基于日本假單胞菌超聲破碎液對新疆烏東低階煤的降解

吳 昊，劉向榮，2，石 晨，楊 杰，趙順省,2，楊再文,2

(1.西安科技大學 化學與化工學院，陜西 西安 710054；2.自然資源部煤炭資源勘察與綜合利用重點實驗室，陜西 西安 710021)

低階煤水分高、灰分大，直接燃燒熱值低，且污染環(huán)境，而傳統(tǒng)的加工方法，如氣化、液化和熱解等方式存在工藝條件苛刻，能耗高等缺點。低階煤的微生物降解在常溫、常壓下進行，不產(chǎn)生大氣污染物，是低階煤綠色轉化的有效途徑之一。

煤的微生物降解起源于20世紀80年代，COHEN和GABRIELE是該領域研究的先驅者，他們發(fā)現(xiàn)了真菌和可將固體褐煤降解為黑色液滴，之后引起了國內(nèi)外學者的廣泛關注。煤的微生物降解初期，主要是利用微生物細胞培養(yǎng)液直接與煤接觸，使煤降解。隨著降解研究的深入，研究者們逐漸認識到細胞分泌液即胞外液是煤微生物降解的主要物質(zhì)，從而進行了利用微生物胞外液降解煤的研究。COHEN等將通過0.45 μm孔徑過濾器獲得胞外液，并對風化褐煤進行了降解，發(fā)現(xiàn)降解率較細胞培養(yǎng)液明顯提高；LABORDA等對真菌M2進行了離心并使用0.45 μm和0.20 μm的膜對其進行過濾獲得胞外液，降解了煤階較高的硬煤和次煙煤；YANG等對細菌P6進行了離心并通過Whatman No.1濾紙過濾，獲得胞外液，并對胞外液中酯酶進行了提取和純化，發(fā)現(xiàn)純化酯酶對煤樣降解效果遠高于細胞培養(yǎng)液。由此可見，利用微生物胞外液及純化酶代替細胞活體進行煤的生物降解，可提高煤的降解率，然而，它們的獲取需經(jīng)離心、微膜過濾和鹽析等方法，耗時長、處理量低且操作復雜，不利于工業(yè)化應用。為了提高煤的微生物降解效果，簡化降解工藝，促進工業(yè)應用，筆者團隊萌生了利用超聲波破碎微生物細胞，直接用超聲破碎液代替?zhèn)鹘y(tǒng)細胞培養(yǎng)液及胞外液降解煤的想法，探討簡化處理工藝后的降解效果。筆者選擇文獻報道中對低階煤降解能力較好的日本假單胞菌作為實驗菌種，利用日本假單胞菌的超聲破碎液對煤樣進行降解，同時以未經(jīng)處理的細胞培養(yǎng)液作對比，研究超聲破碎液對煤樣的降解效果及工藝條件，確定菌種的最佳破碎區(qū)間，分析超聲破碎液的組成。分析日本假單胞菌超聲破碎液降解煤樣的固、液相產(chǎn)物，探討煤樣降解前后的變化與液相產(chǎn)物的組成。

1 實 驗

1.1 煤樣的制備

實驗所用煤樣為新疆烏東煤礦低階煤，利用球磨機將其破碎并進行篩分，獲得粒徑為0.25～0.50 mm的樣品，用8 mol/L的硝酸對原煤氧化48 h，并用去離子水洗滌至中性，烘干、滅菌備用。日本假單胞菌超聲破碎液降解新疆烏東低階煤的研究思路如圖1所示。原煤及氧化煤的元素分析與工業(yè)分析見表1。

圖1 日本假單胞菌超聲破碎液降解烏東低階煤研究思路

表1 煤樣元素分析與工業(yè)分析

由表1可看出，原煤經(jīng)硝酸氧化后，C，H，S質(zhì)量分數(shù)降低，O，N質(zhì)量分數(shù)增加，灰分降低，揮發(fā)分升高，這是由于硝酸與煤樣反應，使芳香環(huán)羧基化、側鏈烷基氧化及硝化，且煤中的無機物被硝酸溶解，使煤樣灰分降低。

1.2 微生物的培養(yǎng)及生長曲線的測定

1.2.1 微生物的培養(yǎng)

日本假單胞菌()購買于中國微生物菌種保藏中心(CICC)，編號為CICC 23895，屬革蘭氏陰性菌，有極性叢生鞭毛，不形成孢子，棒狀，大小(2.0～3.5)μm×(1.3～1.7)μm，可以產(chǎn)蛋白酶、酯酶、脂肪酶、酸性磷酸酶等。

培養(yǎng)基采用CICC所提供的牛肉膏培養(yǎng)基配方：牛肉膏3 g，蛋白胨5 g，氯化鈉 5 g，瓊脂20 g，去離子水1 L。將菌種接種于50 mL液體培養(yǎng)基，置于150 mL錐形瓶內(nèi)進行培養(yǎng)，條件為恒溫30 ℃，160 r/min振動培養(yǎng)。

1.2.2 生長曲線的測定

采用北京普析通用儀器有限責任公司TU1950型紫外可見分光光度計(UV-Vis)測定日本假單胞菌細胞培養(yǎng)液在600 nm處的光密度(OD)。以菌種的培養(yǎng)時間為橫坐標，光密度為縱坐標作圖，即得菌種的生長曲線。

1.3 日本假單胞菌超聲破碎液、胞內(nèi)及胞外液的獲取及分析方法

1.3.1 超聲破碎液的獲取及分析

(1)超聲破碎液的獲取。利用寧波新芝生物科技股份有限公司JY92-ⅡN型超聲波細胞粉碎儀(電壓220 V，頻率20～25 KHz，功率0～600 W，變幅桿6 mm，破碎容量0.5～500.0 mL)對日本假單胞菌在培養(yǎng)基中進行超聲波細胞破碎，超聲波細胞破碎工作參數(shù)為功率400 W，輻射時間5 s，間隔時間5 s，總時間30 min，菌種破碎體積50 mL，這是根據(jù)單因素和正交試驗確定的。工作結束后，獲得超聲破碎液，包含胞外液和胞內(nèi)液。

(2)超聲破碎液的分析。稱取200 mg溴化鉀進行壓片，使用移液槍量取25 μL日本假單胞菌超聲破碎液，均勻滴至溴化鉀片表面，采用美國Thermo Fisher Scientific公司Nicolet iN10 & iZ10傅里葉紅外光譜儀(FTIR)在4 000～400 cm內(nèi)，分辨率4 cm，進行紅外光譜掃描。

通過三氯甲烷溶劑萃取法對日本假單胞菌超聲破碎液進行萃取，分液后收集下層三氯甲烷萃取液，利用美國Agilent公司8890-5977B型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)進行分析。

1.3.2 胞內(nèi)、胞外液的獲取及分析

(1)胞內(nèi)、胞外液的獲取。胞外液的獲?。簩θ毡炯賳伟M行離心(離心條件為4 ℃，10 000 r/min，20 min)，收集上清液并通過0.22 μm PES膜注射器過濾，獲得胞外液。胞內(nèi)液的獲?。簩θ毡炯賳伟M行離心(離心條件同上)收集菌體沉淀，利用pH=7.2的磷酸鹽緩沖液對菌體沉淀洗滌3～5次后進行超聲波細胞破碎(超聲波細胞破碎工作參數(shù)同上)，工作結束后離心(離心條件同上)取上清液并通過0.22 μm PES膜注射器過濾，獲得胞內(nèi)液。

(2)胞內(nèi)、胞外液的分析。胞內(nèi)、胞外液的FTIR和GC-MS的制樣與測試方法同超聲破碎液。

1.4 日本假單胞菌超聲破碎液對煤樣的降解實驗

在150 mL錐形瓶內(nèi)，加入50 mL的日本假單胞菌超聲破碎液及0.3 g滅菌煤樣于恒溫30 ℃、160 r/min的振動培養(yǎng)箱內(nèi)進行降解實驗，降解結束后，對所得產(chǎn)物進行離心(離心條件為8 000 r/min，20 min)獲取固相產(chǎn)物和液相產(chǎn)物，固相產(chǎn)物用去離子水洗滌、干燥(80 ℃)，稱其質(zhì)量，并計算降解率。

利用日本假單胞菌超聲破碎液對煤樣進行降解實驗，并以菌種細胞培養(yǎng)液(即菌液)作為對照，考察煤樣降解效果與降解時間的關系及2者降解產(chǎn)物的差異。

1.5 日本假單胞菌對煤樣降解效果的評價

利用2種方法對煤樣降解效果進行評價，吸光光度法與計算法。

(1)吸光光度法。煤樣經(jīng)生物降解后，類腐殖酸物質(zhì)溶解至培養(yǎng)基中，在450 nm波長下有最大吸光度值，與煤樣的降解率成正比。因此，利用紫外可見分光光度計(UV-Vis型號同1.2.2)測定液相產(chǎn)物(稀釋30倍)在450 nm波長下的吸光度()，用于評價煤樣的降解效果。

(2)計算法。對煤樣降解前后的質(zhì)量進行稱量，利用式(1)計算其降解率：

(1)

式中，為生物降解效率，%；為煤初始質(zhì)量，g；為煤生物降解后質(zhì)量，g。

1.6 降解固液相產(chǎn)物的分析

(1)固相產(chǎn)物分析。利用傅里葉紅外光譜儀(型號同1.3.1節(jié))，采用定量溴化鉀壓片法(固相產(chǎn)物∶KBr(質(zhì)量比)=1∶200，對固相產(chǎn)物進行紅外光譜掃描，掃描條件同1.3.1節(jié)。使用日本Rigaku公司 Mini Flex 600 X-射線衍射儀對固相產(chǎn)物進行分析，掃描范圍為5°～80°，掃描速度為2(°)/min。采用美國Micromeritics公司ASAP 2020物理吸附儀(氮氣)對固相產(chǎn)物的孔徑分布及比表面積進行測定。

(2)液相產(chǎn)物分析。選用甲苯和乙酸乙酯對液相產(chǎn)物進行萃取，萃取物進行旋蒸去除水分，并分別使用相應有機溶劑稀釋，然后采用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS型號同1.3.1節(jié))進行分析。

2 結果與分析

2.1 日本假單胞菌的生長曲線

日本假單胞菌的生長曲線如圖2所示，可分為4個階段：遲緩期(0～3 h)、對數(shù)期(3～60 h)、穩(wěn)定期(60～84 h)和衰亡期(84～160 h)。菌種處于遲緩期時，為適應培養(yǎng)基環(huán)境，生長極為緩慢，曲線較為平緩；處于對數(shù)期時，細胞數(shù)量快速上升并逐漸趨于穩(wěn)定，此時菌種活性最高；處于穩(wěn)定期時，由于培養(yǎng)基中養(yǎng)分的消耗及細胞內(nèi)毒性物質(zhì)的積累等因素，導致細菌生長繁殖速度下降，衰亡速度開始增加，使該階段菌種細胞總數(shù)與代謝產(chǎn)物含量均處于平衡狀態(tài)；菌種處于衰亡期時，其繁殖速度繼續(xù)下降，細胞死亡數(shù)量大量增加，生長代謝趨近于停滯狀態(tài)。

圖2 日本假單胞菌生長曲線

2.2 日本假單胞菌最優(yōu)破碎期

日本假單胞菌不同生長時期的超聲破碎液對煤樣的降解效果如圖3所示，相同培養(yǎng)時間的菌種細胞培養(yǎng)液對煤樣的降解效果也呈現(xiàn)在圖3，可以看出隨菌種培養(yǎng)時間的增加，超聲破碎液和細胞培養(yǎng)液對煤樣的降解效果都是先提高后達到穩(wěn)定，前者的降解效果普遍比后者高，在菌種培養(yǎng)60 h后，超聲破碎液和細胞培養(yǎng)液對煤樣的降解效果同時達到穩(wěn)定。由圖2可知，菌種生長狀態(tài)從穩(wěn)定期起，對煤樣降解效果便達到穩(wěn)定。

圖3 日本假單胞菌不同生長時期的超聲破碎液對煤樣的降解效果

因此，本文選用培養(yǎng)60 h(穩(wěn)定期)的日本假單胞菌，進行超聲波細胞破碎獲取超聲破碎液，以相同培養(yǎng)時間菌種細胞培養(yǎng)液作為對照，研究超聲破碎液對煤樣降解過程的影響。

2.3 日本假單胞菌超聲破碎液、胞內(nèi)及胞外液組成

2.3.1 日本假單胞菌超聲破碎液FTIR分析

日本假單胞菌胞內(nèi)胞外液的FTIR分析如圖4所示，可看出超聲破碎液、細胞培養(yǎng)液、胞外液和胞內(nèi)液的紅外光譜相似，表明其所含物質(zhì)官能團相似。圖4中2 925 cm處的吸收峰是由—CH—引起的，1 635 cm處的吸收峰是由酰胺帶造成的，1 456 cm處的吸收峰是由—CH引起的。

圖4 日本假單胞菌超聲破碎液、細胞培養(yǎng)液、胞內(nèi)和胞外液的紅外光譜

日本假單胞菌超聲破碎液在2 925，1 635及1 456 cm處均存在吸收峰，表明存在—CH—，—CONH及—CH基團。

2.3.2 日本假單胞菌超聲破碎液GC-MS分析

日本假單胞菌超聲破碎液、細胞培養(yǎng)液、胞內(nèi)和胞外液總離子流色譜如圖5所示。

圖5 日本假單胞菌超聲破碎液、細胞培養(yǎng)液、胞內(nèi)和胞外液總離子流色譜

由圖5可看出超聲破碎液、細胞培養(yǎng)液、胞外液和胞內(nèi)液組成相似，其中，超聲破碎液中物質(zhì)較為豐富，可能含有環(huán)氧乙烷、鄰乙基羥胺和丙烷等物質(zhì)，其官能團—CH—，—CONH，—CH均與圖4紅外光譜相對應。

日本假單胞菌胞外液和胞內(nèi)液組成相似，菌種細胞經(jīng)超聲波細胞破碎后，胞內(nèi)液釋放至培養(yǎng)基中，因此增加了培養(yǎng)基中物質(zhì)的種類和含量。

2.4 日本假單胞菌超聲破碎液對煤樣的降解率

日本假單胞菌超聲破碎液對煤樣的降解率如圖6所示，可看出超聲破碎液和細胞培養(yǎng)液對煤樣的降解率隨時間變化均表現(xiàn)為先增加，隨后達到平穩(wěn)。超聲破碎液和細胞培養(yǎng)液降解煤樣的過程均分為3個階段：快速降解期(2～10 d)，緩慢降解期(10～14 d)和降解平穩(wěn)期(14～18 d)。14 d時，超聲破碎液和細胞培養(yǎng)液對煤樣降解率均達到穩(wěn)定，18 d時降解率分別為48.97%和35.84%。且超聲破碎液對煤樣的降解率較高，原因是菌種經(jīng)超聲破碎后，胞內(nèi)液釋放至培養(yǎng)基中，與胞外液共同對煤樣進行降解，其中，胺類物質(zhì)顯堿性，根據(jù)堿性機理，胺類物質(zhì)可能是煤樣降解的主要因素。

圖6 日本假單胞菌超聲破碎液對煤樣的降解率

日本假單胞菌超聲破碎液在0～5 h內(nèi)對煤樣的降解率如圖6插圖所示，可看出煤樣降解速率最快的時間段為2.5～3.0，3.0 h時煤樣的降解率為12.20%。

煤樣降解后液相產(chǎn)物實物如圖7所示，可看出液相產(chǎn)物的顏色隨時間變化黑色逐漸加深，說明了煤樣降解后生成了腐殖酸類等物質(zhì)。

圖7 日本假單胞菌超聲破碎液5 h內(nèi)降解煤樣的液相產(chǎn)物

2.5 降解固、液相產(chǎn)物分析

2.5.1 固相產(chǎn)物的FTIR分析

圖8 氧化煤和固相產(chǎn)物的紅外光譜分析

2.5.2 固相產(chǎn)物的XRD分析

利用X-射線衍射對氧化煤和固相產(chǎn)物進行分析，結果如圖9所示，可發(fā)現(xiàn)2在24°和43°時，氧化煤、固相產(chǎn)物[1]和固相產(chǎn)物[2]均存在002峰和100峰，分別代表了芳香層片堆砌的高度和芳香環(huán)縮合的程度。

由于煤中礦物質(zhì)的干擾，導致圖譜中出現(xiàn)尖銳峰型，圖9中002峰是不對稱的，歸因于002 和γ兩種微晶峰疊加而成，因此對其進行分峰擬合，使用布拉格方程和謝樂公式計算得到晶格參數(shù)見表2，可以看出，煤樣降解后固相產(chǎn)物[1]和固相產(chǎn)物[2]的芳香層片間距增大，堆砌高度變小，碳層數(shù)減少，原因可能是煤樣分子結構中的含氧官能團、芳香環(huán)等結構被降解。從表2可看出，相比對照組固相產(chǎn)物[2]，日本假單胞菌超聲破碎液降解煤樣所得固相產(chǎn)物[1]的芳香層片間距更大，堆砌高度更小，碳層數(shù)更少，說明了超聲破碎液對煤樣微晶結構的影響更大。

圖9 氧化煤和固相產(chǎn)物的XRD分峰擬合

表2 氧化煤及固相產(chǎn)物的微晶結構參數(shù)

2.5.3 固相產(chǎn)物的低溫N吸附分析

采用低溫N吸附對氧化煤和固相產(chǎn)物進行分析，累積吸附表面積見表3，煤樣經(jīng)微生物降解后固相產(chǎn)物[1]和固相產(chǎn)物[2]的BET 比表面積和Langmuir比表面積均增大，可能是由于煤樣中的組分被降解，從而增加了比表面積。

表3 煤樣累積吸附表面積

圖10為煤樣孔容孔徑分布，可看出氧化煤的比表面積主要是由直徑65～1 250 nm孔引起的。經(jīng)降解后，固相產(chǎn)物[1]和固相產(chǎn)物[2]均產(chǎn)生了新的直徑為19～23 nm的微孔，比表面積均增大，從圖10中可看出，固相產(chǎn)物[1]在相同直徑孔徑下的比表面積大于固相產(chǎn)物[2]，其中，固相產(chǎn)物[1]中19～23 nm微孔對應的比表面積增加的最為明顯。

圖10 氧化煤和固相產(chǎn)物比表面積-孔徑分布

然而，日本假單胞菌的大小為(2.0～3.5)μm×(1.3～1.7)μm，大于煤中大部分的孔徑，限制微生物進入煤樣中，這與YIN等結果一致，表明了日本假單胞菌細胞無法進入孔隙內(nèi)部對煤樣進行降解，這也是菌種細胞培養(yǎng)液對煤樣降解效率較低的原因之一。

2.5.4 液相產(chǎn)物的GC-MS分析

日本假單胞菌超聲破碎液和細胞培養(yǎng)液降解煤樣所得液相產(chǎn)物分別表示為液相產(chǎn)物[1]和液相產(chǎn)物[2]。采用GC-MS對液相產(chǎn)物[1]和液相產(chǎn)物[2]的萃取液進行分析，萃取劑分別為甲苯、乙酸乙酯，總離子流色譜如圖11，12所示，可以看出液相產(chǎn)物[1]的物質(zhì)種類較為豐富。根據(jù)儀器本身數(shù)據(jù)庫匹配結果，2種液相產(chǎn)物萃取物均包含烷烴、酯、醇、酮和苯酚類等物質(zhì)，組成相似，其中液相產(chǎn)物[1]的分子量為154～546，液相產(chǎn)物[2]的分子量為99～546。

對比圖5與圖11，12，可發(fā)現(xiàn)日本假單胞菌細胞所產(chǎn)生的胺類物質(zhì)經(jīng)降解反應后消失，且液相產(chǎn)物[1]和液相產(chǎn)物[2]中均出現(xiàn)了類似六氫吡咯并[1,2-a]吡嗪-1,4-二酮的物質(zhì)，說明了胺類物質(zhì)可能參與了煤的降解反應。根據(jù)GC-MS分析結果，超聲破碎液中存在醇類物質(zhì)，液相產(chǎn)物GC-MS中存在大量酯類物質(zhì)，且煤經(jīng)硝酸氧化后，芳香環(huán)或側鏈羧基化，由此推測，可能是菌種細胞中產(chǎn)生醇類物質(zhì)的羥基和煤樣分子結構中的羧基進行了酯化反應，生成了酯類物質(zhì)。

圖11 液相產(chǎn)物[1]的萃取液總離子流色譜

GC-MS檢測到液相產(chǎn)物[1]和液相產(chǎn)物[2]中均可能含有2,4-二叔丁基苯酚、苯乙醇和鄰苯二甲酸二丁酯等物質(zhì)，它們的官能團分別對應了圖8固相產(chǎn)物紅外光譜中—OH、脂肪族C—H和—CO—等官能團在3 400，2 920和1 700 cm處吸收峰的降低，說明了煤中的羥基和羧基可能被降解。根據(jù)表1元素分析，固相產(chǎn)物中氮元素含量降低，且GC-MS分析表明，液相產(chǎn)物中可能含有2-哌啶酮等含氮元素的物質(zhì)，說明了煤中含氮類官能團可能被降解。

圖12 液相產(chǎn)物[2]的萃取液總離子流色譜

3 結 論

(1)日本假單胞菌在穩(wěn)定期及穩(wěn)定期以后進行超聲破碎，對煤樣有較好的降解效果。培養(yǎng)60 h達到穩(wěn)定期的菌種超聲破碎液，對新疆烏東低階煤的降解率為48.97%，較對照組提高了13.13%，14 d時降解率達到穩(wěn)定。其中，降解速率最快的時間為2.5～3.0 h，3 h時，煤樣的降解率便達到12.20%。

(2)日本假單胞菌胞內(nèi)、胞外液組成相似，主要為胺類、醇類和酮類等物質(zhì)。細胞培養(yǎng)液降解煤樣時，主要是胞外液對煤樣進行降解，而超聲破碎液降解煤樣時，是胞內(nèi)、胞外液共同對煤樣進行降解，從而增加了煤樣的降解率。

(3)日本假單胞菌超聲破碎液降解煤樣所得固相產(chǎn)物的分子結構中羥基、羧基及酯基等官能團含量降低；微晶結構中芳香層片的間距增加，堆砌高度降低，碳層數(shù)減少；并且固相產(chǎn)物中19～23 nm微孔所對應的比表面積增加。

(4)日本假單胞菌超聲破碎液和細胞培養(yǎng)液降解煤樣所得的液相產(chǎn)物組成相似，均包含烷烴、醇、酮和酯類等物質(zhì)，液相產(chǎn)物的分子量分別為154～546和99～546。