大白豬血清免疫指標的檢測及相關(guān)性分析

劉笑笑 路玉潔 田威龍 肖有恩 覃燕靈 吳細波 司景磊 梁 晶 蘭干球*

（1廣西大學動物科學技術(shù)學院，廣西南寧 530004；2廣西農(nóng)墾永新畜牧集團有限公司良圻原種豬場，廣西南寧 530022）

血清免疫指標是衡量動物健康水平的重要指標，TNFα、IL-6、CRP是目前研究較多的血清免疫指標。白細胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)是由活化的T細胞和成纖維細胞產(chǎn)生的一種多效應(yīng)細胞因子，在調(diào)節(jié)免疫和炎癥反應(yīng)在宿主防御中發(fā)揮重要作用[1]；C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)是一種急性反應(yīng)蛋白，是重要的機體炎性反應(yīng)生物標志物，起到免疫調(diào)節(jié)和吞噬炎性反應(yīng)的作用[2]；腫瘤壞死因子α(Tumor necrosis factorα,TNF-α) 在機體發(fā)生炎癥或病毒感染時，會通過自然殺傷細胞(NK細胞)被激活后，作為促炎細胞因子被優(yōu)選出來，發(fā)揮殺傷被病毒感染的宿主細胞和免疫調(diào)節(jié)作用[3]。TNFα、IL-6、CRP在機體免疫和檢測感染方面均具有重要作用[4]。試驗對此3項免疫指標相關(guān)性進行分析及正態(tài)分布檢驗，得出3項免疫指標的相關(guān)性及群體分布情況，為豬育肥期免疫指標的正常范圍值、健康檢測及以大白豬為疾病模型的各時期免疫指標研究提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

試驗豬乃來自廣西南寧某大型核心種豬場，所有仔豬統(tǒng)一飼喂商業(yè)飼料，且未添加任何抗生素，70日齡統(tǒng)一轉(zhuǎn)入育肥舍，待其適應(yīng)后，統(tǒng)一進行血清樣品的采集(80日齡)。

1.2 樣品采集

使用20 mL注射器采取大白豬前腔靜脈血后，注入5 mL一次性真空采血管內(nèi)，常溫靜止1～2 h后4℃3 000 rmp離心15 min，吸取上清液(即血清)至1.5 mL離心管內(nèi)備用。

1.3 試驗方法

1.3.1 腫瘤壞死因子α的測定

采用九邦生物科技公司的豬腫瘤壞死因子α ELISA試劑盒檢驗血清樣本中的腫瘤壞死因子α，具體操作步驟如下：①試劑盒4℃保存，試驗開始前應(yīng)先室溫平衡20 min；②標準孔依次加入各梯度標準液50 μL，空白孔不加樣；③樣本孔加入50 μL待測血清樣品；④樣品孔和標準品孔加入100 μL HPR標記的檢測抗體，封膜后37℃恒溫箱孵育60 min后，棄去液體，每孔加入350 μL洗滌液并靜置1 min后，棄去液體，反復(fù)操作5次；⑥所有孔內(nèi)加入A液、B液各50 μL，37℃恒溫箱孵育15 min；⑦所有孔內(nèi)加入50 μL終止液，使用酶標儀450 nm波長測定各孔OD值；⑧根據(jù)測定的標準品孔的OD值及對應(yīng)標準液濃度，使用Excel軟件計算得出直線回歸方程并繪制標準曲線，OD值代入方程即可計算所有樣品TNFα的濃度。測定單位為pg/mL。

1.3.2 白細胞介素-6的測定

采用九邦生物科技公司的豬白細胞介素-6 ELISA試劑盒檢驗血清中的白細胞介素-6，測定單位為pg/mL，具體操作步驟同腫瘤壞死因子α的測定。

1.3.3 C-反應(yīng)蛋白的測定

采用九邦生物科技公司的豬C-反應(yīng)蛋白ELISA試劑盒檢驗血清樣本中的C-反應(yīng)蛋白，測定單位為mg/L，具體操作步驟同腫瘤壞死因子α的測定。

1.4 統(tǒng)計方法

運用R語言檢驗不同性別的顯著性，其他數(shù)據(jù)均使用SPSS 19.0軟件進行分析，包括：描述性統(tǒng)計、t檢驗、Person相關(guān)性分析、正態(tài)分布檢驗等。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯著性檢驗

使用R語言Wilcoxon秩和檢驗(rank sum test)進行顯著性檢驗分析，結(jié)果如圖1所示，公豬TNFα、IL-6、CRP的值均高于母豬，但各免疫指標差異均不顯著(P＞0.05)。

圖1 公、母豬TNFα、IL-6、CRP指標顯著性檢驗

2.2 各指標正態(tài)分布檢驗

使用Shapiro-wilk對TNFα、IL-6、CRP進行正態(tài)分布檢驗，結(jié)果如圖2所示，IL-6、CRP均符合正分布，TNFα不符合正態(tài)分布。由于不是所有指標都滿足正態(tài)分布，因此，運用wilcoxon秩和檢驗(rank sum test)對上述數(shù)據(jù)進行顯著性檢驗分析(非參數(shù)檢驗)。非參數(shù)檢驗不需要利用總體的信息(總體分布)，以樣本信息對總體分布做出推斷。

圖2 TNFα、IL-6、CRP的指標正態(tài)分布檢驗

2.3 各指標描述性統(tǒng)計

TNFα、IL-6、CRP血清免疫指標的描述性統(tǒng)計如表1所示。3項血清免疫指標的均值分別為29.07 pg/mL、70.84 pg/mL和2.12 mg/L。各項結(jié)果中變異系數(shù)值較大，分別為36%、25%和32%，表明基于平均數(shù)為準的變異程度較大、TNFα、IL-6、CRP指標數(shù)據(jù)的離散程度較高。

表1 3項指標描述性統(tǒng)計

2.4 各指標相關(guān)性分析

TNFα、IL-6、CRP指標的相關(guān)性分析及顯著性檢驗如表2所示，各指標間相關(guān)系數(shù)均達到0.4以上，且均呈極顯著相關(guān)(P＜0.01)，表明IL-6與TNFα、CRP與TNFα、CRP與IL-6等每2個指標間均具有中度相關(guān)性。

表2 TNFα、IL-6、CRP的相關(guān)性分析和顯著性檢驗

3 討論

3.1 各指標描述性統(tǒng)計及正態(tài)分布檢驗

血清免疫指標在一定程度上影響機體的健康水平[5]，豬作為人類的理想疾病模型，研究其各個時期的免疫水平變化具有重要意義[6]。本研究的結(jié)果顯示育肥期(80日齡)大白豬的公、母豬各指標差異均不具有顯著性，表明該時期性別因素對TNFα、IL-6、CRP指標水平的影響不大。正態(tài)分布檢驗結(jié)果顯示除TNFα外，其余2項指標符合正態(tài)分布，且TNFα數(shù)值遠小于盧軍鋒[7]使用“杜長大”豬110 kg屠宰采樣測得的數(shù)值，這表明TNFα在不同時期可能差異較大。描述性統(tǒng)計結(jié)果顯示變異系數(shù)較大即數(shù)據(jù)的離散程度較大，表明80日齡大白豬的免疫指標數(shù)值差異較大，這可能是因為采樣應(yīng)激水平的影響，研究表明應(yīng)激可對豬體內(nèi)炎癥因子水平產(chǎn)生一定影響[8]；此外，可能由于性成熟前豬體內(nèi)的免疫因子處于“上升階段”且上升程度不一致所致[9]。大白豬在育肥期免疫因子出現(xiàn)個體水平差異較大的原因及其具體調(diào)控機制有待進一步探索。

3.2 各指標相關(guān)性分析及顯著性檢驗

TNFα、IL-6、CRP相關(guān)性結(jié)果顯示任意兩指標之間相關(guān)性系數(shù)均在0.4以上，均呈極顯著中度相關(guān)。臘曉琳等[10]研究表明免疫因子之間具有一定的相關(guān)性，會協(xié)同促進疾病的進展。結(jié)合前人研究，表明TNFα、IL-6、CRP等3項免疫因子水平具有一定相關(guān)性，其具體影響機制有待進一步研究。

4 結(jié)論

育肥期(80日齡) 大白豬的TNFα、IL-6、CRP指標間具有極顯著相關(guān)性；性別因素對該時期指標的表型影響不顯著。