連翹酯苷A通過(guò)TLR4/NF-κB p65/NLRP3軸對(duì)宮內(nèi)感染所致新生大鼠肺損傷及免疫功能的影響研究

王 云，趙亞麗，郎明瑤，尹紅亞

(1.河北省保定市第二醫(yī)院兒科 071000；2.河北省保定市第二中心醫(yī)院兒科 072750；3.河北省兒童醫(yī)院婦產(chǎn)科，石家莊 050031)

宮內(nèi)感染主要是由于病原微生物侵入羊膜腔導(dǎo)致胎盤(pán)、胎膜發(fā)生炎性反應(yīng)引起，炎性因子的“瀑布式”級(jí)聯(lián)反應(yīng)常引發(fā)新生兒肺功能損傷，與胎兒發(fā)生支氣管肺發(fā)育不良密切相關(guān)。連翹酯苷A可抑制感染H9N2禽流感病毒小鼠的炎性反應(yīng)[1]。此外，連翹酯苷A可增強(qiáng)氧自由基清除力和免疫功能，抑制潰瘍性結(jié)腸炎大鼠炎性反應(yīng)[2]。Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)/核因子-κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)p65信號(hào)通路激活可促進(jìn)炎性因子釋放。研究發(fā)現(xiàn)，芪藶強(qiáng)心膠囊可抑制該信號(hào)通路，減輕心力衰竭大鼠心肌組織炎性反應(yīng)[3]。本研究通過(guò)建立宮內(nèi)感染所致新生大鼠肺損傷模型，連翹酯苷A灌胃治療，探討連翹酯苷A對(duì)肺損傷和免疫功能的影響，以及對(duì)TLR4/NF-κB p65/NOD樣受體3(NOD-like receptor 3，NLRP3)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)作用，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

健康清潔級(jí)雌性SD大鼠50只，8周齡，體重180～200 g；雄性SD大鼠25只，8周齡，體重190～210 g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK(京)2018-0001。

1.1.2試劑與儀器

連翹酯苷A(純度>98%)購(gòu)自北京國(guó)家藥品和生物制品控制研究所；脂多糖購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；大腸桿菌購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品檢察所；白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-6、IL-8和IL-1β ELISA試劑盒購(gòu)自美國(guó)R&D公司；兔抗鼠TLR4、NF-κB p65、p-p65、NLRP3及GAPDH抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；CD4+和CD8+單克隆抗體購(gòu)自北京同立海源生物科技有限公司；酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Bioteck公司；小動(dòng)物呼吸功能分析系統(tǒng)(AniRes2005)購(gòu)自北京貝蘭博科技公司。

1.2 方法

1.2.1模型制備[4]

下午4:00后，雌雄大鼠2∶1比例合籠，次日上午用棉簽擦拭雌鼠陰道，對(duì)其分泌物做涂片檢查，顯微鏡下觀察，以精子布滿(mǎn)視野記為妊娠第0天。取40只雌鼠在孕第15天，陰道擴(kuò)張器暴露孕鼠子宮頸，6號(hào)注射器將0.2 mL大腸桿菌稀釋液注射入子宮頸肌肉內(nèi)，兩側(cè)宮頸均進(jìn)行注射。造模第2天起，將40只孕鼠分為模型組、連翹酯苷A組、脂多糖組和脂多糖+連翹酯苷A組，每組10只，連翹酯苷A組和脂多糖+連翹酯苷A組孕鼠灌胃連翹酯苷A 50 mg/kg，每天1次，脂多糖組和脂多糖+連翹酯苷A組孕鼠尾靜脈注射脂多糖 5 mg/kg，每天1次，直至自然分娩，各組新生大鼠選取10只用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2宮內(nèi)感染判斷標(biāo)準(zhǔn)

孕鼠分娩后，留取胎盤(pán)組織，預(yù)冷磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗干凈后，進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色，顯微鏡下觀察，若出現(xiàn)血管水腫、充血，中性粒細(xì)胞增多則說(shuō)明發(fā)生宮內(nèi)感染。

1.2.3新生大鼠呼吸頻率測(cè)定

記錄孕鼠分娩情況，7 d后記錄新生大鼠存活情況。于出生后第8天將新生大鼠麻醉，切開(kāi)氣管后進(jìn)行插管，通過(guò)導(dǎo)管連接呼吸機(jī)和信號(hào)調(diào)理器，使用肺功能檢測(cè)軟件記錄新生大鼠呼吸頻率。

1.2.4ELISA檢測(cè)新生大鼠血清中IL-8、IL-6和IL-1β濃度

呼吸頻率記錄完成后，斷頭處死，收集3 mL主動(dòng)脈血，離心，吸取上清液。嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，酶標(biāo)儀上測(cè)定波長(zhǎng)490 nm處的吸光度(A)值。

1.2.5流式細(xì)胞儀檢測(cè)血清中CD4+、CD8+、CD4+/CD8+淋巴細(xì)胞數(shù)量

呼吸頻率記錄完成后，取3 mL新生大鼠主動(dòng)脈血于流式管中，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，流式細(xì)胞儀分析CD4+、CD8+及CD4+/CD8+比值。

1.2.6HE染色觀察新生大鼠肺組織病理?yè)p傷

采血結(jié)束后，迅速取出右側(cè)肺組織，進(jìn)行HE染色，倒置顯微鏡下觀察并拍照，每張切片選取5個(gè)視野。

1.2.7Western blot檢測(cè)肺組織TLR4、p-p65、NF-κB p65和NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平

左側(cè)肺組織液氮中研磨，裂解，離心，吸取上清液，BCA法測(cè)定蛋白濃度，煮沸。上樣、電泳、濕轉(zhuǎn)、洗膜、封閉，TLR4、p-p65、NF-κB p65、NLRP3、GAPDH一抗4 ℃孵育過(guò)夜，洗膜，二抗孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光液顯色，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值，目的蛋白相對(duì)表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/GAPDH蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 胎盤(pán)組織HE染色

模型組和脂多糖組孕鼠胎盤(pán)組織輪廓不清晰，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；連翹酯苷A組孕鼠胎盤(pán)輪廓尚清晰，少量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)；脂多糖+連翹酯苷A組孕鼠胎盤(pán)組織病理情況較脂多糖組減輕，較連翹酯苷A組加重，見(jiàn)圖1。

2.2 孕鼠分娩情況及新生大鼠存活情況

孕鼠分娩情況：模型組、脂多糖組和脂多糖+連翹酯苷A組孕鼠出現(xiàn)早產(chǎn)，均在孕第18～20天分娩，對(duì)照組和連翹酯苷A組孕鼠在孕第22～23天分娩，孕鼠無(wú)死亡。

新生大鼠存活情況：對(duì)照組新生大鼠87只，死亡2只，死亡率2.30%；模型組新生大鼠共85只，死亡8只，死亡率9.41%；連翹酯苷A組新生大鼠82只，死亡3只，死亡率3.65%；脂多糖組新生大鼠82只，死亡8只，死亡率9.75%；脂多糖+連翹酯苷A組新生大鼠80只，死亡5只，死亡率6.25%。

2.3 新生大鼠呼吸頻率、肺指數(shù)測(cè)定

與模型組比較，連翹酯苷A組呼吸頻率減慢、肺指數(shù)升高，脂多糖組呼吸頻率加快、肺指數(shù)降低(P<0.05)；與脂多糖+連翹酯苷A組比較，連翹酯苷A組呼吸頻率減慢、肺指數(shù)升高，而脂多糖組呼吸頻率加快、肺指數(shù)降低(P<0.05)，見(jiàn)表1。

2.4 ELISA檢測(cè)結(jié)果

與模型組比較，連翹酯苷A組IL-8、IL-6和IL-1β水平降低，脂多糖組升高(P<0.05)；與脂多糖+連翹酯苷A組比較，連翹酯苷A組IL-8、IL-6和IL-1β水平降低，脂多糖組升高(P<0.05)，見(jiàn)表2。

A：對(duì)照組；B：模型組；C：連翹酯苷A組；D：脂多糖組；E：脂多糖+連翹酯苷A組。

表1 新生大鼠呼吸頻率、肺指數(shù)比較

2.5 肺組織HE染色

模型組新生大鼠肺泡體積明顯增大，多數(shù)肺泡隔增厚，且可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；連翹酯苷A組肺泡稍擴(kuò)張，少量肺泡隔增厚，少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；脂多糖組新生大鼠肺組織病理改變較模型組嚴(yán)重；脂多糖+連翹酯苷A新生大鼠肺組織病理變化較連翹酯苷A組加重，較脂多糖組減輕，見(jiàn)圖2。

表2 血清IL-8、IL-6和IL-1β水平比較

A：對(duì)照組；B：模型組；C：連翹酯苷A組；D：脂多糖組；E：脂多糖+連翹酯苷A組。

2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

連翹酯苷A組CD4+/CD8+(1.27±0.10)高于模型組(1.03±0.12)，脂多糖組(0.82±0.17)低于模型組(P<0.05)；脂多糖+連翹酯苷A組CD4+/CD8+(1.15±0.11)低于連翹酯苷A組，高于脂多糖組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.7 Western blot檢測(cè)結(jié)果

與模型組比較，連翹酯苷A組TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，脂多糖組TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05)；與脂多糖+連翹酯苷A組比較，連翹酯苷A組TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平降低，脂多糖組TLR4、p-p65和NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平升高(P<0.05)，見(jiàn)表3、圖3。

表3 肺組織中TLR4、p-p65、NF-κB p65和NLRP3蛋白相對(duì)表達(dá)水平比較

A：對(duì)照組；B：模型組；C：連翹酯苷A組；D：脂多糖組；E：脂多糖+連翹酯苷A組。

3 討 論

宮內(nèi)感染常通過(guò)胎盤(pán)垂直傳播造成胎兒先天性感染，胎齡越小，發(fā)生宮內(nèi)感染的概率越高，是引起早產(chǎn)兒不良結(jié)局的重要原因[5]。支氣管肺發(fā)育不良是早產(chǎn)兒常發(fā)生的一種慢性肺部疾病，其主要的病理學(xué)改變?yōu)榉闻菁胺挝⒀馨l(fā)育不良，而宮內(nèi)感染引起羊水、胎盤(pán)和胎膜中炎性細(xì)胞積聚，并分泌大量炎性因子，被認(rèn)為是支氣管肺發(fā)育不良的主要因素[6]。

ZHENG等[7]研究表明連翹酯苷A可調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞平衡，降低甲型流感病毒FM1株在小鼠肺臟中引起的炎性反應(yīng)。此外，連翹酯苷A可減輕脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷[8]。T淋巴細(xì)胞是免疫反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)，CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞亞群之間比例失衡可導(dǎo)致免疫反應(yīng)紊亂，從而引起炎性反應(yīng)，造成組織損傷。IL-6是炎性反應(yīng)中重要的炎性遞質(zhì)，IL-8是啟動(dòng)炎性反應(yīng)的關(guān)鍵因子[9]。本研究結(jié)果顯示宮內(nèi)感染造成新生大鼠呼吸頻率加快、肺指數(shù)降低，連翹酯苷A可減慢呼吸頻率、升高肺指數(shù)。宮內(nèi)感染后新生大鼠肺泡數(shù)量明顯減少，且肺泡隔內(nèi)可見(jiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，連翹酯苷A治療后少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；孕鼠宮內(nèi)感染造成新生大鼠肺組織中CD4+/CD8+降低，炎性因子IL-6、IL-8和IL-1β水平升高，連翹酯苷A治療后CD4+/CD8+升高、炎性因子水平降低。此結(jié)果提示，連翹酯苷A可降低宮內(nèi)感染新生大鼠炎性反應(yīng)、改善免疫功能和肺損傷。

脂多糖作用于TRL4受體激活炎癥下游信號(hào)通路，NF-κB即為其重要的靶點(diǎn)之一[10]。NF-κB是多種炎性因子基因的靶點(diǎn)，通常以p65/p50組成的異源二聚體形式存在于細(xì)胞質(zhì)中，一般情況下不表現(xiàn)其活性，當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，抑制因子IKB發(fā)生磷酸化降解，NF-κB解離并活化進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)節(jié)下游因子表達(dá)[11]。NLRP3炎性小體是固有免疫信號(hào)通路中重要的多蛋白炎性體，細(xì)胞受到刺激時(shí)被活化，活化后的NLRP3炎性體切割含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase)-1，使其成熟后促進(jìn)炎性因子前體(pro-IL-1β、IL-18)成熟活化，發(fā)揮其生物功能，而炎性因子前體的產(chǎn)生依賴(lài)于NF-κB的激活[12]。研究發(fā)現(xiàn)，在脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠模型中，肺組織p65、TLR4、NLRP3及caspase-1蛋白表達(dá)增加，肺組織損傷嚴(yán)重，而喘可治可減輕小鼠肺損傷，降低p65、TLR4、NLRP3及caspase-1蛋白在肺組織中的表達(dá)水平[13]。在脂多糖誘導(dǎo)的肺損傷小鼠模型中，脂多糖抑制TLR4/NF-κB p65信號(hào)通路激活及NLRP3炎性小體表達(dá)，降低氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)，改善肺功能障礙[14]。急性膿毒癥大鼠肺組織中p65和TLR4蛋白表達(dá)升高，肺水腫明顯，炎性因子水平升高，蘿卜硫素可降低p65和TLR4表達(dá)，降低肺水腫程度[15]。本研究通過(guò)脂多糖激活TRL4受體，探討連翹酯苷A是否通過(guò)該信號(hào)通路改善宮內(nèi)感染新生大鼠肺損傷和免疫功能。結(jié)果顯示，脂多糖上調(diào)宮內(nèi)感染新生大鼠肺組織中TLR4、p-p65和NLRP3蛋白表達(dá)，而連翹酯苷A治療后可抑制脂多糖的激活作用。此結(jié)果提示，連翹酯苷A可抑制TLR4/NF-κB p65/NLRP3信號(hào)通路激活。

綜上所述，連翹酯苷A可改善宮內(nèi)感染新生大鼠肺損傷及免疫功能，其可能是通過(guò)抑制TLR4/NF-κB p65/NLRP3信號(hào)通路激活發(fā)揮作用，為臨床治療肺支氣管發(fā)育不良等疾病提供理論依據(jù)。