蘆丁的生物活性及其在動物生產中的應用研究進展

李蘭柱，胡紅蓮，管曉軒，張昆侖，孟 迪，魏曉玲，孫滿吉

（1.東北農業(yè)大學動物科學技術學院，黑龍江 哈爾濱 150030；2.內蒙古自治區(qū)農牧業(yè)科學院動物營養(yǎng)與飼料研究所，內蒙古 呼和浩特 010031；3.內蒙古烏蘭察布市涼城縣永興鎮(zhèn)人民政府，內蒙古 涼城 013764）

中國養(yǎng)殖業(yè)已逐漸發(fā)展為集約化、 規(guī)模化的養(yǎng)殖模式， 抗生素作為加速動物生長的添加劑應用于畜禽生產， 但抗生素的殘留和耐藥等問題也日漸嚴重，對人們的身體健康產生威脅。農業(yè)農村部于2019 年7 月發(fā)布194 號公告， 要求自2020年實現飼料端禁抗、養(yǎng)殖端減抗和限抗，這促使人們尋找可用于促進動物生長、提高動物免疫力、增加飼料利用率的替抗產品。研究發(fā)現，植物多酚具有促進動物生長的潛力、 抗氧化能力和免疫調節(jié)特性，可成為抗生素的理想替代品，特別是黃酮類物質［1］。 黃酮類化合物具有抗炎、抗自由基、保護心腦血管系統等多種生物學功能， 蘆丁作為黃酮類化合物的典型代表， 因其重要的生物學功能受到了廣泛關注。 該文主要從蘆丁的結構、 提取方法、 生物活性以及在動物生產中的應用等方面進行總結，為蘆丁的進一步開發(fā)利用提供新思路。

1 蘆丁的結構及其性質

蘆?。╮utin）是一種黃酮醇苷類物質，包括黃酮酚苷元槲皮素和蘆丁二糖， 屬于維生素C2 家族， 化學名稱為5，7，3′，4′-四羥基-3-蕓香糖黃酮，結構式如圖1 所示，廣泛存在于槐米、蕎麥、水果（如蘋果、葡萄、檸檬）、蔬菜（如胡蘿卜、土豆）和飲料（如茶和酒）及藥用植物中［3-6］。 蘆丁是一種以槲皮素為苷元，以蕓香糖為糖基的糖苷。母核的基本結構為二苯基色原酮， 由3 個位于中央的碳原子連接2 個具有酚羥基的苯環(huán)所構成［7］。 蘆丁的單體為黃綠色粉末或針尖狀晶體， 通常含有3 個結晶水，味道苦澀，不易溶于冷水、氯仿、石油醚，易溶于熱水、堿性水、甲醇、吡啶、二甲基亞砜等。

圖1 蘆丁分子結構式［2］

2 蘆丁的提取方法

近幾年已經研究出了多種從植物中提取蘆丁的方法，包括傳統提取方法和現代提取方法。蘆丁在不同植物中的提取方法、 提取率以及優(yōu)缺點見表1。

表1 蘆丁提取方法、提取效果及優(yōu)缺點

3 蘆丁的吸收和代謝

研究證明，蘆丁在體內和體外均可被吸收。韋博仁等［13］通過研究蘆丁在大鼠體內和體外吸收程度發(fā)現，蘆丁富集、吸收、轉化的主要部位是小腸。根據體外模擬胃液和小腸液試驗發(fā)現， 蘆丁可以在模擬的胃液和腸液中穩(wěn)定存在2～4 h，為后續(xù)動物吸收利用蘆丁提供一定的基礎保障［14］。 王海玲等［15］體外培養(yǎng)Caco-2 細胞發(fā)現，蘆丁和槲皮素可以通過小腸上皮細胞吸收進入體內發(fā)揮生物學活性， 而且細胞破碎提取物色譜試驗顯示兩者在小腸上皮細胞內也可以被吸收。 以上體內和體外試驗均表明，蘆丁可以被動物吸收，進入機體發(fā)揮生物學活性。通過奶牛十二指腸灌注試驗表明，牛十二指腸注射蘆丁后，槲皮素的生物利用度較低，血漿中的濃度可以忽略不計， 可能是由于蘆丁在大腸中的停留時間較短，蘆丁的水解程度較低，釋放的槲皮素苷元快速降解［16］。 根據蘆丁給藥濃度不同，瘤胃對蘆丁吸收存在一定差異，例如在奶牛瘤胃內給予10 mg/kg 的蘆丁，30 min 后在血漿中獲得最大濃度； 在應用更高劑量的蘆丁（50 mg/kg）時，可在42 min 后觀察到最大血漿濃度［17］。 由于蘆丁代謝吸收存在物種與組織差異， 與單胃動物相比，蘆丁進行瘤胃內給藥時會被動物迅速吸收，30～45 min 后在血漿中出現峰值，而在單胃動物血液中則會較慢出現峰值， 例如豬和人類血漿中蘆丁在2～4 h 達到最大濃度［18］。 由于組織分布和物種差異，蘆丁無論給藥形式和劑量如何，在瘤胃內施用后，吸收會迅速發(fā)生。 另外，反芻動物對蘆丁的利用還與日齡有關，研究顯示，出生2 d 的犢牛對蘆丁的生物利用度顯著高于出生29 d 的犢牛［19］。 大部分的黃酮類化合物不易被哺乳動物腸道吸收， 而是在腸道菌群代謝作用下分解為動物可以吸收利用的類黃酮苷元。研究顯示，蘆丁單體可被腸道細菌產生的α-L-鼠李糖苷酶 （α-Lrhamnosidase）代謝為槲皮素-3-O-葡萄糖苷；而韋永氏球菌（Veillonella sp.32）和擬桿菌（Bacteroides sp.42）對蘆丁具有較高的代謝分解作用，使蘆丁完全代謝為無色花青素［20］。 通過體外混合培養(yǎng)結腸腸道菌群發(fā)現， 蘆丁可以作為混合培養(yǎng)結腸腸道菌群的有效底物， 蘆丁可在結腸菌群的作用下分解為3-羥基苯乙酸和3-（3-羥基苯基）丙酸［21］。上述研究表明， 蘆丁的代謝方式主要是通過腸道菌群的分解作用而生成槲皮素、 無色花青素等物質被機體吸收利用。 在荷斯坦奶牛瘤胃內給予100 mg/kg 蘆丁前后收集血漿、 尿液和瘤胃液樣本，然后通過靶向和非靶向液相色譜-質譜（liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS）的代謝組學分析發(fā)現，在血漿和尿液中4-甲基鄰苯二酚硫酸鹽被確定為蘆丁最豐富的代謝產物， 該代謝產物的形成有益于蘆丁在奶牛體內充分發(fā)揮其生物學活性， 同時該研究揭示了蘆丁在奶牛瘤胃內的代謝途徑， 其主要過程為蘆丁→槲皮素→超支化 聚 酰 胺 胺 （redox-degradable hyperbranched polyamidoamine，DHPAA）→4-甲基兒茶酚，微生物代謝產物4-甲基鄰苯二酚是蘆丁的生物可利用終產物［22］。

4 蘆丁的生物學功能

4.1 抗炎作用

炎癥是一個復雜的過程， 當組織受到有害刺激，如病原體感染或損傷時，就會發(fā)生炎癥。 在炎癥發(fā)生時， 會有許多炎癥因子產生， 例如細胞因子、活性氧、信號分子等。 蘆丁通過抑制環(huán)加氧酶和脂加氧酶的活性，從而減少炎癥的發(fā)生［23］。常見的炎癥因子有腫瘤壞死因子-α （tumor necrosis factor，TNF-α）、核因子κB（nuclear factor-κB，NFκB）等。 在體外培養(yǎng)人皮膚角質形成細胞試驗中，使用蘆丁和抗壞血酸的混合物顯著降低紫外線誘導的促炎癥因子NF-κB 和促凋亡蛋白的表達，表明使用蘆丁和抗壞血酸可能對紫外線誘導的皮膚損 傷 起 到 細 胞 保 護 作 用［24］。 髓 過 氧 化 物 酶（myeloperoxidase，MPO）、一氧化氮（NO）等是發(fā)生炎癥時產生的主要信號分子。Arowoogun 等［25］研究發(fā)現，蘆丁可以降低MPO 活性、NO 水平、環(huán)氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）和誘導型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase，iNOS）的濃度， 表明蘆丁對Cu2+處理的大鼠具有一定的抗炎作用。在LPS 誘導的肺組織損傷中，蘆丁減少NFκB 通路的激活， 抑制了iNOS 和血管細胞間黏附分子-1（cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的產生，減少中性粒細胞浸潤，從而對肺損傷起到保護作用［26］。蘆丁單體很難被動物機體吸收利用。負載殼聚糖微球的蘆丁比單體蘆丁表現出更好的抗炎效果，與未處理組相比，白介素-1β（IL-1β）和白介素-6（IL-6）濃度分別降低了50%和30%［27］。 由此可以看出，蘆丁具有良好的抗炎特性，可以作為飼用添加劑進行生產使用， 減少動物炎癥損傷帶來的危害。

4.2 抗氧化作用

氧化應激是應激反應中最常見的一種， 活性氧（reactive oxygen species，ROS）是氧化應激時產生的主要物質。 細胞代謝產生一系列ROS 自由基，如羥自由基、過氧自由基和超氧陰離子，自由基使機體發(fā)生脂質過氧化， 蛋白質、DNA 的分子結構發(fā)生改變，機體清除自由基的能力下降，導致細胞發(fā)生凋亡。 蘆丁的抗氧化作用主要通過抑制黃嘌呤氧化酶活性和脂質過氧化作用以及螯合鐵來清除自由基，同時，蘆丁還可以增強機體內具有抗自由基作用的酶活性來抑制脂質過氧化的發(fā)生［28］。蘆丁有向自由基提供電子的傾向，將它們轉化為更穩(wěn)定的自由基中間體， 從而抑制自由基反應進一步發(fā)生［29］。 低劑量蘆丁可以與氧化應激下的蛋白質通過共價和非共價交聯改變蛋白的結構、疏水性和粒徑，有效地提高凝膠的性能；高劑量蘆丁則會產生不良的蛋白凝膠網絡［30］。Nafees等［31］發(fā)現蘆丁可以通過調節(jié)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK） 途徑減少Wistar 大鼠的氧化應激和炎癥反應。綜上所述，蘆丁表現出良好的抗氧化性能。

4.3 抗病原微生物作用

蘆丁的抑菌機制是蘆丁的酚羥基與病原微生物的細胞膜親水基團相互作用， 使磷脂雙分子層的流動性發(fā)生改變，影響細胞膜的電子傳遞鏈，從而抑制病原微生物的生長。 蘆丁的酚羥基結構可以與金屬離子發(fā)生螯合作用增強其抑菌效果。 通過抑菌圈試驗發(fā)現， 蘆丁對多種細菌均有較好的抑制作用，例如大腸桿菌和葡萄球菌等，而且當蘆丁達到一定濃度時可以對細菌產生殺滅效果［32］。轉肽酶A（sortase A）具有抗無乳鏈球菌感染的作用， 蘆丁通過抑制sortase A 活性可以降低無乳鏈球菌對纖維連接蛋白的黏附作用以及影響生物膜的形成，從而降低羅非魚對無乳鏈球菌的感染率，且呈劑量依賴性；通過動物飼養(yǎng)試驗表明，蘆丁對羅非魚無乳鏈球菌感染具有顯著的保護作用，具體表現為蘆丁可以減少富含絲氨酸的結構 （serine-rich region 1，SRR1）在細菌表面的錨定作用以及抑制細菌生物膜的形成等［33］。 蘆丁還具有一定抗病毒活性， 其抗病毒活性是通過與感染期間所需的一個或多個細胞蛋白相互作用介導， 可以與流感病毒神經氨酸酶大分子的非活性部位結合，產生非競爭性抑制，從而抑制病毒活性［34］。

5 蘆丁在動物生產中的應用

5.1 蘆丁在家禽生產中的應用

蘆丁作為一種天然黃酮類化合物， 能夠改善家禽的生產性能。 李穎平等［35］研究發(fā)現，在AA 肉雞日糧中添加0.8%蘆丁粉時，AA 肉雞的平均日增重顯著提高，生長加快，說明蘆丁具有加速AA肉雞新陳代謝、促生長功能，同時降低了肉雞腹水綜合征的發(fā)生率。 在肉雞日糧中添加1 g/kg 蘆丁，可以提高肉雞的生長性能、抗氧化能力，抑制脂肪生成，從而降低脂肪沉積和血脂水平［36］。 研究表明， 蘆丁通過減少群體感應信號分子AI-2 的產生、 生物膜形成和毒力基因的表達來干擾群體感應（quorum sensing，QS），從而減少禽致病性大腸桿菌（avian pathogenic Escherichia coli，APEC）感染的雞Ⅱ型肺細胞的細胞損傷， 該研究可為雞大腸桿菌病的預防提供新的依據［37］。也有研究顯示，蘆丁作為飼料添加劑對產蛋后期母雞的生產性能沒有顯著影響，但顯著增加了蛋殼厚度，避免了運輸過程中雞蛋的破損，提高了經濟效益［38］。

5.2 蘆丁在反芻動物生產中的應用

較單胃動物而言，反芻動物具有4 個胃室，研究顯示， 在飼料中添加蘆丁可影響反芻動物瘤胃的發(fā)酵以及瘤胃的酶活性。占今舜等［39］研究發(fā)現，在日糧中添加50 mg/kg 的蘆丁可以顯著提高湖羊平均日增重，降低料重比，影響瘤胃蛋白的降解，并能夠清除血清膽固醇； 蘆丁能夠增加瘤胃纖維素降解酶的活性，顯著提高湖羊瘤胃液中乙酸、丙酸以及總揮發(fā)性脂肪酸含量， 提高纖維素的利用率，改善瘤胃的環(huán)境和主要功能。 此外，蘆丁可以提高動物生產性能以及抗氧化性能。 唐宇杰等［40］研究發(fā)現，日糧中添加2 g/d 蘆丁能夠顯著提高熱應激奶牛的生產性能、飼喂效率和改善飼料質量。孔慶友［41］研究發(fā)現，奶牛日糧中添加蘆丁可以顯著提高奶牛的產奶性能， 但對血清中免疫球蛋白G （immunoglobin G，IgG）、 總蛋白 （total protein，TP）、血糖（blood glucose，GLU）含量影響不顯著。在一項綿羊次級卵母細胞體外培養(yǎng)的研究中，0.1 μg/mL 蘆丁作為基礎培養(yǎng)基中單一的抗氧化劑，替代轉鐵蛋白、硒和抗壞血酸，可維持卵泡活力長達12 d，可以提高谷胱甘肽（glutataione，GSH）水平［42］。100 μg/mL 蘆丁可以有效提高體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細胞的抗氧化功能，抑制其細胞凋亡［43］。

5.3 蘆丁在水產動物中的應用

許多不同來源的天然化合物（細菌成分、動物或植物提取物等） 已被作為預防水產養(yǎng)殖中病原菌感染的潛在免疫刺激劑。 蘆丁作為一種天然植物提取物受到眾多研究者的青睞。研究表明，蘆丁對草魚的生長性能無影響， 但低劑量的添加可以有效地提高草魚腸道的消化吸收能力和非特異性免疫力［44］。 蘆丁作為綠色飼料添加劑有提高動物抗炎活性以及抗氧化功能的作用。 鄭堯等［45］研究發(fā)現， 蘆丁可以提高吉富羅非魚血清抗體和抗炎因子含量，且具有劑量依賴性。 Baldissera 等［46］研究發(fā)現，添加3 mg/kg 蘆丁可以降低銀鯰魚大腦中氧化應激生物標志物的產生，表明蘆丁具有抗神經毒性作用； 同時有研究者發(fā)現蘆丁在保護銀鯰魚肝臟免受土霉素誘導的氧化應激和細胞凋亡方面也具有重要作用［47］。 給凡納濱對蝦注射10、20、50 mg/g 蘆丁溶液， 可以提高血液中酚氧化酶活性和超氧陰離子水平，增強機體免疫功能［48］。 綜上所述，蘆丁可以作為免疫刺激劑應用于水產養(yǎng)殖業(yè)，提高水產生物的成活率，提高經濟效益。

6 小結與展望

蘆丁作為一種來源廣泛的黃酮類化合物，具有抗炎、抗氧化、提高動物生產性能等特點，在緩解動物氧化應激、 炎癥和增強免疫能力等方面具有廣闊的應用前景和開發(fā)潛力， 可作為一種綠色飼用抗生素代替品。 近幾年對蘆丁生物活性研究諸多，但大多數研究集中在小鼠，在畜禽中的應用報道較少， 且蘆丁在使用過程中的劑量和毒性的關系沒有明確表述。到目前為止，有關于蘆丁的研究主要集中在生產性能、抗炎、抗氧化等方面，未見其作用機制報道，為了填補這一方面的空白，需要深入研究其對機體產生生物學活性的作用機制，如信號通路、作用靶點、與靶點結合模式的研究等。為了全面了解蘆丁的替抗?jié)摿?，仍然需要進行大量的研究與探索。