脫酚棉籽粕替代魚粉對卵形鯧鲹肌肉品質(zhì)的影響

苗玉濤， 鐘宛清， 盧寶鑫， 付勝利， 宋 飛*， 陳義烘， 汪 蕾*

(1. 華南師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/現(xiàn)代水產(chǎn)養(yǎng)殖科學(xué)與工程研究院/廣東省水產(chǎn)健康安全養(yǎng)殖重點實驗室， 廣州 510631；2. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室(珠海)， 珠海 519000； 3. 南方海洋科學(xué)與工程廣東省實驗室(湛江)， 湛江 524025)

卵形鯧鲹(Trachinotusovatus)又名金鯧、鯧鲹，隸屬于鲹科(Carangidae)。由于其生長速度快、肉質(zhì)鮮美和環(huán)境適應(yīng)力強的特點，在我國南方沿海地區(qū)得到了廣泛的養(yǎng)殖。但在實際生產(chǎn)中，卵形鯧鲹飼料中需要添加大量魚粉，導(dǎo)致其飼料價格昂貴，制約了該養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。而且，由于全球氣候變化、環(huán)境污染和過度捕撈，魚粉的生產(chǎn)已經(jīng)無法滿足行業(yè)發(fā)展的需要[1-2]。因此，降低魚粉在水產(chǎn)飼料中的使用比例對于實現(xiàn)該行業(yè)的可持續(xù)發(fā)展至關(guān)重要。

植物蛋白來源廣泛且便宜，為取代魚粉的理想蛋白源[1]。早在20世紀(jì)70年代中期，F(xiàn)OWLER和BANKS[3]就在魚類飼料中使用小麥胚芽粉取代魚粉。到目前為止，積極尋找其他合適蛋白替代魚粉仍然是魚類營養(yǎng)和飼料研究的熱點[4]，如在羅非魚(Oreochromisniloticus)[5]、大西洋鯛(Sparusaurata)[6]等魚類飼喂中添加多種植物蛋白代替部分魚粉。研究[7]表明，飼料中添加少量植物蛋白對水產(chǎn)動物的生長性能、肌肉品質(zhì)和免疫反應(yīng)不會產(chǎn)生顯著影響。但也有研究證實，飼料中添加植物蛋白會對養(yǎng)殖水產(chǎn)動物產(chǎn)生不良影響，帶來了諸如蛋白質(zhì)消化率低[8]、炎癥[9]以及抗氧化力能力下降[10]等問題。各種植物蛋白對不同水產(chǎn)動物產(chǎn)生的影響并不一致，并且影響程度與添加量有一定關(guān)系，其中主要的影響因素、最佳添加量均有待深入研究。

棉籽粕(CSM)是一種重要的植物蛋白來源，被廣泛用于不同魚種的飼料。大量研究者在大菱鲆幼魚[11]、西大西洋笛鯛(Lutjanuscampechanus)[4]等品種上進(jìn)行了棉籽蛋白替代魚粉的應(yīng)用研究。但棉籽粕中含有的游離棉酚對魚類有毒，限制了其在魚類飼料中的大量添加。已有研究[12]證明，脫酚棉籽粕(LCSM)可被用于羅非魚飼料中魚粉的部分替代，但目前尚未有在卵形鯧鲹幼魚中使用脫酚棉籽粕替代飼料中魚粉的報道。因此，本研究通過解析脫酚棉籽粕替代魚粉對卵形鯧鲹的肌肉品質(zhì)、抗氧化能力及相關(guān)基因表達(dá)的影響，以探究脫酚棉籽粕替代不同比例的魚粉在卵形鯧鲹養(yǎng)殖中的應(yīng)用效果，為脫酚棉籽粕作為動物蛋白的應(yīng)用開發(fā)提供理論支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗飼料

以魚粉、脫酚棉籽粕、玉米蛋白粉、家禽副產(chǎn)品粉、豆粕和花生粕為主要蛋白源，以魚油、大豆油和大豆卵磷脂為脂源，添加脫酚棉籽粕分別替代0%、20%、40%、60%的魚粉，配制了4種等氮(質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為42.5%的粗蛋白)和等脂(質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為14.0%的粗脂肪)飼料，分別記為LCSM0、LCSM20、LCSM40、LCSM60組。飼料的一般成分如表1所示。將顆粒通過造粒機(F-26，中國廣州華南理工大學(xué))，在45 ℃下風(fēng)干，水的質(zhì)量分?jǐn)?shù)不超過10%。其中，LCSM0組為對照組，飼料制備結(jié)束后，置于-20 ℃密封保存。

表1 試驗飼料配方

1.2 試驗動物和飼養(yǎng)管理

試驗魚購自陽西養(yǎng)魚場(中國廣東)，喂食LCSM0組飼料2周以適應(yīng)試驗的飼料和條件。試驗前禁食24 h，選取體質(zhì)量為28.42±0.02 g的幼魚隨機分入網(wǎng)箱(1.5 m×1.5 m×1.5 m)，每組3個重復(fù)。每天人工投喂2次(7:00和17:00)，飽食投喂，連續(xù)6周。試驗期間水溫為28～30 ℃，鹽度為15～17 g/L，pH為7.6～7.8，氨氮的質(zhì)量濃度為0.05～0.1 mg/L，溶解氧的質(zhì)量濃度為6～7 mg/L。

1.3 樣品采集

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，每個試驗組取3尾魚，切小塊背肌(2 cm×2 cm×1 cm)冷藏，以用于肌肉質(zhì)構(gòu)的測定，另取3 g左右的肌肉在液氮速凍后-80 ℃保存待用。

1.4 肌肉質(zhì)構(gòu)測定

利用TA.XT.plus型物性測試儀(英國Stable Micro System公司)在質(zhì)地剖面分析(Texture Profile Analysis，TPA)模式下，采用探頭為圓柱形的P/50探頭測試肌肉質(zhì)構(gòu)特性(硬度、膠著性、彈性、內(nèi)聚性、膠粘性、咀嚼性、回復(fù)性)。質(zhì)構(gòu)儀使用參數(shù)設(shè)置為：圓柱狀不銹鋼探頭，直徑5 mm；測試前、中、后速度分別為1、2、5 mm/s；應(yīng)變模式：下壓距離為樣品厚度的75%，二次壓縮間隔時間為1 s；觸發(fā)模式為自動，觸發(fā)力為5 g。測試溫度為常溫。

1.5 肌肉理化特性測定

pH值測定：參照文獻(xiàn)[13]的方法，采用直接測定法，稱取魚肉1±0.02 g，4 ℃冷凍研磨后用蒸餾水定容至8 mL，4 000 r/min離心10 min，取上清液用精密pH儀測定，3次重復(fù)，取平均值。

肌肉滴水損失率的測定及計算：每個試驗組分別取3尾魚背肌，用吸水紙吸干水分后，稱取2±0.06 g肌肉(將此肌肉重量記為W0),置于離心管中(底部墊有適量吸水紙)，于4 ℃、4 000 r/min離心20 min。取出肌肉，用吸水紙吸干肌肉表面水分，稱取其重量，記為W1。計算公式為：

滴水損失率=(W0-W1)/W0×100%。

(1)

蒸煮損失率的測定及計算：每個試驗組分別取3尾魚背肌，用吸水紙吸干水分后，稱取2±0.02 g肌肉(將此肌肉重量記為M1)，置于離心管中，在80 ℃恒溫水浴鍋蒸煮10 min。取出后用吸水紙擦干表面水分，稱取其重量，記為M2。計算公式為：

蒸煮損失率=(M1-M2)/M1×100%。

(2)

1.6 肌肉膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)測定

肌肉膠原蛋白(Collagen)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，具體測定方法參照試劑盒說明書。

1.7 抗氧化指標(biāo)測定

MDA、SOD、GSH-Px含量采用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定，具體測定方法參照試劑盒說明書。

1.8 RNA提取、cDNA合成及實時熒光定量PCR

按RNA提取方法提取肌肉總RNA，用分光光度計(Nanodrop 2000，美國Thermo公司)測定其質(zhì)量濃度，用φ=1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。用PrimeScript反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA定量反轉(zhuǎn)錄為1 μg cDNA，并將其保存在-20 ℃中。

采用SYBR Green染料(Takara)，在Bio-rad CFX96上進(jìn)行qRT-PCR。以β-actin基因為內(nèi)參，分別檢測肌肉中Decorin、MSTN、MyoG、Col1α1、CatB、CatL基因的表達(dá)，引物信息詳見表2。采用Bio-Rad CFX Maestro檢測閾值周期數(shù)(Ct)，采用2-△△Ct方法對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。

表2 試驗所用引物序列

1.9 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與討論

2.1 脫酚棉籽粕替代魚粉對卵形鯧鲹肌肉質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的影響

質(zhì)構(gòu)是肌肉組織的重要物理特性，是評價魚肉品質(zhì)的重要指標(biāo)。由表3可知：LCSM20組的卵形鯧鲹肌肉的硬度、彈性、內(nèi)聚性、膠粘性、回復(fù)性與LCSM0組的相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義，表明其肌肉緊實感、彈性與LCSM0組的相當(dāng)；LCSM40組和LCSM60組的卵形鯧鲹肌肉的內(nèi)聚性顯著提高(P<0.05)，其余質(zhì)構(gòu)指標(biāo)顯著下降(P<0.05)，說明隨著替換比例升高，肌肉彈性和嚼勁下降。綜上說明，脫酚棉籽粕替換魚粉的比例越高，其肌肉的硬度、膠著性、彈性、膠粘性、咀嚼性、回復(fù)性越小，內(nèi)聚性越大，肌肉品質(zhì)越差。

表3 卵形鯧鲹肌肉的質(zhì)構(gòu)指標(biāo)

2.2 脫酚棉籽粕替代魚粉對卵形鯧鲹肌肉理化特性相關(guān)指標(biāo)的影響

肌肉的pH值與肉品的保水性、嫩度、色澤等有很大關(guān)系，直接影響肌肉的品質(zhì)。當(dāng)肌肉受外力作用時，保持原有水分和添加水分的能力叫做系水力，又叫保水力或親水力，是肌肉評價的一個重要指標(biāo)。系水力的高低直接影響肉的風(fēng)味、顏色、質(zhì)地、嫩度和凝結(jié)性。評定系水力的指標(biāo)很多，有滴水損失率、蒸煮損失率和解凍減量等，本試驗主要測定肌肉的滴水損失率和蒸煮損失率。由表4可知：4個試驗組的pH值均低于7.0，其中，LCSM20組的pH值顯著低于LCSM0組(P<0.05),說明pH值下降可增加魚肉的嫩度和風(fēng)味物質(zhì)；與LCSM0組相比，LCSM20、LCSM40、LCSM60組的滴水損失率的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而蒸煮損失率都顯著下降(P<0.05)，表明魚肉的失水率下降，即提高了系水力。張志勇等[14]研究發(fā)現(xiàn)投喂植物蛋白會降低花鱸和西伯利亞鱘的肌肉失水率，而姜俊等[15]研究發(fā)現(xiàn)投喂植物蛋白會升高建鯉的肌肉失水率，說明植物蛋白可能對不同魚類的系水力影響有差異，其機制有待進(jìn)一步研究。

表4 卵形鯧鲹肌肉理化特性的相關(guān)指標(biāo)

2.3 脫酚棉籽粕替代魚粉對卵形鯧鲹肌肉中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響

膠原蛋白主要分布于形成肌原纖維被膜的結(jié)締組織中，膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)越高，肌原纖維被膜的韌性越強。膠原蛋白可在肌纖維間和肌束周圍形成致密的膜鞘，使肌肉具有較高的硬度和咀嚼性，從而影響肌肉的結(jié)構(gòu)和功能特性。由圖1可知：LCSM0組的卵形鯧鲹肌肉中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為310.42 μg/g；LCSM20、LCSM40組的卵形鯧鲹肌肉中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為290.11、287.19 μg/g，略低于LCSM0組的；LCSM60組的卵形鯧鲹肌肉中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為229.66 μg/g，比LCSM0組的顯著降低了26.02%。綜合來看，當(dāng)用脫酚棉籽粕替代20%或40%的魚粉時，膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)無明顯變化，而替代比例達(dá)到60%時，膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。安玥琦等[16]研究表明，隨著飼喂蠶豆時間的延長，草魚肌肉中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著增加，其肌肉硬度和咀嚼性也顯著增加。于曉彤等[17]等用混合植物蛋白質(zhì)(豆粕和大豆?jié)饪s蛋白)替代魚粉飼喂草魚和花鱸，發(fā)現(xiàn)：當(dāng)替代比例為100%時，膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著低于全魚粉組的，硬度、黏性、咀嚼力及回彈力也顯著降低。以上研究說明，肌肉中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)與肌肉硬度、咀嚼力及彈性呈正相關(guān)，膠原蛋白質(zhì)量分?jǐn)?shù)的降低是導(dǎo)致卵形鯧鲹肌肉硬度和咀嚼性顯著下降的原因之一。

圖1 卵形鯧鲹肌肉中膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)

2.4 脫酚棉籽粕替代魚粉對卵形鯧鲹抗氧化指標(biāo)的影響

機體抗氧化防御系統(tǒng)可保護(hù)細(xì)胞和細(xì)胞膜免受氧化損傷，維持機體的正常生理功能。SOD和GSH-Px作為魚類酶促抗氧化系統(tǒng)的主要成員，可與多種抗氧化酶相互協(xié)調(diào)，兩者含量是指示機體內(nèi)部抗氧化作用動態(tài)穩(wěn)定程度的重要指標(biāo)；MDA含量則是指示機體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度的常用指標(biāo)。由圖2可知：(1)各組之間肌肉的MDA含量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；(2)與LCSM0組相比，SOD含量隨著脫酚棉籽粕替代魚粉的比例的增加顯著下降(P<0.05)，其中，LCSM60組的SOD含量下降了34.94%，LCSM20組和LCSM40組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義；(3)LCSM0組的GSH-Px含量與LCSM20組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，LCSM60組的GSH-Px含量與LCSM0組相比顯著降低(降低了41.79%)。說明用脫酚棉籽粕替代20%～40%的魚粉時，對卵形鯧鲹機體的抗氧化性能影響不大，這與在黑鯛幼魚飼料中用發(fā)酵棉籽粕替代魚粉(替代比例低于16%)的研究結(jié)論[18]相似。在本研究中，當(dāng)脫酚棉籽粕替代60%魚粉時，機體的SOD含量和GSH-Px含量顯著下降，抗氧化系統(tǒng)的防御能力降低，機體清除自由基的能力下降，易受到過氧化物的損傷。申建飛等[19]研究發(fā)現(xiàn)濃縮棉籽粕替代魚粉的比例超過48%時，卵形鯧鲹抗氧化能力顯著低于最適比例(26%)時的，這與本研究結(jié)果相一致。

圖2 脫酚棉籽粕替代魚粉對卵形鯧鲹肌肉抗氧化指標(biāo)的影響

2.5 脫酚棉籽粕替代魚粉對卵形鯧鲹肌肉品質(zhì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

基因效應(yīng)是影響肉質(zhì)的內(nèi)在因素。研究[20]表明，Decorin可通過抑制肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)參與成肌細(xì)胞增殖分化過程的調(diào)控，促進(jìn)肌肉的生長發(fā)育。但關(guān)于Decorin調(diào)控MSTN的表達(dá)在魚類肌肉的研究較少見報道。肌肉生長抑制素(Myostatin，MSTN)又稱為GDF-8(Growthdifferentiationfactor8)，是轉(zhuǎn)化生長因子β(Transforminggrowthfactor-β，TGF-β)家族成員。XU等[20]發(fā)現(xiàn)：畜禽類的肌肉量在敲除MSTN后可顯著增加，表明MSTN在生肌過程和肌肉生長中起重要的抑制作用。XIE等[21]在研究禁食和復(fù)食對長臀鮠(Cranoglanisbouderius)的MSTN基因表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn)：肌肉中MSTN的mRNA表達(dá)水平在饑餓過程中逐漸降低，再喂養(yǎng)后恢復(fù)到正常水平。李卓欽等[21]發(fā)現(xiàn)：肌細(xì)胞生成素(Myogenin，MyoG)主要負(fù)責(zé)肌肉分化，MSTN通過啟動下游MyoG的反應(yīng)，阻礙肌細(xì)胞的生長。

由圖3A-C可知，肌肉中Decorin、MSTN、MyoG基因的相對表達(dá)量受到脫酚棉籽粕替代魚粉的比例的影響：與LCSM0組相比,在脫酚棉籽粕替代20%～40%的魚粉時，Decorin的相對表達(dá)量的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，LCSM60組的顯著下降了19.98%；Decorin下游的MSTN在LCSM20組的相對表達(dá)量與在LCSM0組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，在LCSM40組和LCSM60組則顯著上升(P<0.05)，與Decorin的相對表達(dá)量呈現(xiàn)相反的趨勢；MSTN過表達(dá)會阻礙動物機體骨骼肌的生長，本研究中MSTN的相對表達(dá)量隨著脫酚棉籽粕替代比例的增加而升高，肌肉品質(zhì)相關(guān)指標(biāo)下降，說明MSTN的基因水平調(diào)控著卵形鯧鲹幼魚的生長，機體生長受到抑制；MyoG的相對表達(dá)量在各組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。李卓欽等[22]發(fā)現(xiàn)：MSTN的相對表達(dá)量降低、其下游的MyoG的相對表達(dá)量升高可能會導(dǎo)致斑點叉尾鮰(Ictaluruspunctatus)體質(zhì)量的增加和肌肉中脂肪含量的減少，這與本研究結(jié)果不一致。MSTN可以通過抑制MyoD家族成員的轉(zhuǎn)錄活性負(fù)向調(diào)控肌細(xì)胞的生長發(fā)育，除了MyoG之外，MyoD家族成員還包括成肌細(xì)胞決定蛋白(MyoD)、肌源性因子5(MYF5)、肌源性因子6(MYF6)和肌細(xì)胞特異性增強因子2C(MEF2C)等。ZHANG等[23]通過敲除山羊成纖維細(xì)胞的MSTN，發(fā)現(xiàn)突變山羊的MSTN的mRNA相對表達(dá)量顯著下降，繼而檢測結(jié)果表明MyoD、MYF5、MYF6、MEF2C基因的相對表達(dá)量均顯著上升，說明MSTN水平降低能夠增強4種肌源性轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，從而促進(jìn)生長。由本研究的結(jié)果可以看出，Decorin和MSTN影響卵形鯧鲹幼魚的生長，但影響MSTN和MyoG表達(dá)的確切機制尚不清楚，可能是MSTN可能通過負(fù)調(diào)控MyoD家族成員其他轉(zhuǎn)錄因子來調(diào)節(jié)肌肉的生長，有待進(jìn)一步探究。

許曉瑩等[24]證實鯉魚(Cyprinuscarpio)、斑馬魚(Barchydanioreriovar)、鱘魚(Acipensersinensis)和日本鰻鱺(Anguillajaponica)肌肉中主要為COL1α1編碼的Ⅰ型膠原蛋白。本研究發(fā)現(xiàn)，LCSM20、LCSM40、LCSM60組的COL1α1的相對表達(dá)量與LCSM0組相比顯著升高(P<0.05)，其中LCSM20組和LCSM40組的差異無統(tǒng)計學(xué)意義，LCSM60組的相對表達(dá)量約為LCSM0組的1.92倍(圖3D)。李迪等[25]研究發(fā)現(xiàn)草魚(Ctenopharyngodonidella)×眼鱒(Squaliobarbuscurriculus)雜交F1的COL1α1的相對表達(dá)量顯著高于其母本的，肌肉硬度與彈性也顯著高于其母本的；許曉瑩等[25]研究發(fā)現(xiàn)，使用杜仲飼喂草魚4周后，其肌肉的COL1α1、COL1α2基因的相對表達(dá)量在短期內(nèi)低于LCSM0組的，膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于LCSM0組的。本研究同樣發(fā)現(xiàn)，在用脫酚棉籽粕替代魚粉之后，卵形鯧鲹的COL1α1的相對表達(dá)量升高，而膠原蛋白的質(zhì)量分?jǐn)?shù)降低，具體作用機制有待進(jìn)一步研究。

組織蛋白酶主要存在于溶酶體中，當(dāng)其從溶酶體中釋放出來，能夠破壞肌肉蛋白完整性，加快肌肉的軟化。本研究發(fā)現(xiàn)CatB在LCSM40組的相對表達(dá)量與LCSM0組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3E)，CatL在LCSM20組和LCSM40組的相對表達(dá)量與LCSM0組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)(圖3F)，而CatB和CatL在LCSM60組的相對表達(dá)量均是LCSM0組的2.12倍(圖3E、F)。以上研究結(jié)果表明：隨著脫酚棉籽粕替代魚粉的比例的增加，組織蛋白酶的相對表達(dá)量提高，蛋白質(zhì)加速降解，從而導(dǎo)致肌肉硬度的下降。已有研究[26]表明，飼料中添加適宜水平蘇氨酸均能降低建鯉(Cyprlnuscarpiovar Jian)肌肉中CatB和CatL的相對表達(dá)量，減少肌原纖維的斷裂，從而明顯改善了肌肉的硬度品質(zhì)，說明CatB和CatL的相對表達(dá)量與硬度呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，這與本研究結(jié)果較一致。

圖3 肌肉相關(guān)基因Decorin，MSTN，MyoG，COL1a1，CatB和CatL的表達(dá)變化

3 結(jié)論

本研究探究了飼料中用脫酚棉籽分別替代0%、20%、40%和60%的魚粉對卵形鯧鲹的肌肉品質(zhì)、抗氧化能力和肌肉相關(guān)基因的影響。結(jié)果顯示在卵形鯧鲹幼魚飼料中，利用脫酚棉籽粕替代20%魚粉時，不會降低肌肉品質(zhì)：飼料中以脫酚棉籽粕替代20%～40%魚粉，對卵形鯧鲹的肌肉品質(zhì)無顯著影響；替代比例為20%時，對卵形鯧鲹肌肉的MDA、GSH-Px含量無影響；隨著飼料中脫酚棉籽粕替代魚粉的比例的增加，組織蛋白酶的相對表達(dá)量提高，蛋白質(zhì)加速降解，影響肌細(xì)胞合成，從而導(dǎo)致肌肉硬度的下降，但當(dāng)替代比例為20%時則無影響。綜上所述，在卵形鯧鲹養(yǎng)殖中，建議脫酚棉籽粕替代魚粉的最適比例為20%。