經(jīng)氣管攻毒2 月齡奶山羊，接種量為0.2 mL/只。 觀察72 h內(nèi)羔羊發(fā)病情況， 對死亡羔羊進(jìn)行病理剖檢及細(xì)菌分離鑒定，方法同上。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離及表型鑒定

2.1.1 革蘭染色鏡檢

從病料中分離出1 株疑似為溶血性曼氏桿菌的菌株，將其編號為DMQ-Y-Mh。 該菌株在TSA固體培養(yǎng)基上生長狀態(tài)良好，為針尖大小的圓形、半透明菌落，表面濕潤、光滑。 鏡檢觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)菌有莢膜，呈現(xiàn)兩端鈍圓、單個或者散在排列的革蘭陰性短桿菌。 結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 DMQ-Y-Mh 菌株在TSA 固體培養(yǎng)基上的生長情況

圖2 DMQ-Y-Mh 菌株革蘭染色鏡檢結(jié)果（1 000×）

2.1.2 生化鑒定

常用于曼氏桿菌鑒定的生化反應(yīng)項目有葡萄糖、乳糖、麥芽糖、L-阿拉伯糖、甘露糖等糖類，以及甘露醇、氧化酶、觸酶、脲酶等。按照生化鑒定反應(yīng)管說明書判定結(jié)果，結(jié)果見表1。 如表1 所示，DMQ-Y-Mh 菌株分解乳糖試驗、分解葡萄糖試驗、分解麥芽糖試驗、分解L-阿拉伯糖試驗、分解甘露醇試驗、 氧化酶試驗以及觸酶試驗結(jié)果均為陽性；分解甘露糖試驗與脲酶試驗結(jié)果為陰性。該菌株的生化反應(yīng)特征與溶血性曼氏桿菌基本相符。

表1 DMQ-Y-Mh 菌株生化反應(yīng)試驗結(jié)果

2.2 細(xì)菌分子生物學(xué)鑒定

以DMQ-Y-Mh 菌株的基因組DNA 為模版，利用細(xì)菌16S rDNA 通用引物進(jìn)行PCR 擴增，對獲得的擴增產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。由圖3 可知，擴增產(chǎn)物片段大小在1 500 bp 左右，與預(yù)期相符。 將測序所得序列提交至NCBI 進(jìn)行比對， 發(fā)現(xiàn)DMQ-Y-Mh 菌株與溶血性曼氏桿菌的16S rDNA 序列相似度最高。 構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹顯示，DMQ-Y-Mh 菌株與GenBank 中公布的溶血性曼氏桿菌（Mannheimia haemolytica）MF417605.1 株親緣關(guān)系最近，16S rDNA 序列相似度達(dá)到100%（見圖4、圖5）。

圖3 DMQ-Y-Mh 菌株16S rDNA PCR 擴增產(chǎn)物1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

圖4 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的DMQ-Y-Mh 菌株系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖5 基于16S rDNA 序列的DMQ-Y-Mh 菌株同源性分析

2.3 藥敏試驗

9 種抗菌藥物對DMQ-Y-Mh 菌株的MIC 測定結(jié)果見表2。 如表2 所示， 不同抗菌藥物對DMQ-Y-Mh 菌株的MIC 測定結(jié)果分別為：左氧氟沙星1.25 μg/mL， 土霉素5.00 μg/mL， 環(huán)丙沙星0.16 μg/mL， 替米考星40.00 μg/mL， 阿奇霉素2.50 μg/mL， 慶大霉素0.36 μg/mL， 恩諾沙星40.00 μg/mL， 氟苯尼考2.50 μg/mL， 泰樂菌素640.00 μg/mL。 根 據(jù)CLSI 藥 敏 試 驗 判 定 標(biāo) 準(zhǔn)，DMQ-Y-Mh 菌株對環(huán)丙沙星、阿奇霉素、慶大霉素敏感，對左氧氟沙星、土霉素、氟苯尼考中度敏感，對替米考星、恩諾沙星、泰樂菌素耐藥。

表2 抗菌藥物對DMQ-Y-Mh 菌株的MIC 測定及敏感性判定結(jié)果 單位：μg/mL

2.4 致病性試驗

接種DMQ-Y-Mh 菌株初期可見羔羊采食量下降，被毛粗亂，精神沉郁以及呼吸不暢。 隨著接種時間的延長，羔羊表現(xiàn)出體溫升高、流鼻涕、眼周出現(xiàn)大量分泌物、呼吸急促等現(xiàn)象；隨著病程的發(fā)展羔羊死亡。 剖檢時眼觀氣管及肺支氣管內(nèi)有黏性分泌物，肺臟組織有深紅色病灶，與正常肺臟組織界限明顯（見圖6）。 對肺臟及氣管組織進(jìn)行細(xì)菌分離，再次分離出溶血性曼氏桿菌。

圖6 接種DMQ-Y-Mh 菌株后羔羊肺臟及氣管眼觀病變

3 討論

該研究從由呼吸道癥狀引發(fā)的山羊死亡病例臨床樣本中分離出1 株細(xì)菌， 命名為DMQ-YMh。 該菌株在TSA 固體培養(yǎng)基上生長良好，菌落形態(tài)、 大小以及染色鏡檢結(jié)果均與溶血性曼氏桿菌相符。 DMQ-Y-Mh 菌株生化鑒定結(jié)果中，分解甘露糖一項為陰性，與王晨驍?shù)龋?0］報道的奶山羊源溶血性曼氏桿菌分離株的甘露糖分解特性一致，但與林裕勝等［11］、郜敏等［12］、馬弘財?shù)龋?3］、江金歡等［14］報道的山羊、綿羊、牦牛源溶血性曼氏桿菌分離株的甘露糖分解特性不一致。 原因可能是DMQ-Y-Mh 菌株缺少分解甘露糖所需的酶。

目前，對溶血性曼氏桿菌耐藥性的研究表明，一些分離菌株已經(jīng)對β-內(nèi)酰胺類、磺胺類以及氨基糖苷類抗菌藥物產(chǎn)生了耐藥性。已有研究報道，牛源和綿羊源溶血性曼氏桿菌對卡那霉素、 苯唑青霉素、鏈霉素、慶大霉素、頭孢呋肟、頭孢噻吩、羅紅霉素等多種抗菌藥物表現(xiàn)出耐藥性［15-18］。 該研究分離的DMQ-Y-Mh 菌株對環(huán)丙沙星、阿奇霉素、慶大霉素敏感，對替米考星、恩諾沙星、泰樂菌素表現(xiàn)出耐藥性。 DMQ-Y-Mh 菌株的耐藥表型與前人報道的分離自不同地區(qū)的溶血性曼氏桿菌的耐藥表型存在一定差異。研究表明，菌株來源的地區(qū)和畜種差異， 以及不同養(yǎng)殖場抗菌藥物的用藥習(xí)慣，可能導(dǎo)致菌株個體之間耐藥表型的不同。因此，需要根據(jù)病原菌的藥敏試驗結(jié)果，采取科學(xué)、有效的用藥方案， 避免因盲目使用抗菌藥物帶來的細(xì)菌耐藥性問題。

4 結(jié)論

溶血性曼氏桿菌是造成該養(yǎng)殖場發(fā)生羊只死亡的病原菌， 藥敏試驗結(jié)果為指導(dǎo)臨床用藥提供了參考。