基于HPLC指紋圖譜與化學(xué)模式相結(jié)合的益氣活血通便方提取工藝優(yōu)選

李 碩，楊曉玲，權(quán)起元，劉書斌，王本歡，楊秀娟，趙林華，李越峰*，仝小林*

基于HPLC指紋圖譜與化學(xué)模式相結(jié)合的益氣活血通便方提取工藝優(yōu)選

李 碩1, 2，楊曉玲1，權(quán)起元1，劉書斌3，王本歡1，楊秀娟1，趙林華4，李越峰1*，仝小林4*

1. 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000 2. 甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室，甘肅 蘭州 730000 3. 甘肅省中醫(yī)院，甘肅 蘭州 730050 4. 中國中醫(yī)科學(xué)院廣安門醫(yī)院，北京 100053

建立基于HPLC指紋圖譜與化學(xué)模式相結(jié)合的益氣活血通便方（Yiqi Huoxue Tongbian Recipe，YHTR）提取工藝優(yōu)選方法。采用HPLC法建立YHTR指紋圖譜，并同時測定綠原酸、松果菊苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素7種指標(biāo)性成分含量，以干膏率及7種成分含量為指標(biāo)，利用主成分分析（principal component analysis，PCA）和模糊物元模型（fuzzy matter-element model，F(xiàn)MEM）2種化學(xué)模式識別技術(shù)優(yōu)選YHTR最佳提取工藝。不同提取工藝的YHTR HPLC指紋圖譜標(biāo)定20個共有峰，相似度在0.782～0.999；7個指標(biāo)性成分質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為7.3～57.3、727.6～10 584.7、13.4～79.2、31.7～105.0、100.1～1 115.3、7.4～41.9、2.3～19.0 μg/g，干膏率為17.8%～24.3%。FMEM和PCA結(jié)果一致，YHTR的指標(biāo)性成分含量與提取時間、提取次數(shù)以及加水倍數(shù)具有相關(guān)性。從7種指標(biāo)性成分提取率和干膏得率角度考慮，YHTR最佳提取工藝為加10倍量水，提取3次，每次提取時間60 min。通過指紋圖譜結(jié)合化學(xué)模式識別技術(shù)的分析策略可快速有效的篩選YHTR最佳提取工藝，為YHTR后續(xù)制劑開發(fā)提供了參考。

益氣活血通便方；指紋圖譜；主成分分析；模糊物元模型；質(zhì)量評價；綠原酸；松果菊苷；毛蕊異黃酮葡萄糖苷；阿魏酸；毛蕊花糖苷；毛蕊異黃酮；芒柄花素

便秘是臨床上常見的胃腸道功能紊亂性疾病，我國成人慢傳輸型便秘（slow transit constipation，STC）占整個便秘患者的15%～42%[1-5]。仝小林院士基于“態(tài)靶同調(diào)”辯證理念[6-9]，認(rèn)為STC的主要病因病機是氣血津液虧虛、腸燥失運，結(jié)合臨床實踐總結(jié)出由黃芪、當(dāng)歸、肉蓯蓉、火麻仁組成的益氣活血通便方（Yiqi Huoxue Tongbian Recipe，YHTR），針對年老體弱、產(chǎn)后、久病引起的氣血虧虛、腸道濡潤失司的慢性功能性便秘人群，有明顯的補氣養(yǎng)血、潤腸通便作用，臨床治療效果顯著。

目前，YHTR的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、制劑工藝及質(zhì)量評價方面鮮有研究報道，因此確定YHTR的最佳提取工藝、反映組方整體質(zhì)量的指紋圖譜及多指標(biāo)成分含量的質(zhì)量評價方法顯得尤為重要[10-15]。本實驗以YHTR為研究對象，通過HPLC指紋圖譜對其主要化學(xué)成分進(jìn)行宏觀整體表征，并對不同提取工藝的干膏率及7種指標(biāo)性成分綠原酸、松果菊苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素進(jìn)行含量測定，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）和模糊物元模型（fuzzy matter-element model，F(xiàn)MEM）確定YHTR最佳提取工藝，并進(jìn)行基于多指標(biāo)成分的質(zhì)量綜合評價，為YHTR質(zhì)量控制及后續(xù)制劑開發(fā)提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

1260高效液相色譜儀，安捷倫科技有限公司；800型離心沉淀器，上海手術(shù)器械十廠；MH-500型可調(diào)式電熱套，北京科偉永興儀器有限公司；HHS-11S型電子恒溫不銹鋼水浴鍋，上海宜昌儀器紗篩廠；KQ-250TDB型高頻數(shù)控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；DHG-9123A型電子恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海齊欣科學(xué)儀器有限公司。

1.2 藥材

黃芪（批號20220402）、當(dāng)歸（批號20220203）、肉蓯蓉（批號21080601）、火麻仁（批號22032802）飲片由甘肅中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院提供，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李成義教授鑒定來源于豆科黃芪屬植物蒙古黃芪(Fisch.) Bge. var(Bge.) Hsiao的干燥根，傘形科當(dāng)歸屬植物當(dāng)歸(Oliv.) Diels的干燥根，列當(dāng)科肉蓯蓉屬植物肉蓯蓉Y. C. Ma的干燥帶鱗葉的肉質(zhì)莖，桑科大麻屬植物大麻L.的干燥成熟果實。

1.3 試劑

色譜純甲醇（批號20220504）、甲酸（批號20210301）、乙腈（批號20220401）購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；對照品綠原酸（批號MUST- 21030920）、松果菊苷（批號MUST-21101117）、毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號MUST-21033005）、阿魏酸（批號MUST-22011214）、毛蕊花糖苷（批號MUST-210070910）、毛蕊異黃酮（批號MUST- 21042513）、芒柄花素（批號MUST-21122712）購自成都曼斯特生物技術(shù)有限公司，以上對照品質(zhì)量分?jǐn)?shù)均≥98%。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品制備

依據(jù)處方配伍，分別精密稱取黃芪15 g、當(dāng)歸15 g、肉蓯蓉18 g、火麻仁30 g，加適量蒸餾水浸泡后，熱回流裝置密閉提取，將提取液趁熱用紗布濾過，即得煎煮液；將煎煮液濃縮并定容至100 mL即得濃縮液；取濃縮液10 mL于已恒定質(zhì)量的蒸發(fā)皿中水浴蒸干，置于烘箱中烘至干燥，取出后，置于干燥器中干燥30 min，稱定質(zhì)量，即得干浸膏。

根據(jù)傳統(tǒng)中藥湯劑煎煮法及預(yù)實驗結(jié)果，選取對煎煮效果影響較大的關(guān)鍵因素“加水倍數(shù)、提取時間、提取次數(shù)”作為提取工藝影響因子，結(jié)合單因素考察實驗，設(shè)計3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗，對YHTR不同提取工藝進(jìn)行篩選，響應(yīng)面分析因素水平見表1。

表1 YHTR的響應(yīng)面分析試驗因素水平

Table 1 Response surface analysis factor level of YHTR

試驗號加水倍數(shù)/倍提取時間/min提取次數(shù) S18402 S212402 S38602 S412602 S58501 S612501 S78503 S812503 S910401 S1010601 S1110403 S1210603 S1310502 S1410502 S1510502 S1610502 S1710502

2.2 色譜條件

色譜柱為Agilent Zorbax SB-Aq柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脫：0～5 min，10%～13%乙腈；5～13 min，13%～17%乙腈；13～20 min，17%～21%乙腈；20～26 min，21%～25%乙腈；26～30 min，25%～38%乙腈；30～34 min，38%～43%乙腈；34～40 min，43%～90%乙腈；40～50 min，90%～10%乙腈；50～60 min，10%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長280 nm；進(jìn)樣量10 μL；柱溫30 ℃。

2.3 供試品溶液的制備

精密移取“2.1”項下濃縮液1 mL，置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后加入70%甲醇溶解，定容于至10 mL量瓶中，靜置，取上清液過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.4 對照品溶液的制備

分別精密稱定綠原酸、松果菊苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素7種對照品適量，加入70%甲醇溶解并定容至10 mL量瓶中，制成質(zhì)量濃度分別為0.01、0.01、0.05、0.06、0.14、0.20、0.20 mg/mL的混合對照品溶液儲備液，備用。

2.5 指紋圖譜研究

2.5.1 精密度試驗 精密吸取按照“2.1”和“2.3”項下方法制得的同一供試品溶液（S15），按照“2.2”項下色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，記錄HPLC色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價（2012版）》軟件進(jìn)行評價分析，結(jié)果表明，6個供試品溶液的色譜圖相似度為0.996～1.000，20個共有峰相對保留時間的RSD為0.08%～0.77%，相對峰面積的RSD為0.28%～2.98%，表明該方法精密度較好。

2.5.2 重復(fù)性試驗 精密吸取按照“2.1”和“2.3”項下方法制得的6份供試品溶液（S15），按照“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，每次進(jìn)樣10 μL，記錄HPLC色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價（2012版）》軟件進(jìn)行評價分析，結(jié)果表明，6個供試品溶液色譜圖的相似度分別為0.993～1.000，20個共有峰相對保留時間的RSD為0.08%～1.22%，相對峰面積的RSD為0.33%～2.70%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗 精密吸取按照“2.1”和“2.3”項下方法制得的同一供試品溶液（S15），分別在制備后0、2、4、8、12、24 h按照“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，每次進(jìn)樣10 μL，記錄HPLC色譜圖。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價（2012版）》軟件進(jìn)行評價分析，結(jié)果表明，6個供試品色譜圖與其共有模式的相似度分別為0.994～1.000，20個共有峰相對保留時間的RSD為0.22%～3.17%，相對峰面積的RSD為0.51%～2.94%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 HPLC指紋圖譜的建立及相似度分析 取“2.1”項下17份試驗樣品，分別按“2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖。將17份樣品的HPLC圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價（2012版）》軟件，以S1號樣品的色譜圖為參照圖譜，時間窗的寬度為0.5 min、中位數(shù)法生成對照指紋圖譜（R），經(jīng)多點校正后進(jìn)行色譜峰匹配，生成17份樣品的HPLC指紋圖譜疊加圖（圖1）。

指紋圖譜可獲得樣品的整體信息，通過圖譜比較，可反映樣品與樣品之間的親疏程度。以對照指紋圖譜為參照，進(jìn)行相似度評價分析，結(jié)果見表2。17份不同提取工藝YHTR樣品的指紋圖譜相似度為0.782～0.999，表明各提取工藝下樣品的指紋圖譜相對穩(wěn)定。

圖1 17份不同提取工藝YHTR樣品的HPLC指紋圖譜疊加圖及其對照指紋圖譜(R)

表2 17份YHTR樣品指紋圖譜相似度評價結(jié)果

Table 2 Similarity evaluation of fingerprints of 17 batches of YHTR

樣品相似度S1S2S3S4S5S6S7S8S9S10S11S12S13S14S15S16S17R S11.000 0.972 0.888 0.922 0.827 0.977 0.878 0.818 0.934 0.968 0.957 0.817 0.686 0.939 0.937 0.928 0.923 0.934 S20.972 1.000 0.958 0.978 0.800 0.968 0.963 0.893 0.854 0.956 0.958 0.923 0.801 0.988 0.987 0.982 0.980 0.988 S30.888 0.958 1.000 0.965 0.652 0.942 0.980 0.836 0.789 0.936 0.953 0.978 0.792 0.977 0.977 0.976 0.976 0.979 S40.922 0.978 0.965 1.000 0.806 0.930 0.989 0.934 0.778 0.912 0.927 0.958 0.829 0.996 0.996 0.997 0.997 0.996 S50.827 0.800 0.652 0.806 1.000 0.741 0.729 0.889 0.696 0.715 0.702 0.621 0.620 0.782 0.780 0.775 0.773 0.782 S60.977 0.968 0.942 0.930 0.741 1.000 0.904 0.781 0.946 0.998 0.996 0.866 0.669 0.952 0.951 0.943 0.939 0.949 S70.878 0.963 0.980 0.989 0.729 0.904 1.000 0.920 0.719 0.887 0.907 0.988 0.855 0.987 0.987 0.989 0.990 0.990 S80.818 0.893 0.836 0.934 0.889 0.781 0.920 1.000 0.600 0.751 0.763 0.867 0.850 0.907 0.908 0.908 0.910 0.915 S90.934 0.854 0.789 0.778 0.696 0.946 0.719 0.600 1.000 0.954 0.935 0.659 0.444 0.811 0.808 0.794 0.787 0.803 S100.968 0.956 0.936 0.912 0.715 0.998 0.887 0.751 0.954 1.000 0.996 0.851 0.642 0.937 0.936 0.927 0.923 0.934 S110.957 0.958 0.953 0.927 0.702 0.996 0.907 0.763 0.935 0.996 1.000 0.879 0.655 0.950 0.949 0.941 0.938 0.946 S120.817 0.923 0.978 0.958 0.621 0.866 0.988 0.867 0.659 0.851 0.879 1.000 0.849 0.959 0.960 0.963 0.966 0.963 S130.686 0.801 0.792 0.829 0.620 0.669 0.855 0.850 0.444 0.642 0.655 0.849 1.000 0.816 0.817 0.820 0.823 0.831 S140.939 0.988 0.977 0.996 0.782 0.952 0.987 0.907 0.811 0.937 0.950 0.959 0.816 1.000 1.000 0.999 0.999 0.999 S150.937 0.987 0.977 0.996 0.780 0.951 0.987 0.908 0.808 0.936 0.949 0.960 0.817 1.000 1.000 0.999 0.999 0.999 S160.928 0.982 0.976 0.997 0.775 0.943 0.989 0.908 0.794 0.927 0.941 0.963 0.820 0.999 0.999 1.000 1.000 0.997 S170.923 0.980 0.976 0.997 0.773 0.939 0.990 0.910 0.787 0.923 0.938 0.966 0.823 0.999 0.999 1.000 1.000 0.997

2.5.5 共有峰指認(rèn)及歸屬研究 精密移取“2.4”項下混合對照品儲備液1ml，用70%甲醇定容到10ml容量瓶中，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)行檢測，記錄各對照品色譜圖。以色譜峰相對保留時間為參照，對17份樣品進(jìn)行色譜峰的指認(rèn)。確定20個共有特征峰。通過與對照品溶液色譜圖對比，確定其中7號為綠原酸，10號為松果菊苷，13號為毛蕊異黃酮葡萄糖苷，14號為阿魏酸，15號為毛蕊花糖苷，19號為毛蕊異黃酮，20號為芒柄花素。具體見圖2-A、2-B。

7-綠原酸 10-松果菊苷 13-毛蕊異黃酮葡萄糖苷 14-阿魏酸 15-毛蕊花糖苷 19-毛蕊異黃酮 20-芒柄花素

2.6 7個指標(biāo)成分含量測定

2.6.1 線性關(guān)系考察 分別精密吸取“2.4”項下毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、阿魏酸、綠原酸、毛蕊花糖苷對照品儲備液1.2、0.5、1.2、0.8、5.0 mL，置于10 mL棕色量瓶中，加甲醇定容，稀釋1、5、10、12.5、20倍得系列質(zhì)量濃度梯度的混合對照品溶液。另分別取松果菊苷、芒柄花素對照品儲備液，分別稀釋1、10、20、40、80倍和1、5、7、8、10倍，即得各系列質(zhì)量濃度梯度的對照品溶液。精密吸取各對照品溶液與混合對照品溶液10 μL，按“2.2”項下色譜條件分別進(jìn)樣測定，以各成分的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），相應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)（），進(jìn)行線性回歸，得到各成分的回歸方程，結(jié)果分別為綠原酸＝14.117－0.060 3，2＝0.999 9，線性范圍0.4～8.0 μg/mL；松果菊苷＝7.246 8－49.184 0，2＝1.000 0，線性范圍12.5～1 000.0 μg/mL；毛蕊異黃酮葡萄糖苷＝17.056－1.776 5，2＝0.999 7，線性范圍0.6～12.0 μg/mL；阿魏酸＝27.841－2.989 5，2＝0.999 7，線性范圍0.6～12.0 μg/mL；毛蕊花糖苷＝8.729 9－6.754 1，2＝1.000 0，線性范圍5～100 μg/mL；毛蕊異黃酮＝25.909－0.469 7，2＝0.999 9，線性范圍0.25～5.00 μg/mL；芒柄花素＝19.585－0.529 8，2＝0.999 8，線性范圍0.3～3.0 μg/mL。

2.6.2 精密度試驗 精密吸取“2.4”項下對照品溶液，按照“2.2”項下色譜條件連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣6次，每次進(jìn)樣10 μL，測定峰面積，記錄HPLC圖。測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、阿魏酸、綠原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為1.68%、0.67%、1.34%、0.76%、0.98%、0.28%、0.98%，表明儀器精密度良好。

2.6.3 重復(fù)性試驗 精密吸取按照“2.3”項下方法制得的6份供試品溶液（S15），按照“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣，每次進(jìn)樣10 μL，記錄HPLC色譜圖。測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、阿魏酸、綠原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積，并計算其含量與RSD值。結(jié)果顯示，樣品中毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、阿魏酸、綠原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為1.61%、0.51%、1.41%、1.93%、1.67%、0.54%、0.86%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.6.4 穩(wěn)定性試驗 精密吸取按照“2.3”項下方法制得的同一供試品溶液（S15），分別在制備后0、2、4、8、12、24 h按照“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣分析，每次進(jìn)樣10 μL，記錄HPLC色譜圖。測得毛蕊異黃酮葡萄糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素、阿魏酸、綠原酸、松果菊苷、毛蕊花糖苷峰面積的RSD分別為0.94%、0.35%、1.67%、1.68%、1.47%、0.33%、0.87%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6.5 加樣回收率試驗 精密移取已測定7種指標(biāo)成分的樣品（S15）濃縮液0.5 mL，共6份，分別加入與樣品中含量相同的綠原酸、松果菊苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的對照品，按照“2.3”項方法制備供試品溶液，依據(jù)“2.2”項色譜條件測定，記錄峰面積，并計算7種成分的加樣回收率，結(jié)果綠原酸、松果菊苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素的平均加樣回收率分別為97.87%、98.18%、99.77%、100.34%、100.38%、99.39%、98.70%，RSD分別為3.06%、1.05%、3.49%、1.51%、1.33%、2.13%、3.37%。

2.6.6 含量測定 按“2.3”項下方法制備17份供試品溶液（平行3份），按“2.2”項下色譜條件對7種指標(biāo)性成分含量進(jìn)行測定；按“2.1”項下方法制備干浸膏，計算干膏率（干浸膏/復(fù)方原藥材質(zhì)量），結(jié)果見表3。

2.7 基于2種數(shù)學(xué)模型篩選最佳提供工藝

2.7.1 基于PCA的評價 PCA采用統(tǒng)計學(xué)降維分析原理，將多個變量簡化為幾個綜合變量，使新變量成為原變量的線性組合，是一種適用于多指標(biāo)大樣本的綜合分析方法。通過SPSS 21.0軟件對綠原酸、松果菊苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素7種指標(biāo)性成分及干膏率進(jìn)行PCA，結(jié)果見表4。由表4可知，前2個主成分為毛蕊花糖苷和毛蕊異黃酮，其特征值均＞1，說明前2個主成分在影響YHTR水煎液質(zhì)量評價指標(biāo)中起主導(dǎo)作用，2個主成分累積貢獻(xiàn)率達(dá)89.66%，能夠較客觀地反映YHTR水煎液內(nèi)在質(zhì)量，故選取前2個主成分進(jìn)行分析。

表3 17份樣品中7種指標(biāo)性成分含量及干膏率

Table 3 Contents of seven index components and dry paste rate of 17 batches of test solution

樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(μg?g?1)干膏率/% 綠原酸松果菊苷毛蕊異黃酮葡萄糖苷阿魏酸毛蕊花糖苷毛蕊異黃酮芒柄花素 S114.81 145.837.651.5155.328.211.819.40 S214.51 810.344.150.9141.926.812.620.30 S332.76 316.845.653.0540.519.15.722.80 S442.55 602.665.647.4554.536.411.122.30 S511.01 331.927.932.4209.514.75.219.90 S627.72 443.028.145.8303.317.45.820.90 S739.47 042.764.164.0633.831.98.723.10 S829.46 667.579.267.0492.941.919.022.90 S97.3727.613.431.7100.17.42.317.80 S109.01 777.424.441.8169.311.93.720.20 S1132.73 991.560.658.2352.138.413.021.50 S1257.310 584.760.868.91 115.329.812.624.30 S1334.84 789.466.4105.0487.536.511.022.10 S1440.84 695.164.379.7511.636.611.521.90 S1541.84 727.865.778.6514.236.711.221.90 S1637.44 670.851.158.2533.031.513.921.80 S1739.74 769.953.859.8537.131.914.122.00

由表5可見，處方各因子載荷系數(shù)能綜合反映各成分對第1、2主成分的影響。其中，毛蕊花糖苷的因子載荷量在第1主成分中最大，說明其對處方質(zhì)量評價的影響最大。毛蕊異黃酮載荷系數(shù)為0.936，是影響第2主成分的主要因子，毛蕊花糖苷與毛蕊異黃酮成分呈正相關(guān)。

表4 主成分的特征值及貢獻(xiàn)率

Table 4 Eigenvalue of principal components and cumulative contribution rates

主成分初始特征值旋轉(zhuǎn)后特征值合計方差貢獻(xiàn)率/%累積貢獻(xiàn)率/%合計方差貢獻(xiàn)率/%累積貢獻(xiàn)率/% 15.95174.39074.3903.83147.89247.892 21.22215.27189.6613.34241.77089.661 30.4735.91395.574 40.1531.91097.484 50.1371.71099.194 60.0500.63099.824 70.0080.10599.928 80.0060.072100.000

表5 旋轉(zhuǎn)后的因子載荷系數(shù)

Table 5 Principal component load matrix and coefficient

成分因子載荷系數(shù) 第1主成分第2主成分 綠原酸0.8580.419 松果菊苷0.9350.296 毛蕊異黃酮葡萄糖苷0.5130.830 阿魏酸0.3830.705 毛蕊花糖苷0.9580.229 毛蕊異黃酮0.3040.936 芒柄花素0.1790.894 干膏率0.8770.407

根據(jù)各主要因子的權(quán)重系數(shù)進(jìn)行累加，權(quán)重系數(shù)的計算依據(jù)其方差貢獻(xiàn)率的大小，即各主成分的貢獻(xiàn)率與2個主成分的總貢獻(xiàn)率之比，第1主成分的權(quán)重1＝47.892%/89.661%＝0.534，則第2主成分權(quán)重2為0.466。根據(jù)公式＝0.5441＋0.4662，得出各個YHTR水煎液的總因子得分（）并排序，得分越高，表明該樣品質(zhì)量越好。具體排序見表6。

表6 2種數(shù)學(xué)模型評價結(jié)果

Table 6 Evaluation results of two mathematical models

排序PCAFMEM樣品F樣品貼近度值 1S127.379S120.639 2S74.925S80.434 3S84.631S130.425 4S34.396S70.423 5S43.998S150.399 6S133.491S140.395 7S173.476S40.376 8S153.457S170.349 9S143.435S160.336 10S163.408S30.320 11S112.894S110.316 12S61.873S60.191 13S21.404S20.190 14S101.364S10.176 15S51.117S50.131 16S10.999S100.131 17S90.653S90.081

2.7.2 基于變異系數(shù)的FMEM評價 FMEM以模糊數(shù)學(xué)為基礎(chǔ)，將用于描述某一事物集合的3個要素“事物”“特征”“量值”，與中藥“樣品”“成分”“含量”一一對應(yīng)，如給定樣本名稱，使它關(guān)于特征有量值，以有序3元組＝(,,)作為描述事物的基本元，簡稱為物元3要素，如果其中量值具有模糊性，則稱為模糊物元。已有李喜香等[16]、劉書斌等[17]和楊蕊菁等[18]通過建立FMEM對大黃、黨參等中藥進(jìn)行質(zhì)量評價，取得了較為滿意的結(jié)果。

本研究為不同提取工藝的YHTR，為所評價的指標(biāo)性成分種類，為7種指標(biāo)性成分含量及干膏率?；谧儺愊禂?shù)計算有關(guān)評價指標(biāo)的權(quán)重，步驟如下：

（2）計算第項評價指標(biāo)的均值D，即：

（3）計算第項評價指標(biāo)的變異系數(shù)δ，即：

δ＝D×

（4）計算第項評價指標(biāo)的權(quán)重W，即：

W＝δ×δ

本研究結(jié)合歐氏貼近度概念，計算7種指標(biāo)成分及干膏率評價指標(biāo)的變異系數(shù)（δ）分別為0.076、0.164、0.127、0.135、0.159、0.053、0.013和0.007，權(quán)重（W）分別為0.103、0.224、0.172、0.184、0.216、0.072、0.018和0.010，建立基于變異系數(shù)權(quán)重的FMEM，得到貼近度復(fù)合模糊物元，對17批樣品的質(zhì)量進(jìn)行排序和綜合評價，見表6。

從表6看出，2種評價方法的排序結(jié)果基本一致，S12、S8、S7均靠前4名次，S9、S10、S1、S5均靠后4名次，說明采用2種數(shù)學(xué)模型對基于7種指標(biāo)性成分以及干膏率對YHTR 17種不同提取工藝的評價令人滿意。

依據(jù)2種方法評價發(fā)現(xiàn)，YHTR的指標(biāo)性成分含量與提取時間、提取次數(shù)以及加水倍數(shù)具有相關(guān)性。從7種指標(biāo)性成分提取率和干膏得率角度考慮，YHTR最佳提取工藝為加10倍量水，提取3次，每次提取時間60 min。

2.8 最佳提取工藝驗證

采用最佳提取工藝提取樣品，按“2.3”項下方法制備6批供試品溶液（Y1～Y6），按“2.2”項下色譜條件對7種指標(biāo)性成分含量進(jìn)行測定；按“2.1”項下方法制備干浸膏，計算干膏率，對優(yōu)選的最佳提取工藝進(jìn)行驗證，結(jié)果見表7。測得綠原酸、松果菊苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素含量及干膏率的RSD分別為1.53%、1.31%、2.14%、2.08%、1.01%、1.37%、2.25%、0.56%，表明所優(yōu)選的提取工藝方法可靠。

3 討論

本實驗首次建立了YHTR的指紋圖譜，同時結(jié)合化學(xué)模式識別篩選出處方的最佳提取工藝，為質(zhì)量評價提供理論依據(jù)。實驗過程中，為了確保所建立的指紋圖譜能全面優(yōu)化提取工藝，考察了不同紫外吸收波長（254、270、280、290 nm）下色譜峰的數(shù)目和峰面積差異，發(fā)現(xiàn)280 nm下色譜峰信息較豐富，故選擇280 nm作為檢測波長。此外，本實驗通過對色譜柱的考察，發(fā)現(xiàn)色譜柱Agilent Zorbax SB-Aq柱能較好地分離各個被測成分的峰，且色譜峰的峰型較好。結(jié)合上述實驗條件，建立YHTR HPLC指紋圖譜，并同時測定綠原酸、松果菊苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷、阿魏酸、毛蕊花糖苷、毛蕊異黃酮、芒柄花素7種指標(biāo)性成分含量，以干膏率及7種成分含量為指標(biāo)，利用PCA和FMEM 2種化學(xué)模式識別技術(shù)優(yōu)選YHTR最佳提取工藝。本研究確定的HPLC指紋圖譜條件重現(xiàn)性良好、穩(wěn)定性可靠、分辨率清晰，結(jié)合化學(xué)識別模式建立的數(shù)學(xué)模型擬合信息豐富、預(yù)測能力優(yōu)良、判別能力精準(zhǔn)，可適用于YHTR提取工藝優(yōu)選及質(zhì)量評價。

表7 6份工藝驗證樣品中7種指標(biāo)性成分含量及干膏率

Table 7 Contents of seven index components and dry paste rate of six batches of test solution

樣品質(zhì)量分?jǐn)?shù)/(μg?g?1)干膏率/% 綠原酸松果菊苷毛蕊異黃酮葡萄糖苷阿魏酸毛蕊花糖苷毛蕊異黃酮芒柄花素 Y158.110 485.961.967.21 117.029.113.224.56 Y258.610 622.362.068.21 116.029.612.424.22 Y358.210 644.664.568.31 112.828.912.624.25 Y456.310 329.161.366.51 113.229.912.824.23 Y557.310 584.760.868.91 115.329.812.624.30 Y656.910 721.361.265.11 087.629.712.524.20

指紋圖譜能較全面地反映出中藥中所含化學(xué)成分的種類和數(shù)量，進(jìn)而反映藥材整體質(zhì)量和臨床療效[19-23]。實驗數(shù)據(jù)表明，17批不同提取工藝的YHTR水煎液的指紋圖譜，出峰時間大體一致，但相似度計算結(jié)果卻有明顯差異，說明不同提取工藝對YHTR的質(zhì)量有顯著影響。

本實驗引入PCA，將不同提取工藝的YHTR水煎液主成分進(jìn)行排序，又借助基于變異系數(shù)的FMEM對其進(jìn)行排序，2種數(shù)學(xué)模式所得的結(jié)果極相近，說明毛蕊花糖苷和毛蕊異黃酮可作為組方水煎液質(zhì)量評價的標(biāo)志性成分，可為評價YHTR的質(zhì)量提供更為全面的參考。

PCA和FMEM屬于2種不同模式的數(shù)學(xué)模型，但對YHTR的不同提取工藝評價較為一致，說明YHTR的指標(biāo)性成分與提取時間、提取次數(shù)以及加水倍數(shù)具有相關(guān)性。PCA法并未全面考慮這些因素，只是考慮了不同提取工藝各成分的貢獻(xiàn)率和成分之間的相關(guān)性，而FMEM利用變異系數(shù)考慮了評價指標(biāo)權(quán)重的均衡性，極大程度上降低人為賦權(quán)的主觀偏好性因素的影響。因此，本實驗采用2種數(shù)學(xué)模型結(jié)合的方式進(jìn)行實驗數(shù)據(jù)分析，從而降低了人為原因造成的分析誤差，能更全面、準(zhǔn)確地評價YHTR的提取工藝及其整體質(zhì)量。

本實驗采用指紋圖譜和化學(xué)模式識別相結(jié)合的方法優(yōu)化YHTR的提取工藝，并以7種指標(biāo)性成分含量及干膏率對YHTR進(jìn)行質(zhì)量綜合評價，為YHTR的質(zhì)量控制及臨床應(yīng)用安全有效提供了可靠依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Extraction process optimization of Yiqi Huoxue Tongbian Recipe based on the combination of HPLC fingerprint and chemical model

LI Shuo1, 2, YANG Xiao-ling1, QUAN Qi-yuan1, LIU Shu-bin3, WANG Ben-huan1, YANG Xiu-juan1, ZHAOLin-hua4, LI Yue-feng1, TONG Xiao-lin4

1. Gansu University of Chinese Medicine, Lanzhou 730000, China 2. Key Laboratory of Chemistry and Quality for Traditional Chinese Medicines of the College of Gansu Province, Lanzhou 730000, China 3. Gansu Provincial Hospital of TCM, Lanzhou 730050, China 4. Guang’anmen Hospital, China Academy of Chinese Medical Science, Beijing 100053, China

Based on the combination of HPLC fingerprint and chemical model, the method for optimizing the extraction process of Yiqi Huoxue Tongbian Recipe (YHTR) was established.The fingerprint of YHTR was established by HPLC, and the contents of seven index components including chlorogenic acid, echinacoside, calycosin-7-glucoside, ferulic acid, acteoside, calycosin, formononetin were determined at the same time. Taking the dry paste rate and the content of seven components as indicators, two chemical pattern recognition techniques(PCA and FMEM) were used to optimize the optimal extraction process of YHTR.The HPLC fingerprints of YHTR with different extraction processes were used to calibrate 20 common peaks, and the similarity ranged from 0.782 to 0.999; The mass fractions of 7 index components were 7.3—57.3, 727.6—10 584.7, 13.4—79.2, 31.7—105.0, 100.1—1 115.3, 7.4—41.9, 2.3—19.0 mg/g respectively. The dry extract rate of different extraction processes was 17.8%—24.3%. The results of fuzzy matter-element model and principal component analysis are consistent, and the content of index components of YHTR is related to extraction time, extraction times and water addition times. From the perspective of the extraction rate of seven index components and the yield of dry paste, the best extraction process of YHTR is to add 10 times of water, extract three times, and extract for 60 min each time.The analysis strategy of fingerprint combined with chemical pattern recognition technology can quickly and effectively screen the best extraction process of YHTR. The established multi index quality evaluation method provides a reference for the quality control and subsequent preparation development of YHTR.

Yiqi Huoxue Tongbian Recipe; fingerprint; principal component analysis; fuzzy matter-element model;quality evaluation; chlorogenic acid; echinacoside; calycosin-7-glucoside; ferulic acid; acteoside; calycosin; formononetin

R283.6

A

0253 - 2670(2022)18 - 5692 - 09

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.012

2022-08-29

國家自然科學(xué)基金資助項目（81960713）；國家自然科學(xué)基金資助項目（82160750）；國家自然科學(xué)基金資助項目（82160755）；甘肅省高等學(xué)校創(chuàng)新基金項目（2021A-079）；甘肅省中醫(yī)藥科研課題項目（GZKZ-2021-7）；甘肅省自然科學(xué)基金項目（18JR3RA201）；甘肅省基礎(chǔ)研究創(chuàng)新群體項目（21JR7RA569）；甘肅省青年科技基金項目（20JR10RA331）；甘肅省教育廳項目（2121CYZC-21）；甘肅省教育廳項目（2021B-157）；甘肅省高校中（藏）藥化學(xué)與質(zhì)量研究省級重點實驗室項目（zzy-2018-06）；敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化教育部重點實驗室2020年度開放課題（DHYX20-10）

李 碩（1981—），女，副教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向為中藥品質(zhì)評價及產(chǎn)品開發(fā)研究。Tel: 13919824303 E-mail: 290608323@qq.com

仝小林（1956—），男，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師，中國科學(xué)院院士，研究方向為中醫(yī)內(nèi)科學(xué)。Tel: 13910662116 E-mail: tongxiaolin@vip.163.com

李越峰（1974—），女，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向為中藥炮制及制劑開發(fā)。Tel: 13619349364 E-mail: lyfyxk@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]