金絲桃素對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能、臟器指數(shù)及盲腸微生物多樣性的影響

宋雨桐，張子豪，呂海璇，趙昱陽(yáng)，高一帆，徐思齊，何玉華，鄧佳玫

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 左家 132109）

金絲桃屬植物的分布范圍很廣， 在我國(guó)西南地區(qū)種類和數(shù)量比較豐富，在東北地區(qū)較少，目前僅見3 種，即長(zhǎng)柱金絲桃、短柱金絲桃和烏腺金絲桃。金絲桃屬植物中的金絲桃素、類黃酮、蒽酮、蒽醌類、 酰基氯葡糖醇等活性物質(zhì)對(duì)機(jī)體具有保健功能［1］。 研究表明，金絲桃素具有抗病毒功能，如抗艾滋病病毒、禽流感病毒、口蹄疫病毒等［2］；并且具有抗多種腫瘤的功能， 包括一些危害嚴(yán)重的神經(jīng)瘤等；還具有抗抑郁、消炎等功效［3］。 金絲桃素適用于畜禽多種病毒性疾病和緩發(fā)的細(xì)菌性疾病及混合感染引起的體質(zhì)下降、營(yíng)養(yǎng)不良等情況，具有預(yù)防疾病、改善代謝和維持腸道健康狀態(tài)、促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)等作用，因此，金絲桃素成為飼料添加劑領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。 該研究通過在小鼠飲水中添加金絲桃素，評(píng)價(jià)其對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能、臟器指數(shù)及盲腸微生物多樣性的影響， 以期為金絲桃素作為飼料添加劑的開發(fā)和應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)藥品

金絲桃素（0.3%），購(gòu)自陜西恒德堂原料提取廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)管理

選擇100 只生長(zhǎng)發(fā)育良好、4 周齡雌性昆明小鼠， 由吉林省農(nóng)安縣開安鎮(zhèn)聚欣實(shí)驗(yàn)動(dòng)物經(jīng)銷處提供，單籠飼養(yǎng)，鼠籠內(nèi)墊有1.5～2.0 cm 厚的木屑?jí)|料，每個(gè)鼠籠單獨(dú)配1 個(gè)水瓶（250 mL），整個(gè)試驗(yàn)期間小鼠自由采食、自由飲水。

1.3 儀器及器械

電子秤（型號(hào)：YP10002），購(gòu)自上海衡際科學(xué)儀器有限公司；小鼠飼養(yǎng)籠、繁殖籠、墊料、小鼠籠架、耳號(hào)、耳號(hào)鉗、凍存管、注射器、剪刀、毛細(xì)管、鑷子、燒杯等實(shí)驗(yàn)室常用器械。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將100 只小鼠隨機(jī)分為5 個(gè)處理組中， 分別為0 g/L 組、1 g/L 組、2 g/L 組、4 g/L 組、8 g/L 組，每組20 只。將金絲桃素溶于水，供小鼠飲用，各組金絲桃素在飲水中的添加量分別為0、1、2、4、8 g/L。試驗(yàn)周期為33 d，預(yù)飼期5 d，正飼期28 d。小鼠日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平見表1。

表1 小鼠日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.5 測(cè)定指標(biāo)及方法

1.5.1 生長(zhǎng)性能

在正式試驗(yàn)的第1 天早上， 用電子秤對(duì)小鼠進(jìn)行空腹稱重，作為試驗(yàn)初始體重［4］；于試驗(yàn)最后1 天早上，對(duì)小鼠進(jìn)行最后1 次空腹稱重，作為試驗(yàn)?zāi)w重；計(jì)算平均日增重，平均日增重（ADG）=（試驗(yàn)?zāi)w重-試驗(yàn)初始體重）/試驗(yàn)天數(shù)［5］。正飼期每天記錄給料量和剩料量， 統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)期間總采食量，計(jì)算平均日采食量，平均日采食量（ADI）=試驗(yàn)期間總采食量/試驗(yàn)天數(shù)［6］。 根據(jù)平均日采食量和平均日增重計(jì)算料重比［7］，料重比（F/G）=平均日采食量/平均日增重［8］。另外，觀察各組小鼠試驗(yàn)期間健康狀況，記錄死亡小鼠數(shù)量，計(jì)算死亡率。

1.5.2 臟器指數(shù)

采用頸椎脫臼法處死小鼠［9］，采集心臟、肝臟、腎臟和脾臟，去除周圍脂肪及多余組織后稱重，計(jì)算臟器指數(shù)［10］，臟器指數(shù)=內(nèi)臟器官重/體重。

1.5.3 盲腸微生物多樣性

在0 g/L 組、1 g/L 組、2 g/L 組、4 g/L 組小鼠中每組隨機(jī)選擇5 只小鼠， 在冰上用無(wú)菌棉簽采集盲腸內(nèi)容物置于1.5 mL 離心管中， 共采集20個(gè)樣本，于-80 ℃冰箱暫時(shí)保存，用于菌群高通量測(cè)序。

高通量測(cè)序由杭州谷禾信息技術(shù)有限公司完成。 樣本接收后提取總DNA，對(duì)樣本進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格后進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。 對(duì)細(xì)菌16S rDNA V4 區(qū)域 進(jìn) 行PCR 擴(kuò) 增， 引 物 為515F （5′- GTGCCAGCMGCCGCGGTAA -3′ ） 和 806R （5′ -GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）。擴(kuò)增完成后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)PCR 產(chǎn)物合格且同批次陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照正常， 然后進(jìn)行混樣及文庫(kù)質(zhì)控。用Illumina HiSeq 平臺(tái)對(duì)檢測(cè)合格的文庫(kù)進(jìn)行高通量測(cè)序［11］，得到的測(cè)序數(shù)據(jù)用于物種鑒定分析。

1.6 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。數(shù)據(jù)用Excel 初步整理，用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行單因素方差分析， 用Duncan′s 法進(jìn)行多重比較，P<0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 金絲桃素對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能的影響

由表2 可知，飲水中添加1、2、4 g/L 的金絲桃素可提高平均日增重（P>0.05），并且隨著飲水中金絲桃素添加量的增加，小鼠的平均日增重呈先升高后降低趨勢(shì)，4 g/L 組平均日增重最高， 比0 g/L組增加21.21%；平均日采食量總體呈現(xiàn)先升高后降低趨勢(shì)（P>0.05），2 g/L 組平均日采食量最高，比0 g/L 組增加18.30%； 料重比呈現(xiàn)波動(dòng)變化 （P>0.05），4 g/L 組最低， 比0 g/L 組降低9.24%；0 g/L組有1 只小鼠死亡，死亡率為5.00%，其他4 組無(wú)小鼠死亡，死亡率均為0。

表2 不同濃度金絲桃素對(duì)小鼠生長(zhǎng)性能指標(biāo)的影響

2.2 金絲桃素對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響

由表3 可 知，1 g/L 組、2 g/L 組、4 g/L 組、8 g/L 組的心臟指數(shù)顯著（P<0.05）高于0 g/L 組；各組肝臟指數(shù)和脾臟指數(shù)無(wú)顯著（P>0.05）差異；腎臟指數(shù)呈現(xiàn)波動(dòng)變化，4 g/L 組顯著（P<0.05）低于1 g/L組。

表3 不同濃度金絲桃素對(duì)小鼠臟器指數(shù)的影響 單位：mg/g

2.3 金絲桃素對(duì)小鼠盲腸微生物多樣性的影響

如圖1 所示，4 組樣品的菌群組成在門水平上，以厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度最高，其次為擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria），3 個(gè)菌門占細(xì)菌總數(shù)的97.58%。其次為梭桿菌門（Fusobacteria）、脫鐵桿菌門（Deferribacteres）、柔壁 菌 門（Tenericutes）、放 線 菌 門（Actinobacteria）、糖化菌門（TM7）、藍(lán)細(xì)菌門（Cyanobacteria）、螺旋體門（Spirochaetes）。

圖1 不同濃度金絲桃素對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物門水平菌群結(jié)構(gòu)的影響

由表4 可知，4 組樣品的菌群組成在屬水平上，相對(duì)豐度排在前10 位的菌屬依次為普雷沃菌屬（Prevotella）、擬桿菌屬（Bacteroides）、考拉桿菌屬（Phascolarctobacterium）、CF231、顫 螺 菌 屬（Oscillospira）、薩特菌屬（Sutterella）、副瘤胃球菌屬（［Ruminococcus］）、巨 單 胞 菌 屬（Megamonas）、副擬桿菌屬（Parabacteroides）、螺桿菌屬（Helicobacter）。 飲水中添加1、2、4 g/L 的金絲桃素使小鼠盲腸內(nèi)容物中的普雷沃菌屬（Prevotella）和巨單胞菌屬（Megamonas）的相對(duì)豐度顯著降低（P<0.05）；1 g/L 組、2 g/L 組、4 g/L 組小鼠盲腸內(nèi)容物中的副瘤胃球菌屬（［Ruminococcus］）相對(duì)豐度顯著（P<0.05） 高于0 g/L 組；4 g/L 組小鼠盲腸內(nèi)容物中的副擬桿菌屬 （Parabacteroides）、 瘤胃球菌屬（Ruminococcus）、乳酸桿菌屬（Lactobacillus）相對(duì)豐度顯著（P<0.05）高于0 g/L 組。

表4 不同濃度金絲桃素對(duì)小鼠盲腸內(nèi)容物屬水平菌群相對(duì)豐度的影響 單位：%

3 討論

目前， 關(guān)于金絲桃素對(duì)動(dòng)物生長(zhǎng)性能的影響研究相對(duì)較少。 金絲桃素（6～12 mg/只）使感染球蟲雛雞的日增重由4.27 g 增加到6.70 g，相對(duì)增重率由44.0%提高到69.0%［12］。該試驗(yàn)中金絲桃素增加了小鼠采食量， 平均日增重也有所提高，4 g/L組料重比最低，與何紹港等［13］報(bào)道的烏腺金絲桃提取液能夠降低料重比的結(jié)論一致， 可見適宜水平的金絲桃素能夠使小鼠提高飼料轉(zhuǎn)化率。

金絲桃素對(duì)心悸、胸悶、胸痛等癥狀具有緩解作用［14-15］。 相關(guān)研究表明，金絲桃素能改善心律失常、 心肌缺血以及由于缺血導(dǎo)致的心肌損傷和生理功能下降，還能降低脂質(zhì)過氧化水平，對(duì)心肌缺血再灌注損傷起到保護(hù)作用［16-17］，該試驗(yàn)在小鼠的飲水中添加金絲桃素后，心臟指數(shù)有所升高，1 g/L 組、2 g/L 組、4 g/L 組、8 g/L 組與0 g/L 組相比差異顯著（P<0.05），可能是由于金絲桃素保證了心臟的血流通暢，促進(jìn)了心臟的發(fā)育，增強(qiáng)了心臟的功能。研究表明，金絲桃素能通過減少肝細(xì)胞凋亡來(lái)提高細(xì)胞活力，通過減輕氧化應(yīng)激、抑制脂肪生成，從而減少肝細(xì)胞中脂質(zhì)的聚積［18］。該試驗(yàn)中2 g/L 組、4 g/L 組、8 g/L 組的肝臟指數(shù)降低， 可能與金絲桃素促進(jìn)肝臟脂肪的分解代謝有關(guān)。 該試驗(yàn)中金絲桃素對(duì)小鼠脾臟和腎臟指數(shù)無(wú)顯著影響，并且在一定程度上促進(jìn)生長(zhǎng)、提高飼料轉(zhuǎn)化率。

動(dòng)物的腸道存在多種微生物， 主要包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門、梭桿菌門和疣微菌門等， 該試驗(yàn)中4 組樣品的菌群組成在門水平上，以厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門為主。金絲桃提取物可以通過改變厚壁菌、 擬桿菌和變形菌的相對(duì)豐度調(diào)節(jié)小腸和結(jié)腸中微生物菌群的組成。 該試驗(yàn)中金絲桃素使小鼠盲腸內(nèi)容物中普雷沃菌屬、 巨單胞菌屬水平降低， 且差異顯著（P<0.05)。普雷沃菌屬主要聚集于正常人體的口腔、女性生殖道等部位， 是臨床上較常見的一種條件致病菌，可引起這些部位的內(nèi)源性感染；巨單胞菌屬是亞洲人腸道的重要菌屬，在強(qiáng)直性脊柱炎、自閉癥譜系障礙、多動(dòng)障礙、急性腦卒中、抑郁癥狀、癌癥早期患者腸道中的相對(duì)豐度會(huì)有所升高［19］。 該試驗(yàn)中金絲桃素使小鼠盲腸內(nèi)容物中瘤胃球菌屬、副擬桿菌屬、乳桿菌屬水平升高，并且差異顯著（P<0.05)， 這3 種益生菌能夠保持腸道菌群平衡，促進(jìn)腸道健康。瘤胃球菌是降解抗性淀粉的關(guān)鍵菌，并且能有效分解堅(jiān)硬的植物細(xì)胞壁，除此之外在穩(wěn)定腸道屏障、 逆轉(zhuǎn)腹瀉、 降低結(jié)直腸癌風(fēng)險(xiǎn)、 減少腎結(jié)石等方面具有一定的作用。 研究表明， 腸道中副擬桿菌屬的相對(duì)豐度與體重指數(shù)（BMI）呈負(fù)相關(guān)，副擬桿菌具有抗炎特性、還能夠調(diào)節(jié)宿主代謝［20］，另外，副擬桿菌和艾克曼菌互相促進(jìn)生長(zhǎng)介導(dǎo)了生酮飲食（KD）的抗癲癇作用［21］。乳酸桿菌廣泛分布于自然界， 寄生于腸道的乳酸桿菌對(duì)機(jī)體具有保護(hù)作用。 金絲桃提取物能夠通過調(diào)控2 型糖尿?。═2DM）小鼠的腸道菌群發(fā)揮降糖功效［22］，可能是由于提高了小鼠腸道中乳酸桿菌、雙歧桿菌的相對(duì)豐度，對(duì)其改善小鼠T2DM起到了一定作用。研究表明，金絲桃素還能夠通過調(diào)節(jié)腸道微生物群改善潰瘍性結(jié)腸炎［23］。 金絲桃苷能有效調(diào)控非酒精性脂肪肝小鼠的腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高有益菌的菌群相對(duì)豐度，減輕腸道炎癥，保護(hù)腸黏膜屏障。 金絲桃素和金絲桃苷具有抗真菌作用。 金絲桃素能夠通過不同于光氧化的機(jī)制來(lái)抑制某些細(xì)菌的生長(zhǎng)，64 mg/mL 濃度的金絲桃素在沒有光照的情況下抑制金黃色葡萄球菌ATCC 29213 和表皮葡萄球菌ATCC 12228 的生長(zhǎng)［24］。一定劑量金絲桃素、金絲桃苷在體外對(duì)于病原真菌和腐敗酵母具有不同的抑制作用［25］。 金絲桃素與大腸桿菌細(xì)胞結(jié)合的能力很強(qiáng)， 通過羥脯氨酸的光動(dòng)力失活作用可以誘導(dǎo)大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生大量的細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS），快速、有效滅活大腸桿菌［26］。綜上所述，金絲桃素具有一定的抗炎抗菌以及改善腸道菌群結(jié)構(gòu)的作用。

4 結(jié)論

在飲水中添加金絲桃素在一定程度上有助于提高小鼠采食量和增重，顯著提高心臟指數(shù)、增加盲腸內(nèi)有益菌的相對(duì)豐度， 對(duì)小鼠健康表現(xiàn)出有益作用。