轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的姜黃素脂質(zhì)體的制備及體外抗腫瘤活性

季 珂，韓 華，韓 冰，梁綠圓，祝俠麗，關(guān)延彬*

轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾的姜黃素脂質(zhì)體的制備及體外抗腫瘤活性

季 珂1，韓 華1，韓 冰1，梁綠圓2，祝俠麗1，關(guān)延彬1*

1. 河南中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，河南 鄭州 450040 2. 河南中醫(yī)藥大學(xué)兒科醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450040

制備轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）修飾的姜黃素（curcumin，Cur）脂質(zhì)體（Tf-Cur-Lip），并研究其理化性質(zhì)和體外抗腫瘤活性。采用薄膜分散法制備Tf-Cur-Lip，對(duì)其形態(tài)、粒徑、多分散性指數(shù)、包封率、載藥量、體外釋放等進(jìn)行表征；以人前列腺癌DU154細(xì)胞為模型進(jìn)行細(xì)胞抑制率實(shí)驗(yàn)與細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)。所制得的Tf-Cur-Lip呈類球形，大小分布均勻，平均粒徑為（68.27±0.36）nm，多分散指數(shù)為0.194±0.050，平均包封率與載藥量分別為（98.13±0.38）%與（2.94±0.38）%。體外釋放研究表明，Tf-Cur-Lip相比游離姜黃素具有一定緩釋效果。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Tf-Cur-Lip對(duì)DU145細(xì)胞的抑制作用顯著高于游離姜黃素，與非靶向姜黃素脂質(zhì)體（Cur-Lip）相比，轉(zhuǎn)鐵蛋白的修飾明顯增加了DU145細(xì)胞對(duì)脂質(zhì)體的攝取效率。成功制備了Tf-Cur-Lip，該脂質(zhì)體能夠提高腫瘤靶向性，具有一定的抗腫瘤活性。

姜黃素；轉(zhuǎn)鐵蛋白；脂質(zhì)體；抗腫瘤活性；薄膜分散法；靶向性

前列腺癌是全世界男性癌癥死亡率最高的原因之一，大多數(shù)前列腺癌患者后期會(huì)發(fā)展為抗去勢(shì)前列腺癌（castration resistant prostate cancer，CRPC），目前，對(duì)CRPC缺乏有效的治療方法[1]。常規(guī)治療方式包括化療、雄激素剝奪、分子靶向、免疫療法等，但其臨床療效及預(yù)后仍不理想，一些患者出現(xiàn)耐藥抵抗及嚴(yán)重不良反應(yīng)[2]。

姜黃素（curcumin，Cur）是從姜黃L.植物根莖中提取的一種生物活性化合物，臨床前研究已經(jīng)證實(shí)姜黃素具有抗抗炎、抗氧化和抗腫瘤活性。體內(nèi)外研究表明，姜黃素具有抑制前列腺腫瘤細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)展并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮腫瘤的作用，能夠通過(guò)多種機(jī)制阻止或延緩前列腺癌的病情進(jìn)展，對(duì)CRPC也有良好的治療效果。目前，部分已完成的臨床試驗(yàn)結(jié)果顯示，姜黃素對(duì)不同惡性腫瘤患者的治療具有安全性和有效性，其中姜黃素抗腫瘤效應(yīng)最有前景的是姜黃素聯(lián)合其他抗腫瘤化療藥物或使用新型藥物遞送方式[3]。但由于其水溶性差、代謝快、吸收低、使攝入的姜黃素不能充分發(fā)揮其作用，限制了姜黃素的臨床使用[4-6]。

納米遞藥系統(tǒng)在癌癥治療方面比傳統(tǒng)的化療具有更多的優(yōu)勢(shì)。脂質(zhì)體具有防止藥物降解，增強(qiáng)藥物穩(wěn)定性，控制藥物釋放，改善藥物藥代動(dòng)力學(xué)等優(yōu)勢(shì)。但傳統(tǒng)脂質(zhì)體缺乏特異性和選擇性。為了解決這個(gè)問(wèn)題，利用多種靶向配體對(duì)脂質(zhì)體進(jìn)行表面修飾，通過(guò)識(shí)別細(xì)胞表面過(guò)表達(dá)的受體來(lái)提高脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的定向傳遞，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用[7-8]。轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（transferrin receptor，TfR）在惡性腫瘤細(xì)胞中表達(dá)顯著增強(qiáng)。轉(zhuǎn)鐵蛋白（transferrin，Tf）與腫瘤細(xì)胞表面的TfR的親和力是正常細(xì)胞表面的10～100倍，故將Tf為靶向功能基團(tuán)與脂質(zhì)體相連，可有效實(shí)現(xiàn)抗腫瘤的靶向治療作用[9]。

本研究目的是設(shè)計(jì)一種尺寸合適、包封效率高、具有緩釋特性和靶向性好的Tf修飾的姜黃素脂質(zhì)體（transferrin modified curcumin liposomes，Tf-Cur- Lip），對(duì)其理化性質(zhì)進(jìn)行表征。并選取前列腺腫瘤細(xì)胞DU145細(xì)胞系，進(jìn)一步考察其體外細(xì)胞毒性和細(xì)胞攝取能力，以期提高姜黃素的生物利用度，提高其在臨床應(yīng)用中的抗腫瘤療效。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Waters E2695型高效液相色譜儀，美國(guó)沃特式公司；OSB-2100型真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；NaNo-ZS90型激光粒度分析儀，英國(guó)Malvern公司；JY92-11N型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波生物科技股份有限公司；Primovert Olympus倒置熒光顯微鏡，日本奧林巴斯株式會(huì)社；Tecnai G2型透射電子顯微鏡（SEM），美國(guó)Fei公司。

1.2 試藥

姜黃素對(duì)照品，批號(hào)B20614，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，上海源葉生物科技有限公司；姜黃素原料藥，批號(hào)M13GS148382，質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞95%，科密歐化學(xué)試劑有限公司；大豆卵磷脂，批號(hào)s30870，上海源葉生物科技有限公司；二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000（DSPE-PEG 2000）、二硬脂?；字Ｒ掖及?聚乙二醇-轉(zhuǎn)鐵蛋白（DSPE-PEG 2000-Tf），批號(hào)RD0200814、RD0200908，西安瑞禧生物科技有限公司；泊洛沙姆F127（Pluronic F127，F(xiàn)127），批號(hào)9003-11-06，西安悅來(lái)醫(yī)藥科技有限公司；辛基-瓊脂糖凝膠CL-4B，批號(hào)20180928，北京索萊寶科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒，批號(hào)20190227，南京建成生物工程研究所；噻唑藍(lán)（MTT），批號(hào)2019325，Amersco公司；1640培養(yǎng)液，批號(hào)20210927，北京索萊寶科技有限公司；DU145細(xì)胞株均購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

2 方法與結(jié)果

2.1 姜黃素脂質(zhì)體（curcumin liposome，Cur-Lip）和Tf-Cur-Lip的制備

基于前期試驗(yàn)[10]，采用薄膜水化法制備Cur- Lip，稱取處方量的脂質(zhì)材料磷脂-膽固醇物質(zhì)的量比6∶3于250 mL圓底燒瓶中，加入4 mL氯仿溶解；姜黃素溶于1 mL的無(wú)水乙醇，加至圓底燒瓶，脂質(zhì)材料與藥物質(zhì)量比（脂藥比）10∶1，45 ℃下減壓旋蒸，使成為均勻的薄膜。水合過(guò)程加入15 mL溶于pH 6.5 PBS（含1% F127），水化2 h。冰浴下探超4 min，4 ℃下冷藏備用。精密稱取一定量DSPE-PEG 2000-Tf溶于氯仿中，在茄形瓶中減壓蒸發(fā)成膜，除去有機(jī)溶劑，置于真空干燥器中過(guò)夜，使其充分干燥，加入適量PBS水化，制備成DSPE- PEG 2000-Tf膠束。分別將Cur-Lip與DSPE-PEG 2000-Tf膠束混合（脂質(zhì)材料與膠束物質(zhì)的量比500∶1），于恒溫振蕩器下，37 ℃下避光反應(yīng)1 h，反應(yīng)后溶液過(guò)PBS平衡的CL-4B瓊脂糖凝膠柱（20 cm×1 cm）除去游離的DSPE-PEG 2000-Tf，得到Tf-Cur-Lip[11-14]，洗脫曲線見(jiàn)圖1。

2.2 姜黃素含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Dikma C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇-0.5%冰醋酸水溶液（75∶25）；體積流量1.0 mL/min；柱溫30 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)424 nm。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取姜黃素對(duì)照品12.5 mg置于25 mL量瓶中，加入無(wú)水乙醇溶解定容，作為母液。精密吸取1 mL母液置10 mL量瓶中，無(wú)水乙醇稀釋至刻度，配制質(zhì)量濃度50 μg/mL姜黃素對(duì)照品儲(chǔ)備液，避光保存。

圖1 Tf-Cur-Lip洗脫曲線

2.2.3 供試品溶液的制備 精密吸取Tf-Cur-Lip溶液0.2 mL，加入甲醇至4 mL，超聲破乳，離心取上清液0.5 mL，加入無(wú)水乙醇稀釋定容至5 mL量瓶中，得Tf-Cur-Lip供試品溶液。

2.2.4 線性關(guān)系考察 將50 μg/mL姜黃素對(duì)照品溶液用PBS（pH 6.5）溶液依次稀釋為0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 μg/mL的系列質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，12 000 r/min離心（離心半徑6.0 cm）10 min，取上清液進(jìn)樣檢測(cè)，以峰面積對(duì)質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸處理，得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程＝180 401－22 984，2＝0.999 7，結(jié)果表明姜黃素在0.2～2.0 μg/mL線性關(guān)系良好。

2.2.5 精密度試驗(yàn) 將0.2、1.2、2.0 μg/mL的對(duì)照品溶液各5份，分別于1 d內(nèi)連續(xù)進(jìn)樣3次，連續(xù)3 d，計(jì)算日內(nèi)和日間精密度。結(jié)果表明低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度的日內(nèi)、日間精密度RSD值均小于5%，表明該儀器精密度良好。

2.2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)方法制備5份Tf-Cur-Lip供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下測(cè)定峰面積，計(jì)算姜黃素質(zhì)量濃度，結(jié)果顯示，姜黃素質(zhì)量濃度的RSD為1.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 按“2.2.3”項(xiàng)方法制備Tf- Cur-Lip供試品溶液，分別于制備后 0、2、4、8、12、24 h取樣，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，結(jié)果顯示姜黃素峰面積的RSD為0.95%，表明供試品溶液24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取已測(cè)定姜黃素含量的Tf-Cur-Lip供試品溶液9份，各1 mL，分別加入低、中、高3種質(zhì)量濃度的姜黃素對(duì)照品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行HPLC分析，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果顯示，低、中、高質(zhì)量濃度姜黃素對(duì)應(yīng)的加樣回收率分別為（99.70±0.67）%、（105.50±2.40）%和（103.20±0.52）%，RSD分別為1.67%、0.77%、0.38%。

2.3 包封率與載藥量的測(cè)定

取適量脂質(zhì)體混懸液過(guò)0.22 μm的微孔濾膜，精密吸取0.2 mL濾液，加入甲醇至4 mL，超聲破乳，離心取上清液0.5 mL，稀釋后HPLC測(cè)得姜黃素質(zhì)量濃度（1），代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得姜黃素質(zhì)量（1）。另取0.2 mL未過(guò)濾膜脂質(zhì)體混懸液，同法破乳處理，測(cè)得質(zhì)量濃度（2），制備脂質(zhì)體的膜材與藥物總質(zhì)量（2）。

包封率＝1/2

載藥量＝1/2

結(jié)果表明，Cur-Lip與Tf-Cur-Lip包封率分別為（93.83±0.41）%、（98.13±0.38）%（＝3），RSD值分別為0.43%、0.65%；載藥量分別為（3.14±0.08）%、（2.94±0.38）%（＝3），RSD值分別為2.40%、1.26%。

二喹啉甲酸法（bicinchoninic acid，BCA）測(cè)量經(jīng)CL-4B柱濾過(guò)的蛋白濃度，及未經(jīng)純化的蛋白質(zhì)量濃度，兩者比值作Tf偶聯(lián)脂質(zhì)體的偶聯(lián)率[15]，結(jié)果為（29.28±1.15）%（＝3），RSD值為3.92%。

2.4 脂質(zhì)體的表征

2.4.1 形態(tài) 取2種脂質(zhì)體混懸液適量稀釋，滴至覆有支持膜的銅篩網(wǎng)上，用2%磷鎢酸染色4 min，自然干燥后，使用SEM觀察形態(tài)。結(jié)果見(jiàn)圖2，可知，Cur-Lip呈均一球形且圓整度較好，Tf-Cur-Lip形態(tài)規(guī)則，呈類球狀，磷脂雙分子層較清晰可見(jiàn)，推測(cè)蛋白分子或穿插于類脂膜中。

2.4.2 粒徑與分布 取2種脂質(zhì)體混懸液適量稀釋，采用馬爾文激光粒度測(cè)定儀檢測(cè)其粒徑分布。結(jié)果見(jiàn)圖3，可知，Cur-Lip與Tf-Cur-Lip平均粒徑分別為（83.13±1.59）、（68.27±0.36）nm，多分散指數(shù)（polydispersity index，PDI）值分別為0.205±0.030、0.194±0.050，表明脂質(zhì)體粒徑大小均一，分布均勻。

圖2 姜黃素脂質(zhì)體的TEM圖

圖3 姜黃素脂質(zhì)體粒徑分布

2.5 脂質(zhì)體的體外釋放實(shí)驗(yàn)

采用反相透析法研究Cur-Lip及Tf-Cur-Lip的體外釋藥行為。精密吸取5 mL姜黃素原料藥混懸液（姜黃素組）、Cur-Lip混懸液及Tf-Cur-Lip混懸液（姜黃素含量約1 mg），分別置于45 mL含1%聚山梨酯80的PBS釋放介質(zhì)中，精密吸取3 mL釋放介質(zhì)于預(yù)先處理好的透析袋中（截留相對(duì)分子質(zhì)量500），兩端夾緊，于37 ℃，100 μg/mL恒溫水浴搖床震蕩，分別在0.5、1、2、4、8、12、18、24、36、72 h時(shí)間點(diǎn)下精密吸取透析袋內(nèi)0.2 mL樣品并補(bǔ)充等體積空白釋放介質(zhì)，無(wú)水乙醇適當(dāng)稀釋后HPLC測(cè)定，使用DDSolver軟件繪制計(jì)算體外累積釋放率，并對(duì)其進(jìn)行體外釋藥動(dòng)力模型擬合。由圖4可知，姜黃素組、Cur-Lip組和Tf-Cur-Lip組在72 h累積釋放率分別為70.89%、63.27%、62.54%。與原料藥相比較，2種脂質(zhì)體制劑顯示了出一定的緩釋特征。分別采用零級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、一級(jí)動(dòng)力學(xué)方程、Higuchi方程對(duì)姜黃素組、Cur-Lip組和Tf-Cur- Lip組于0～72 h的體外累積釋放率進(jìn)行擬合，以相關(guān)系數(shù)（）值望大以及均方誤差（MSE）望小為最佳擬合，由表1結(jié)果可知，姜黃素組的釋放曲線較符合零級(jí)動(dòng)力學(xué)釋藥模型，制劑組體外釋放行為更符合Higuichi動(dòng)力學(xué)模型。

圖4 姜黃素與不同制劑的體外釋放曲線

表1 姜黃素與不同制劑體外釋放度模型擬合

Table 1 Curcumin and its preparations invitro released in various models

樣品數(shù)學(xué)模型擬合方程k0k1kHrMSE 姜黃素0級(jí)F＝k0t0.60 0.8637.73 1級(jí)F＝100 (1－ek1t) 0.03 0.23351.03 HiguichiF＝kHt1/2 10.210.59184.73 Cur-Lip0級(jí)F＝k0t1.14 0.44254.73 1級(jí)F＝100 (1－ek1t) 0.02 0.70135.71 HiguichiF＝kHt1/2 8.510.9332.51 Tf-Cur-Lip0級(jí)F＝k0t1.07 0.56181.10 1級(jí)F＝100 (1－ek1t) 0.02 0.75103.78 HiguichiF＝kHt1/2 7.910.9617.78

2.6 脂質(zhì)體穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.6.1 長(zhǎng)期穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 將2種脂質(zhì)體放置在低溫、避光的條件下，于0、3、7、10、15 d測(cè)定其泄漏率及粒徑，評(píng)價(jià)其穩(wěn)定性。結(jié)果見(jiàn)圖5-A。結(jié)果表明4 ℃下避光存放15 d脂質(zhì)體中藥物泄漏率超過(guò)10%，因此，后續(xù)考慮通過(guò)引入穩(wěn)定劑或添加凍干保護(hù)劑進(jìn)行冷凍干燥等方式提高制劑穩(wěn)定性、使其更宜長(zhǎng)期儲(chǔ)存。

泄漏率＝儲(chǔ)存后泄露到介質(zhì)中的藥物質(zhì)量/儲(chǔ)存前包封的藥物質(zhì)量

2.6.2 血漿穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 采用10%胎牛血清模擬血漿環(huán)境，分別將加入2種脂質(zhì)體的10%胎牛血清置于37 ℃的恒溫?fù)u床中放置48 h，定時(shí)取樣測(cè)定粒徑。結(jié)果見(jiàn)圖5-B，可知，Cur-Lip與Tf-Cur-Lip在血漿中放置48 h，粒徑有所增大，但仍在100 nm左右，表明其血漿穩(wěn)定性良好。

A-4 ℃下儲(chǔ)存15 d的泄漏率 B-10%胎牛血清中粒徑變化

2.7 姜黃素脂質(zhì)體體外抗腫瘤研究

2.7.1 樣品溶液的配制 精密稱取9.2 mg姜黃素，溶于1 mL二甲基亞砜中，用1640培養(yǎng)基稀釋配制濃度為10、20、30、40、50 μmol/L；將適量Cur-Lip混懸液和Tf-Cur-Lip混懸液用1640培養(yǎng)基稀釋配制濃度10、20、30、40、50 μmol/L。將空白脂質(zhì)體混懸液按照上述樣品方法進(jìn)行同步稀釋。

2.7.2 MTT細(xì)胞實(shí)驗(yàn)方法 將復(fù)蘇的DU145細(xì)胞接種到1640培養(yǎng)基中（含10%胎牛血清、100 μg/mL 鏈霉素100 U/mL青霉素），在37 ℃、5% CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)。隔天傳代。取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，以5000個(gè)/孔的細(xì)胞密度接種于96孔板。待細(xì)胞貼壁后，再加入200 μL不同濃度梯度的樣品（空白脂質(zhì)體、姜黃素、Cur-Lip、Tf-Cur-Lip）至96孔板中（設(shè)4個(gè)復(fù)孔，其中空白組沒(méi)種細(xì)胞，只加培養(yǎng)液，對(duì)照組種細(xì)胞，只加培養(yǎng)液），姜黃素終濃度分別為10、20、30、40、50 μmol/L，分別培養(yǎng)24、48、72 h。在終止培養(yǎng)4 h前，取出96孔板，每孔加入20 μL MTT溶液（5 mg/mL），于平板震蕩儀上以100 r/min輕輕震蕩3 min，使MTT溶液充分混勻。終止培養(yǎng)后，使用平板離心機(jī)2500 r/min離心（離心半徑9 cm）10 min使甲瓚結(jié)晶與培養(yǎng)液分離，使用移液槍沿壁小心吸棄培養(yǎng)液。每孔加入150 μL二甲基亞砜溶液，震蕩2 min，使用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)每個(gè)孔的吸光度（）值，計(jì)算細(xì)胞存活率，SPSS 17.0計(jì)算半數(shù)致死濃度（IC50）。

細(xì)胞存活率＝(藥物－空白)/(陰性對(duì)照－空白)

結(jié)果如圖6所示，前列腺腫瘤細(xì)胞正常培養(yǎng)72 h，空白載體在與加藥組相同濃度范圍內(nèi)，細(xì)胞存活率均大于90%，表明空白脂質(zhì)體對(duì)2種細(xì)胞均無(wú)明顯毒性作用。圖7表明，姜黃素組、Cur-Lip組及Tf-Cur-Lip組對(duì)DU145細(xì)胞增殖均具有抑制作用，且隨著給藥時(shí)間和給藥濃度的延長(zhǎng)，特別是濃度超過(guò)30 μmol/L后，各制劑對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞的抗增殖能力均優(yōu)于姜黃素，且Tf-Cur-Lip效果又優(yōu)于Cur-Lip。在72 h時(shí)，Tf-Cur-Lip的IC50值最小，為15.58 μmol/L，對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞增殖抑制效果是游離姜黃素的（2.07±0.28）倍，而Cur-Lip抑制效果是游離姜黃素的（1.55±0.12）倍。

圖6 空白脂質(zhì)體對(duì)細(xì)胞活性的影響(, n = 3)

2.7.3 細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn) 取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的DU145細(xì)胞制備成單細(xì)胞懸液，接種到12孔培養(yǎng)板中，細(xì)胞密度控制為1×105/孔，置于37 ℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁，棄去培養(yǎng)基，PBS清洗后，分別加入含姜黃素、Cur-Lip、Tf-Cur-Lip的培養(yǎng)基，各組姜黃素終濃度分別為10、20、30、40 μmol/L，避光孵育1 h。棄去培養(yǎng)基，用PBS清洗，加入200 μL 1%細(xì)胞裂解液Triton X-100，4 ℃下避光充分裂解細(xì)胞后，細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管并反復(fù)凍融3次。12 000 r/min離心（離心半徑6.0 cm）10 min，精密量取上清液100 μL，甲醇300 μL，充分渦旋混勻后，HPLC進(jìn)樣測(cè)定姜黃素含量。采用激光共聚焦顯微鏡觀察姜黃素及其脂質(zhì)體制劑使用Hoechst 33342染色液標(biāo)記的DU145細(xì)胞，觀察相同孵育時(shí)間下，姜黃素及其脂質(zhì)體制劑在DU154細(xì)胞的分布情況。

圖7 姜黃素與不同制劑組對(duì)DU145細(xì)胞活性的影響 (, n = 3)

如圖8所示，Tf-Cur-Lip組與Cur-Lip組細(xì)胞攝取量在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)均高于姜黃素組，且靶向的Tf-Cur-Lip組細(xì)胞攝取量要高于Cur-Lip組，Cur-Lip組在給藥濃度10、20、30、40 μmol/L下，體外細(xì)胞攝取量分別是姜黃素組的1.4、2.8、2.5、4.1倍。而Tf-Cur-Lip組分別是姜黃素組的1.7、3.1、2.7、5.1倍。激光共聚焦顯微鏡的觀察結(jié)果與此一致（圖9），姜黃素不僅分布于細(xì)胞膜及胞漿中，而且可以進(jìn)入細(xì)胞核中，其中姜黃素組、Cur-Lip組、Tf-Cur- Lip組的共定位皮爾森相關(guān)系數(shù)分別為0.50、0.52、0.61，Manders相關(guān)系數(shù)分別為0.77、0.80、0.86，說(shuō)明Tf的修飾增強(qiáng)了DU145細(xì)胞對(duì)姜黃素脂質(zhì)體的攝取，并且可以釋放更多藥物進(jìn)入細(xì)胞核中。

與姜黃素組比較：*P＜0.05 **P＜0.01

3 討論

姜黃素在水中溶解度極小、體液不穩(wěn)定、體內(nèi)代謝快，導(dǎo)致其口服生物利用度低，嚴(yán)重影響了其臨床應(yīng)用。此外，姜黃素在生理?xiàng)l件下具有極其敏感的水解降解作用[14]。目前多種納米遞藥系統(tǒng)，包括脂質(zhì)體，膠束等已被用于增加姜黃素的水溶性和穩(wěn)定性[13-14,16]。

研究表明，Pluronic F127修飾的脂質(zhì)體可以改善脂質(zhì)體的粒徑及穩(wěn)定性[17-18]，因此，在制備脂質(zhì)體過(guò)程中，水化介質(zhì)中加入了一定比例的Pluronic F127用以調(diào)節(jié)，制備得到的Cur-Lip平均粒徑在83.13 nm，而前期實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有加入Pluronic F127制備的Cur-Lip平均粒徑在151.1 nm左右[10]，表明加入一定比例的Pluronic F127確實(shí)可有效降低脂質(zhì)體的粒徑，究其原因可能是Pluronic F127可選擇性插入或吸附在脂質(zhì)體雙分子層中，使脂質(zhì)體排列的更致密。而且研究發(fā)現(xiàn)Pluronic F127包裹的納米粒能有效克服胃腸道黏液屏障提高藥物的跨膜吸收[18]。因其能在納米粒表面形成疏松的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)層，有效屏蔽納米粒表面的電荷，且具有較強(qiáng)的親水性，可以減少納米粒與黏液層之間的靜電作用和疏水作用。后續(xù)實(shí)驗(yàn)會(huì)進(jìn)一步考察Tf-Cur-Lip的小腸吸收機(jī)制，為探討姜黃素口服納米靶向制劑的研究提供理論依據(jù)

。

圖9 姜黃素與不同制劑處理DU145細(xì)胞激光共聚集顯微鏡圖像

釋放度實(shí)驗(yàn)表明，Cur-Lip及Tf-Cur-Lip具有相似的釋藥行為，說(shuō)明Tf的結(jié)合對(duì)姜黃素脂質(zhì)體釋放行為無(wú)明顯影響，表明姜黃素可以從2種脂質(zhì)體中緩慢釋放，在到達(dá)腫瘤組織之前有利于減少血液循環(huán)中的藥物滲漏，有效提高藥物的穩(wěn)定性。有研究認(rèn)為，Pluronic F127插入脂質(zhì)體膜，增加膜的穩(wěn)定性，也可能會(huì)阻止藥物從脂質(zhì)體中釋放起到長(zhǎng)效作用[13]。

脂質(zhì)體的包載明顯提高了前列腺腫瘤細(xì)胞對(duì)姜黃素的攝取，而且Tf-Cur-Lip相較于普通Cur-Lip能夠更多的被DU145細(xì)胞攝取。研究證實(shí)轉(zhuǎn)鐵蛋白修飾脂質(zhì)體可通過(guò)受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用進(jìn)入腫瘤細(xì)胞[20-21]，說(shuō)明Tf-Cur-Lip的靶向性可能與TfR修飾的內(nèi)吞作用有關(guān)，使更多的姜黃素進(jìn)入腫瘤組織，實(shí)現(xiàn)了Tf修飾的納米靶向脂質(zhì)體對(duì)前列腺腫瘤細(xì)胞的高效親和力及轉(zhuǎn)運(yùn)能力。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)如果在細(xì)胞攝取實(shí)驗(yàn)中，提前加入150 μg/mL的游離Tf孵育細(xì)胞30 min，再加入Tf-Cur-Lip處理細(xì)胞，與沒(méi)有加入Tf孵育的Tf-Cur-Lip實(shí)驗(yàn)組相比較，細(xì)胞攝取量會(huì)降低，分別為（2.45±0.27）、（3.25±0.52）μg/mL。通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制實(shí)驗(yàn)說(shuō)明Tf-Cur-Lip被細(xì)胞所攝取與細(xì)胞表面的轉(zhuǎn)鐵蛋白受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用有關(guān)，但具體內(nèi)吞機(jī)制還有待進(jìn)一步說(shuō)明。細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果與此一致, 說(shuō)明載藥脂質(zhì)體對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖抑制作用可能與腫瘤細(xì)胞對(duì)Tf-Cur-Lip的攝取增加有關(guān)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Preparation and anti-tumor activityof transferrin modified curcumin liposomes

JI Ke1, HAN Hua1, HAN Bing1, LIANG Lyu-yuan2, ZHU Xia-li1, GUAN Yan-bin1

1. School of Pharmacy, Henan University of TCM, Zhengzhou 450040, China 2. School of Pediatrics, Henan University of TCM, Zhengzhou 450040, China

To prepare transferrin (Tf) modified curcumin (Cur) liposomes (Tf-Cur-Lip) and evaluate its physicochemical properties and antitumor activity.The Tf-Cur-Lip was prepared by thin film dispersion method, followed by characterization of the morphology, particle size, polydispersity index (PDI), encapsulation efficiency, drug loading amount andrelease.The anti-proliferative effect and cellular uptake of Tf-Cur-Lip were studied in DU145 cells.The prepared Tf-Cur-Lip showed spherical morphology, and the average particle size was (68.27 ± 0.36) nm and uniform distribution with narrow PDI was (0.194 ± 0.050). The encapsulation efficiency and drug loading amount were (98.13 ± 0.38)% and (2.94±0.38)%, respectively. Therelease studies showed that Tf-Cur-Lip has a sustained-release property compared with free Cur. MTT assay showed that the inhibitory effect of Tf-Cur-Lip on DU145 cells was significantly higher than that of free Cur. Tf-Cur-Lip showed significantly increased cellular uptake than curcumin-loaded liposomes (Cur-Lip) in DU145 cells.Tf-Cur-Lip were successfully prepared , which can improve tumor targeting capability with enhanced anti-tumor activity.

curcumin; transferrin; liposome; anti-tumor activity; thin film dispersion method; targeting

R283.6

A

0253 - 2670(2022)18 - 5649 - 08

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.18.007

2022-04-01

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81803740）；河南省科技攻關(guān)項(xiàng)目（182102310096）；河南省高等學(xué)校重點(diǎn)科研項(xiàng)目（18B360002）；河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項(xiàng)課題（20-21ZY2150）；河南省高校國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（202110471009）

季 珂，碩士研究生，主要從事藥物新劑型研究。Tel: 18738607939 E-mail: 1789271688@qq.com

關(guān)延彬，教授，主要從事中藥新劑型與新技術(shù)研究。Tel: (0371)65962746 E-mail: guanyanbin96@126.com

[責(zé)任編輯 鄭禮勝]