PTD-FNK 蛋白對雄性小鼠生理功能的影響

劉嘉欣，劉浩宇，余波龍，陳 婷，胡傳活，李 珣

（廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004）

PTD-FNK 蛋白由超級抗凋亡蛋白FNK 與蛋白轉(zhuǎn)導(dǎo)域PTD 融合而成［1］，可以保護(hù)細(xì)胞免受多種病理條件誘導(dǎo)的死亡［2］。 目前PTD-FNK 蛋白在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域研究較多，如治療化療引起的禿頭癥［3］、提高骨髓單個核細(xì)胞移植效率［1］、保護(hù)細(xì)胞免受凍融誘導(dǎo)的死亡損傷［4］。 PTD-FNK 蛋白的抗細(xì)胞凋亡優(yōu)勢具有廣闊的發(fā)展前景。 有研究發(fā)現(xiàn)，PTD-FNK 蛋白能迅速透過血腦屏障進(jìn)入腦細(xì)胞［5］。 而在大鼠心臟缺血/灌注模型中，PTD-FNK蛋白只在局部缺血早期才能進(jìn)入心肌細(xì)胞［6］。 這些結(jié)果提示，PTD-FNK 蛋白對動物機體并非具有完全的保護(hù)作用。該試驗以雄性小鼠為研究對象，探討PTD-FNK 蛋白對小鼠飲食、生長、生殖及其他生理功能的影響，以期為進(jìn)一步闡明PTD-FNK蛋白對機體的保護(hù)作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 實驗動物

16 只6 周齡健康雄性C57BL/6J 小鼠， 體重（25±2）g，購自廣西醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。

1.1.2 試驗試劑

PTD-FNK 蛋白由廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院解剖實驗室提供。Trizol、RNA 酶抑制劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR Master Mix 均購于南京諾唯贊生物科技有限公司。

1.1.3 試驗儀器

BSM-2200.2 型電子分析天平，上海卓精電子科技有限公司產(chǎn)品；Light Cycler 96 型實時熒光定量PCR 儀，Roche 公司產(chǎn)品；DT-810 型紅外線體溫檢測儀，南北儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗方法

1.2.1 實驗動物分組及飼養(yǎng)管理

小鼠在溫度為（24±2）℃、濕度為（50±10）%、光照為12L∶12D 的環(huán)境下單籠飼養(yǎng)， 自由采食飲水。 適應(yīng)性飼養(yǎng)2 周后，將小鼠隨機分為2 組，即對照組 （腹腔注射生理鹽水0.1 mL/只） 和PTDFNK 蛋白組［腹腔注射300 μg/（kg·BW）PTD-FNK蛋白］，每組8 只，每天腹腔注射給藥1 次（19：00），連續(xù)給藥7 d。

1.2.2 小鼠健康指標(biāo)及采食飲水量測定

試驗期間，每天記錄小鼠體重、體溫、血糖以及白天和夜間的采食量和飲水量， 并統(tǒng)計當(dāng)天的總采食量和總飲水量。

1.2.3 小鼠生長性能測定

于試驗第1 天和最后1 天測量鼻肛距， 分別計算試驗開始時和試驗結(jié)束時體長。 計算試驗期間的體增重、試驗前后的Lee′s 指數(shù)。體增重=試驗結(jié)束體重-試驗開始體重。 Lee′s 指數(shù)=體重（g）1/3×103/體長（cm）。

1.2.4 臟器指數(shù)的測定

將小鼠以頸椎脫臼法處死，取出心臟、肝臟、睪丸、脾臟、腎臟，稱重并計算臟器指數(shù)。 臟器指數(shù)=臟器濕重/小鼠體重［7］。

1.2.5 精子活力及質(zhì)膜完整率檢測

分離小鼠附睪，制備精子懸液［8］，精子活力檢測 參 考Pourentezari 等［9］和Sm 等［10］報 道 的 方 法。取10 μL 精液制片，高倍鏡（400 ×）下鏡檢，統(tǒng)計活動的精子數(shù)，計算精子活力。 精子活力=活動精子數(shù)/總精子數(shù)。

精子質(zhì)膜完整率檢測參考Ommati 等［11］和Dolati 等［12］報道的方法。 將精液與果糖-檸檬酸鈉低滲溶液混合，37 ℃水浴10 min， 取20 μL 混合液，高倍鏡（400×）下鏡檢，統(tǒng)計尾部彎曲的精子數(shù)，計算精子質(zhì)膜完整率。 精子質(zhì)膜完整率=尾部彎曲精子數(shù)/總精子數(shù)。

1.2.6 睪丸組織HE 染色

將固定好的睪丸組織流水過夜沖洗， 不同濃度酒精梯度脫水，正丁醇透明后浸蠟包埋，完全凝固后進(jìn)行切片，37 ℃烘干，4 ℃保存。 制備好的切片用二甲苯和無水乙醇梯度脫蠟、脫水，蘇木精、伊紅染色，酒精梯度脫水后封片，顯微鏡下觀察并拍照［13］。

1.2.7 睪丸細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激、內(nèi)分泌相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)量檢測

收集并研磨睪丸樣品， 采用Trizol 法提取睪丸總RNA，并按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書的步驟將RNA 產(chǎn)物逆轉(zhuǎn)錄為cDNA［14］，隨后利用qPCR 法檢測睪丸組織中細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Bax 和Caspase-3、氧化應(yīng)激相關(guān)基因SOD 和GPX1、內(nèi)分泌相關(guān)基因STAR 和17β-HSD 的mRNA 相對表達(dá)量， 內(nèi)參基因為GAPDH。 反應(yīng)體系為20 μL：qPCR Master Mix 10 μL， 上、 下游引物各1 μL，ddH2O 7 μL，cDNA 模版1 μL。 反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)35 次；72 ℃延伸5 min。 所有反應(yīng)重復(fù)3 次［15］。 所用引物如表1 所示。 相關(guān)基因mRNA 相對表達(dá)量用2-△△Ct法計算。

表1 qPCR 所用引物信息

1.3 統(tǒng)計分析

試驗數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行獨立t 檢驗， 各組數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”（Mean±SEM）的形式表示，并進(jìn)行顯著性檢驗；用Graph-Pad Prism 9 軟件分析結(jié)果并作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 PTD-FNK 蛋白對小鼠健康指標(biāo)及采食飲水的影響

如圖1 所示， 與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組小鼠7 d 內(nèi)總采食量和7 d 內(nèi)夜間12 h 的總采食量均極顯著（P<0.001）降低，7 d 內(nèi)白天12 h 的總采食量無顯著（P>0.05）變化；此外，PTD-FNK蛋白組小鼠7 d 內(nèi)總飲水量顯著（P<0.05）降低，7 d 內(nèi)夜間12 h 的總飲水量極顯著 （P<0.001）降低，7 d 內(nèi)白天12 h 的總飲水量無顯著（P>0.05）變化；PTD-FNK 蛋白組的體溫和血糖均無顯著 （P>0.05）變化。

圖1 小鼠健康指標(biāo)及采食飲水情況

2.2 PTD-FNK 蛋白對小鼠生長性能的影響

如圖2 所示， 與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組小鼠的體增重、 試驗前后Lee′s 指數(shù)均無顯著（P>0.05）變化。

圖2 小鼠生長性能

2.3 PTD-FNK 蛋白對小鼠臟器指數(shù)的影響

如圖3 所示，與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組小鼠肝臟指數(shù)顯著（P<0.05）降低，小鼠的心臟、腎臟、脾臟、睪丸等臟器指數(shù)均無顯著（P>0.05）變化。

圖3 小鼠臟器指數(shù)

2.4 PTD-FNK 蛋白對小鼠精子質(zhì)量的影響

如圖4 所示， 與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組小鼠精子活力極顯著（P<0.01）提高，小鼠精子質(zhì)膜完整率無顯著（P>0.05）變化。

圖4 小鼠精子質(zhì)量

2.5 小鼠睪丸組織的病理學(xué)觀察

如圖5 所示，對照組小鼠睪丸組織結(jié)構(gòu)完整，生精上皮厚度正常，各級生精細(xì)胞排列整齊、發(fā)育良好， 有大量支持細(xì)胞和間質(zhì)細(xì)胞。 與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組生精小管中可見有大量的成熟精子，但部分生精小管間隙增大。

圖5 小鼠睪丸組織切片（HE，100×）

2.6 PTD-FNK 蛋白對小鼠睪丸細(xì)胞凋亡的影響

如圖6 所示， 與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組小鼠睪丸中Bax 基因的mRNA 相對表達(dá)量極顯著（P<0.01）升高，睪丸中Caspase-3 基因的mRNA相對表達(dá)量無顯著（P>0.05)變化。

圖6 小鼠睪丸Bax 和Caspase-3 基因的mRNA 相對表達(dá)量

2.7 PTD-FNK 蛋白對小鼠睪丸氧化應(yīng)激的影響

如圖7 所示， 與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組小鼠睪丸中SOD 基因的mRNA 相對表達(dá)量極顯著 （P<0.01） 提高， 小鼠睪丸中GPX1 基因的mRNA 相對表達(dá)量無顯著(P>0.05)變化。

圖7 小鼠SOD 和GPX1 基因的mRNA 相對表達(dá)量

2.8 PTD-FNK 蛋白對小鼠睪丸分泌功能的影響

如圖8 所示， 與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組小鼠睪丸中STAR 和17β-HSD 基因的mRNA相對表達(dá)量均無顯著（P>0.05）變化。

圖8 小鼠STAR 和17β-HSD 基因mRNA 相對表達(dá)量

3 討論

自人工合成PTD-FNK 蛋白出現(xiàn)以來，開展的研究以該蛋白對各組織、器官損傷的保護(hù)為主。目前 已 知PTD-FNK 蛋 白 對 凍 存 精 子［16］、缺 血/再 灌注引起的心肌梗死［6］、急性肺損傷［17］、短暫的全身缺血引起的海馬體神經(jīng)元死亡有保護(hù)作用［18］，鮮有針對整個動物機體的研究，PTD-FNK 蛋白調(diào)控動物機體生理功能的機制尚不清楚。 該試驗在已有研究的基礎(chǔ)上對健康小鼠進(jìn)行腹腔注射PTDFNK 蛋白試驗， 探索PTD-FNK 蛋白對動物機體生理功能的影響， 以期為提高畜禽的生長性能和繁殖優(yōu)良個體提供新思路。

PTD-FNK 蛋白是Bcl-xl 蛋白的一個功能型增強體［19］，Bcl-xl 蛋白為Bcl-2 家族抗凋亡分子中的一員［20］，由于與PTD-FNK 蛋白、FNK 蛋白相關(guān)的文獻(xiàn)報道鮮見， 該文多處引用與Bcl-xl 蛋白和Bcl-2 蛋白相關(guān)的文獻(xiàn)。 試驗中PTD-FNK 蛋白組小鼠采食量和飲水量顯著下降，可能與PTD-FNK蛋白的劑量及試驗時間有關(guān)。 與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組心臟、脾臟、腎臟、睪丸指數(shù)以及Lee′s 指數(shù)、體重、血糖、體溫均變化不明顯，但肝臟指數(shù)顯著下降。 據(jù)報道，正常情況下空腹時，血糖的維持依賴于促胰島素的分泌以及肝臟在胰島素的刺激下控制肝糖原生成和輸出［21］，該試驗中PTD-FNK 蛋白組小鼠可能因采食量顯著減少，糖原攝入不足， 導(dǎo)致肝臟增加分解代謝將肝糖原轉(zhuǎn)化為葡萄糖以維持血糖穩(wěn)定， 同時該組小鼠體重略有升高，這些可能是導(dǎo)致肝臟指數(shù)降低的原因。Ke 等［22］研 究 發(fā) 現(xiàn) 敲 除 小 鼠Bcl-2 基 因 后 小 鼠 的體重下降，瘦肉量顯著減少，結(jié)合該試驗結(jié)果，說明PTD-FNK 蛋白可能通過增加飼料轉(zhuǎn)化率以提高小鼠生長性能。

繁殖性能影響畜牧業(yè)的生產(chǎn)水平。 該研究試驗組小鼠睪丸生精細(xì)胞和成熟精子數(shù)增加， 原因可能是Bcl-xl 蛋白可使細(xì)胞免于死亡［23］，PTDFNK 蛋白作為Bcl-xl 蛋白的功能型增強體，可提高精細(xì)胞存活能力。PTD-FNK 蛋白組小鼠精子活力顯著上升，質(zhì)膜完整率無明顯變化，與李丹丹等［16］關(guān)于不同濃度PTD-FNK 蛋白對豬精子冷凍后質(zhì)膜完整率及精子活力的影響的研究結(jié)果一致， 說明PTD-FNK 蛋白可以提高小鼠的精子質(zhì)量。 同時PTD-FNK 蛋白組小鼠的SOD 基因和GPX1 基因mRNA 的表達(dá)明顯升高， 表明機體抗氧化的能力升高，Cuttle 等［24］利用氧化應(yīng)激模型比較遠(yuǎn)端和近端腎小管上皮細(xì)胞的存活力， 發(fā)現(xiàn)Bcl-xl 蛋白在體外腎小管上皮細(xì)胞易位可保護(hù)遠(yuǎn)端細(xì)胞免受氧化損傷，該試驗結(jié)果與之類似，由此可以推測PTD-FNK 蛋白有助于提高機體的抗氧化能力。與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組小鼠Bax基因的mRNA 表達(dá)顯著升高，Caspase-3 基因的mRNA 表達(dá)無明顯變化，表明該試驗中PTD-FNK蛋白沒有引起凋亡發(fā)生， 但引起了上游促凋亡基因表達(dá)的升高。Shimokawa 等［25］研究發(fā)現(xiàn)精子冷凍過程中加入300 nmol/L PTD-FNK 蛋白能抑制Caspase-3 和Caspase-9 的表達(dá)，劉蛟等［26］研究發(fā)現(xiàn)注射1 nmol/L PTD-FNK 蛋白可顯著降低冷凍水牛精子Caspase-3 基因mRNA 的表達(dá)， 而注射0.1、10、100 nmol/L PTD-FNK 蛋白則無明顯變化，說明Caspase-3 基因mRNA 的表達(dá)與注射PTDFNK 蛋白的劑量有關(guān)。 Cui 等［27］的研究發(fā)現(xiàn)亞慢性2,5-hexanedi-one 暴露導(dǎo)致抗凋亡蛋白Bcl-2和促凋亡蛋白Bax 在大腦皮層和小腦中的表達(dá)顯著 增 加；Wennersten 等［28］的 研 究 發(fā) 現(xiàn) 實 驗 性 腦 損傷導(dǎo)致Bcl-2 基因和Bax 基因均表達(dá)上調(diào),該試驗與以上結(jié)果類似。 此外，Oltvai 等［29］的研究發(fā)現(xiàn)Bax 蛋白本身并不會導(dǎo)致細(xì)胞死亡， 并且細(xì)胞凋亡與Bax 蛋白和Bcl-2 抗凋亡蛋白的比例有關(guān)，當(dāng)Bcl-2 蛋白過量時， 細(xì)胞受到保護(hù)， 因此注射PTD-FNK 蛋白并不會導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，但可能導(dǎo)致Bax 基因表達(dá)的升高，從而達(dá)到動態(tài)平衡，其具體的影響機制尚待進(jìn)一步探究。 與對照組相比，PTD-FNK 蛋白組小鼠STAR 基因和17β-HSD 基因mRNA 表達(dá)無明顯變化，表明睪丸的分泌正常，尚未發(fā)現(xiàn)PTD-FNK 蛋白影響小鼠睪丸正常分泌的報道，STAR 基因和17β-HSD 基因mRNA 表達(dá)無明顯變化，可能是由于機體穩(wěn)態(tài)相對平衡，對睪丸的分泌無影響。 線粒體既是產(chǎn)生活性氧（ROS）的主要場所，也是被攻擊的首要目標(biāo)［30］，ROS 的暴露具有觸發(fā)線粒體磷酸轉(zhuǎn)運體（mitochondrial phosphate transporter，MPT）誘 導(dǎo)RIRR（ROS-induced ROS release）［31］的潛能，使促凋亡蛋白和細(xì)胞色素C 釋放， 是細(xì)胞凋亡信號之一。 SOD 和GPX1 能高效清除機體內(nèi)ROS［32］，避免細(xì) 胞膜的氧化損傷和高氧條件下DNA 的破壞，Bcl-xl 蛋白可增加SOD 基因和GPX1 基因的表達(dá)及抑制Caspase-3 蛋白的活性， 維持線粒體膜電位和ATP 含量的穩(wěn)定，減緩細(xì)胞凋亡。 據(jù)報道，給心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染Bcl-xl 基因能顯著提高大鼠抗缺氧、抗損傷、抗氧化能力［6］。 PTD-FNK 蛋白可能通過增加抗氧化酶的表達(dá)來提高小鼠的抗氧化能力，防止線粒體遭受ROS 破壞， 以降低DNA 受到攻擊的概率，進(jìn)而阻礙內(nèi)源性的細(xì)胞異常凋亡，提高其抗凋亡能力。

綜上所述，短期注射PTD-FNK 蛋白會降低小鼠食欲，增強飼料轉(zhuǎn)化效率，提升精液品質(zhì)和機體的抗氧化能力。鮮有學(xué)者研究PTD-FNK 蛋白對動物食欲的影響，因此對影響小鼠食欲的PTD-FNK蛋白劑量把握不準(zhǔn)， 該試驗小鼠的體增重有所增長，這可能是PTD-FNK 蛋白作用的結(jié)果，其機制尚待進(jìn)一步探究； 而PTD-FNK 蛋白能通過增加SOD、GPX1 等抗氧化酶的表達(dá)來清除小鼠睪丸組織內(nèi)的ROS，進(jìn)而阻礙內(nèi)源性的細(xì)胞異常凋亡，提高機體細(xì)胞的抗氧化和抗凋亡能力， 從而提升生精細(xì)胞的活力。 由此可見， 在畜牧生產(chǎn)中，PTDFNK 蛋白有助于提高飼料的轉(zhuǎn)化率， 降低生產(chǎn)成本，同時有助于提高精液品質(zhì)和數(shù)量，獲得優(yōu)秀的畜禽個體。

4 結(jié)論

PTD-FNK 蛋白可以抑制雄性小鼠的采食、飲水及肝臟的生長發(fā)育，提高小鼠的精子質(zhì)量。