云南南澗地區(qū)致仔豬腹瀉性大腸桿菌血清型鑒定與耐藥性分析

尹忠文

（云南省大理洲南澗縣公郎鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)中心，云南大理 675701）

仔豬腹瀉病是危害養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一，臨床中以細(xì)菌性腹瀉最為常見(jiàn)，如大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、巴氏桿菌、奇異變形桿菌等均可以引起仔豬的腹瀉病，大腸桿菌是引起仔豬腹瀉病最多且最為常見(jiàn)的細(xì)菌[1,2]。致病性大腸桿菌可以引起仔豬白痢、仔豬黃痢和仔豬水腫病，其感染和死亡率均較高，尤其是仔豬白痢、仔豬黃痢死亡率高達(dá)80%以上，嚴(yán)重影響著養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展[3]。國(guó)內(nèi)相關(guān)研究表明大腸桿菌抗原結(jié)構(gòu)復(fù)雜，具有多種致病血清型且無(wú)交互保護(hù)性，無(wú)有效疫苗保護(hù)，導(dǎo)致大腸桿菌病在不同的地區(qū)廣泛發(fā)生與流行[4,5]。細(xì)菌生物被膜(Bacterial biofilm,BBF)是組成結(jié)構(gòu)性細(xì)菌群落的主要物質(zhì)，且在自然界中能形成生物被膜(Biofilm,BF)，研究表明，細(xì)菌的生物被膜形成能力與其毒力及耐藥性有一定相關(guān)性[6,7]。仔豬的大腸桿菌病主要用抗生素進(jìn)行治療，而近年來(lái)，由于抗生素的濫用，致使細(xì)菌的耐藥性較嚴(yán)重，且出現(xiàn)多重耐藥菌株，加大了該病的治療難度，同時(shí)耐藥性和藥物殘留也威脅著人類健康[8]。

本試驗(yàn)采集患腹瀉病仔豬的肛拭子、糞便、肝臟等病料243份進(jìn)行大腸桿菌分離鑒定，對(duì)其流行病學(xué)進(jìn)行檢測(cè)，為云南南澗地區(qū)大腸桿菌病的防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株來(lái)源

2018—2020年采集南澗縣豬場(chǎng)的患腹瀉病仔豬的肛拭子、糞便、肝臟等病料243份進(jìn)行大腸桿菌分離鑒定。

1.2 試驗(yàn)材料

麥康凱培養(yǎng)基、96孔細(xì)菌培養(yǎng)板、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯購(gòu)自北京雙旋微生物培養(yǎng)基制備科技公司；藥物紙片購(gòu)自杭州天和微生物制劑有限公司；細(xì)菌生化試紙條購(gòu)自上海研晶生物科技有限公司；大腸桿菌O抗原鑒定因子購(gòu)于中國(guó)食品藥品監(jiān)察所。

1.3 細(xì)菌的分離與培養(yǎng)

將患腹瀉病仔豬的病料組織樣品處理后，無(wú)菌條件下接種于麥康凱培養(yǎng)基上進(jìn)行鑒別培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)菌落接種于大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上37℃培養(yǎng)12～18 h，挑大腸桿菌顯色培養(yǎng)基上的單個(gè)菌落接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯中，純化培養(yǎng)后進(jìn)行鏡檢和生化試驗(yàn)。

1.4 致病性試驗(yàn)

周倩[9]報(bào)道的方法，將分離的大腸桿菌菌株接種于LB培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)，挑取單個(gè)菌落放入LB液體培養(yǎng)基搖床37℃150 r/min振蕩培養(yǎng)至濁度與0.5麥?zhǔn)媳葷峁?1×108cfu)相同。用培養(yǎng)后的大腸桿菌菌液注射小鼠，按照0.2 mL/10 g菌液進(jìn)行腹腔注射，對(duì)照組注射等量的無(wú)菌生理鹽水，試驗(yàn)期7 d，試驗(yàn)期間觀察小鼠的采食情況、精神狀態(tài)、排泄情況、發(fā)病情況等，對(duì)死亡的小鼠進(jìn)行解剖觀察。

1.5 細(xì)菌血清型檢測(cè)

索慧娜[10]報(bào)道，采用玻板凝集試驗(yàn)對(duì)分離的大腸桿菌菌株進(jìn)行血清型檢測(cè)，取制備的大腸桿菌單因子血清3 μL置于干凈載玻片上，在取3 μL大腸桿菌高壓懸液與血清混勻，30～60 s觀察載玻片上液體是否發(fā)生反應(yīng)。若出現(xiàn)明顯凝集則為“陽(yáng)性反應(yīng)”，反之則為“陰性反應(yīng)”。

1.6 細(xì)菌的生物被膜檢測(cè)

對(duì)分離菌株進(jìn)行被膜形成能力測(cè)定，判定標(biāo)準(zhǔn)以陰性對(duì)照孔OD值的2倍作為判斷能否形成BF的臨界點(diǎn)ODc，當(dāng)OD≤ODc時(shí)，表示BF形成能力為零；當(dāng)ODc＜OD≤2×ODc時(shí)，表示BF形成的能力較弱；當(dāng)OD≥2×ODc時(shí)，表示生物被膜的形成能力較強(qiáng)。

1.7 藥敏試驗(yàn)

參照美國(guó)生物被膜臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)藥敏試驗(yàn)法進(jìn)行操作和試驗(yàn)結(jié)果判斷。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

疑似大腸桿菌分離菌株在LB培養(yǎng)基、大腸桿菌顯色培養(yǎng)基長(zhǎng)出的菌落形態(tài)及與鏡檢形態(tài)學(xué)報(bào)道的大腸桿菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)基本一致。經(jīng)統(tǒng)計(jì)采集的243份樣品中分離到了113株符合大腸桿菌的培養(yǎng)特性和形態(tài)學(xué)。

2.2 細(xì)菌的生化試驗(yàn)結(jié)果

對(duì)分離的疑似大腸桿菌的菌株進(jìn)行生化試驗(yàn)，結(jié)果表明，113株分離株鑒定為大腸桿菌，鑒定結(jié)果合格率為99.7%～99.9%。

2.3 致病性檢測(cè)結(jié)果

攻毒組的小鼠在攻毒后的2～4 d出現(xiàn)發(fā)病，且個(gè)別小鼠出現(xiàn)急性死亡，剖檢死亡的小鼠腸道有出血，腸黏膜出現(xiàn)脫落；肝臟、脾臟有不同程度的出血，且可分離得到的致病性大腸桿菌。對(duì)照組的小鼠健康存活。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分離出的113株大腸桿菌中，有87株大腸桿菌對(duì)小白鼠具有致病性。

2.4 血清型檢測(cè)結(jié)果

由表1可知，用玻板凝集試驗(yàn)對(duì)分離的87株致病大腸桿菌進(jìn)行血清學(xué)鑒定。分離出14種不同血清型的大腸桿菌，其中以O(shè)38(17.25%)、O101(18.4%)和O142(14.9%)為云南省大理州南澗縣致仔豬腹瀉病的主要流行血清型。

表1 血清型檢測(cè)結(jié)果

2.5 被膜形成能力結(jié)果

分離的87株仔豬源致瀉性大腸桿菌中，強(qiáng)形成被膜能力菌株有24株(27.6%)、中形成被膜能力菌株有34株(39.1%)、弱形成被膜能力菌株有17株(19.5%)、不形成被膜菌株有12株(13.8%)。

2.6 耐藥性分析

由2可知，分離的87株仔豬致瀉性大腸桿菌對(duì)阿莫西林、氨芐西林、多西環(huán)素、紅霉素、磺胺間甲氧嘧啶、鏈霉素等6種藥物的耐藥率較高，耐藥率在77.0%～98.9%之間；對(duì)慶大霉素、多粘菌素、新霉素、大觀霉素等4種藥物的耐藥率在49.4%～65.5%之間；對(duì)氟苯尼考、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、林可霉素、頭孢噻呋、頭孢噻肟等6種藥物的耐藥率在9.2%～28.7%之間。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

國(guó)內(nèi)外研究表明，致病性大腸桿菌是引起仔豬腹瀉病的主要病原菌之一，其感染率和死亡率較高，對(duì)仔豬的危害較大，嚴(yán)重影響?zhàn)B豬業(yè)的發(fā)展。大腸桿菌為條件性致病菌，廣泛存在于環(huán)境中，尤其是衛(wèi)生條件較差的豬舍，當(dāng)仔豬受到冷熱等應(yīng)激時(shí)，機(jī)體抵抗力下降，極易出現(xiàn)腹瀉病，因此，注意環(huán)境衛(wèi)生及環(huán)境的消毒是有效防控大腸桿菌病的重要措施之一[11,12]。關(guān)于仔豬腹瀉性大腸桿菌的報(bào)道逐漸增多[13-17]，致病性大腸桿菌在我國(guó)各個(gè)地區(qū)廣泛分布與流行，應(yīng)該做好防控措施，減少該疾病的發(fā)生。本試驗(yàn)從云南南澗地區(qū)患腹瀉病的仔豬病料中分離得到了87株致病性大腸桿菌，探明了大腸桿菌在該地區(qū)流行的血清型，說(shuō)明大腸桿菌因感染宿主和區(qū)域的不同，菌株血清型也存在一定差異。發(fā)現(xiàn)云南南澗地區(qū)的大腸桿菌血清型，以O(shè)38(17.25%)、O101(18.4%)和O142(14.9%)為主要流行優(yōu)勢(shì)血清型?？梢园袿38、O101和O142作為研制大腸桿菌多價(jià)疫苗的候選菌株，為進(jìn)一步研究防治該地區(qū)的仔豬腹瀉性大腸桿菌疫苗奠定基礎(chǔ)。此外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)分離的87株致病性大腸桿菌中以強(qiáng)、中形成被膜能力菌株較多。李金朋等[8]報(bào)道了從河南分離的豬源大腸桿菌具有生物被膜形成能力，張召興等[10]報(bào)道了河北地區(qū)蛋雞源大腸桿菌具有生物被膜形成能力，與本文報(bào)道基本一致。

此外，本試驗(yàn)對(duì)大腸桿菌的耐藥性進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)分離的87株致病性大腸桿菌對(duì)藥物耐藥率在49.4%以上的有10種藥物，分別為阿莫西林、氨芐西林、多西環(huán)素、紅霉素、磺胺間甲氧嘧啶、鏈霉素、慶大霉素、多粘菌素、新霉素、大觀霉素。耐藥率在9.2%～28.7%之間的有6中，分別為對(duì)氟苯尼考、環(huán)丙沙星、恩諾沙星、林可霉素、頭孢噻呋、頭孢噻肟等。說(shuō)明云南南澗地區(qū)流行的仔豬源致瀉性大腸桿菌耐藥性嚴(yán)重。

4 結(jié)論

本研究對(duì)2018—2020年采集的云南南澗地區(qū)不同養(yǎng)殖場(chǎng)中患腹瀉病仔豬的肛拭子、糞便、肝臟等病料樣品243份進(jìn)行了大腸桿菌的培養(yǎng)鑒定，分離得到87株致病性大腸桿菌，以O(shè)38、O101和O142為主要流行優(yōu)勢(shì)血清型，以強(qiáng)、中、弱形成膜能力菌株為主，分離菌株對(duì)臨床中10種藥物的耐藥率較高，且耐藥性嚴(yán)重。為該地區(qū)大腸桿菌病的防治提供理論依據(jù)。