促生熒光假單胞菌對(duì)桃樹根區(qū)土壤環(huán)境和植株生長(zhǎng)的影響

楊曉帆，梁家慧，于文英，吳雪蓮，李艷艷，肖元松，彭福田

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院 / 作物生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 山東泰安 271018）

我國(guó)桃樹種類繁多，栽培歷史悠久，距今已有3000多年，栽培地區(qū)廣泛，在2019年我國(guó)桃種植面積和產(chǎn)量均居世界首位[1]，桃產(chǎn)業(yè)在我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)建設(shè)方面發(fā)揮重要作用。由于果園立地條件較差、化肥施用不當(dāng)，使桃樹生產(chǎn)中存在果實(shí)品質(zhì)下降、優(yōu)質(zhì)果比例低等問題[2-3]。本課題組前期研究表明，桃樹生產(chǎn)中普遍存在過量施肥現(xiàn)象，大量施入化肥不僅不能合理有效地改善土壤環(huán)境，還會(huì)造成資源浪費(fèi)，引起環(huán)境污染[4]。因此，如何采取一定措施改善根區(qū)土壤條件，提高根區(qū)土壤養(yǎng)分有效性，減少化肥投入量成為研究的重點(diǎn)。

利用有益微生物來改善土壤微生物環(huán)境，調(diào)控植物生長(zhǎng)發(fā)育，已成為當(dāng)今農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的重要科學(xué)策略之一[5]。生活在植物根際并且有利于植物生長(zhǎng)的細(xì)菌稱之為植物根際促生菌(plant growth promoting rhizobacteria，PGPR)，熒光假單胞菌屬于假單胞菌屬，是一種重要的植物根際促生菌[6]。許多研究證明，熒光假單胞菌等根際促生菌對(duì)于藍(lán)莓[7]、甘藍(lán)型油菜、紫金草、大豆[8]、甘蔗[9]、小麥[10]、番茄[11]、櫻桃[12]等作物，都具有一定促進(jìn)生長(zhǎng)的作用，不僅可以改善根際土壤，提高作物品質(zhì)，降低植物病蟲害發(fā)生幾率，提高植物抗性，還可以減少化肥的施用，改善生態(tài)環(huán)境，具有很大的應(yīng)用潛力。但是目前關(guān)于熒光假單胞菌促進(jìn)桃樹生長(zhǎng)的研究，多圍繞其間接促生的效應(yīng)與機(jī)制，比如通過降低桃蚜的繁殖力[13-14]、抑制桃根腐病的發(fā)生[15]來提高桃樹的抗逆能力，然而，對(duì)于熒光假單胞菌對(duì)桃樹的直接促生效應(yīng)及作用機(jī)制，卻鮮有研究報(bào)道。

為此，我們研究了熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)的促生特性及其對(duì)桃樹根區(qū)土壤環(huán)境和桃樹生長(zhǎng)的影響，明確熒光假單胞菌在桃樹根系-土壤微生態(tài)系統(tǒng)中的作用機(jī)制，以期為熒光假單胞菌的桃樹根際應(yīng)用、構(gòu)建綠色環(huán)保的桃園生態(tài)系統(tǒng)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 細(xì)菌促生能力的鑒定

試驗(yàn)所用熒光假單胞菌菌株購自北納生物公司，編號(hào)為BNCC231887，按照說明書活化培養(yǎng)。細(xì)菌促生能力的鑒定方法及鑒定培養(yǎng)基的配制參考周波等[16]和易浪波等[17]的研究方法，具體方法如下：菌株產(chǎn)吲哚-3-乙酸(IAA)能力的測(cè)定，將熒光假單胞菌按照1%的接種量接種到NB培養(yǎng)基(添加0.5 g/L的L-色氨酸)中，置于28℃、180 r/min搖床培養(yǎng)7天，菌懸液離心取上清液與Salkowski試劑以1∶2的比例混勻，室溫暗處顯色30 min后觀察是否顯紅色，并于530 nm處比色，計(jì)算其IAA產(chǎn)量。

菌株產(chǎn)鐵載體能力的檢測(cè)：將菌株點(diǎn)接種于CAS固體培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7天，觀察菌落周圍是否有黃色暈圈的產(chǎn)生。

菌株溶磷與解鉀能力的測(cè)定：將菌株分別點(diǎn)接種于以磷酸鈣為磷源的PKO固體培養(yǎng)基和以大豆卵磷脂為磷源的有機(jī)磷固體培養(yǎng)基及鉀長(zhǎng)石培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)7天，觀測(cè)菌落形態(tài)及培養(yǎng)基變化。將菌株熒光假單胞菌按照1%的接種量接種到PKO和有機(jī)磷液體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)7天，離心取上清，采用鉬銻抗比色法測(cè)定溶磷量。

1.2 熒光假單胞菌的使用濃度試驗(yàn)

將KB培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h的熒光假單胞菌菌液離心取菌體沉淀，用無菌水重懸備用。盆栽試驗(yàn)在山東農(nóng)業(yè)大學(xué)南校區(qū)園藝實(shí)驗(yàn)基地進(jìn)行，栽培用土由基地表層園土、園藝栽培通用基質(zhì)(主要成分為泥炭、珍珠巖、椰糠、碳化稻殼等)與蛭石以2∶1∶1的比例配制而成，基本理化性質(zhì)為pH 8.20、堿解氮40.18 mg/kg、速效磷 51.53 mg/kg、速效鉀 78.45 mg/kg、有機(jī)質(zhì)23.05 g/kg。預(yù)備試驗(yàn)所用塑料盆高為20 cm，盆口直徑為24 cm、盆底直徑為15 cm，每盆裝土2 kg，供試材料為桃樹生產(chǎn)上常用的砧木毛桃[Prunuspersica(L.) Batsch]。選取實(shí)驗(yàn)室育好的長(zhǎng)勢(shì)一致的健壯毛桃實(shí)生苗移栽至盆中，1棵/盆，緩苗15天。熒光假單胞菌菌懸液配成4個(gè)濃度(0、2×108、4×108、6×108CFU/mL)，澆在土壤上，每次處理澆50 mL，每5天處理一次，共處理3次。在處理后20、40、60天時(shí)測(cè)定桃苗葉片SPAD值，處理后60天時(shí)測(cè)定桃苗葉綠素含量及生長(zhǎng)量，并確定最佳菌液處理濃度。

葉綠素含量的測(cè)定：葉綠素相對(duì)含量SPAD值由SPAD-502Plus葉綠素測(cè)定儀測(cè)定，葉綠素的絕對(duì)含量測(cè)定采用丙酮浸提比色法[18]。

生長(zhǎng)量的測(cè)定：株高采用皮尺測(cè)定，植株地上部與地下部的干重和鮮重采用萬分之一電子天平測(cè)定。

1.3 熒光假單胞菌對(duì)土壤理化及生物學(xué)性狀和桃樹生長(zhǎng)的影響試驗(yàn)

采用以毛桃為砧木，2年生的桃品種‘瑞光39/毛桃’ [P.persica(L.) Batsch]嫁接苗為試材進(jìn)行盆栽試驗(yàn)。栽培容器為直徑30 cm、高30 cm的美植袋，每袋用土16 kg，土壤理化性狀與預(yù)備試驗(yàn)一致。依據(jù)預(yù)備試驗(yàn)結(jié)果，熒光假單胞菌菌懸液(PF)的最佳濃度為4×108CFU/mL，此濃度作為處理用濃度。將PF澆在土壤上，然后覆土，每7天澆灌處理一次，每次澆灌300 mL，共澆灌4次，以清水處理(CK)為對(duì)照。在第4次澆灌處理后，于1、2、4、6周時(shí)采集桃樹根區(qū)土壤樣品測(cè)定熒光假單胞菌數(shù)量，于20和40天時(shí)取植株樣品測(cè)定光合指標(biāo)、生物量、根系生長(zhǎng)發(fā)育狀況和養(yǎng)分含量，于40天時(shí)采集根區(qū)土壤樣品測(cè)定土壤微生物結(jié)構(gòu)、酶活性、養(yǎng)分狀況和pH。

土壤中熒光假單胞菌數(shù)量的測(cè)定參照杜鵑等[19]的研究方法，即：以熒光假單胞菌的蛋白編碼基因gyrB作為靶標(biāo)基因，利用特異性引物建立實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法。

植物生理生化指標(biāo)與土壤理化性質(zhì)的測(cè)定主要參考趙世杰[18]和鮑士旦[20]的方法，各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定3次重復(fù)，結(jié)果取其平均值，具體方法如下：

葉片凈光合速率(Pn)、胞間二氧化碳濃度(Ci)、氣孔導(dǎo)度、蒸騰速率的測(cè)定：在晴天上午9：30—11：00，選取長(zhǎng)勢(shì)高度一致的桃苗葉片利用CIRAS-3便攜式光合儀測(cè)定系統(tǒng)(PP Systems，美國(guó))測(cè)定。

根系構(gòu)型的測(cè)定：取完整植物根系洗凈，放入A4尺寸掃描儀的丙烯酸托盤中，加水使根系均勻散開，避免交叉重疊，采用專業(yè)版Win RHIZO (Rgent Instruments Inc., Canada)根系分析軟件對(duì)根系構(gòu)型掃描和分析(分辨率為300 dpi)，各參數(shù)的設(shè)定參照軟件使用說明進(jìn)行。

植物養(yǎng)分含量的測(cè)定：植物材料經(jīng)H2SO4-H2O2消煮后采用火焰分光光度計(jì)法測(cè)定植物全鉀含量，采用鉬黃比色法測(cè)定植物全磷含量，采用凱氏定氮儀測(cè)定植物全氮含量；植物材料經(jīng)HNO3-H2O2微波消解后，采用原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定植株全鐵含量。

土壤養(yǎng)分含量的測(cè)定：根區(qū)土壤速效磷含量的測(cè)定采用碳酸氫鈉浸提—鉬銻抗比色法，堿解氮含量的測(cè)定采用堿解擴(kuò)散法，有機(jī)質(zhì)含量采用重鉻酸鉀容量法[21]，土壤全鐵含量采用DTAP浸提—原子吸收分光光度計(jì)測(cè)定。

土壤酶活性的測(cè)定：土壤脲酶活性采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測(cè)定，堿性磷酸酶活性采用磷酸苯二鈉比色法測(cè)定，蔗糖酶活性采用3,5-二硝基水楊酸比色法測(cè)定，過氧化氫酶活性采用高錳酸鉀滴定法測(cè)定[21]。

土壤微生物的測(cè)定：每處理采集5棵桃樹的根區(qū)土壤，混勻，對(duì)樣本的基因組DNA進(jìn)行提取，使用16S V4區(qū)引物(515F和806R)和ITS1區(qū)引物(ITS5-1737F和ITS2-2043R)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，使用TruSeq?DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫試劑盒進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit和QPCR定量，文庫合格后，使用NovaSeq6000進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理和分析

土壤微生物測(cè)序結(jié)果使用FLASH軟件進(jìn)行拼接，利用Uparse算法(Uparsev7.0.1001，http://www.drive5.com/uparse/)對(duì)所有樣本的全部Effective Tags進(jìn)行聚類，默認(rèn)以97%的一致性將序列聚類成為OTUs (Operational Taxonomic Units)，使用Qiime軟件(Version 1.9.1)計(jì)算Chao1和Shannon指數(shù)。

采用Excel和IBM SPSS Statistics 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算和分析，采用鄧肯多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，采用Pearson相關(guān)系數(shù)法進(jìn)行相關(guān)性分析，采用GraphPad Prism 8軟件進(jìn)行作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光假單胞菌的促生特性

經(jīng)過鑒定，促生熒光假單胞菌BNCC231887在NB培養(yǎng)基內(nèi)28℃培養(yǎng)7天之后，其培養(yǎng)液上清可與Salkowski試劑反應(yīng)顯紅色，而空白培養(yǎng)基與Salkowski試劑反應(yīng)不顯紅色，證明了熒光假單胞菌BNCC231887具有產(chǎn)IAA的能力，通過測(cè)定，IAA產(chǎn)量為6.17 mg/L；該菌株能夠在CAS檢測(cè)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)并使菌落周圍形成黃色暈圈，證明其可以產(chǎn)生鐵載體；該菌株在不溶性無機(jī)磷PKO固體培養(yǎng)基上形成透明圈，28℃培養(yǎng)7天之后其透明圈直徑(D)與菌落直徑 (d) 大小之比(D/d)為1.62，在不溶性有機(jī)磷培養(yǎng)基有較強(qiáng)的生長(zhǎng)能力，培養(yǎng)7天之后在不溶性無機(jī)磷和有機(jī)磷液體培養(yǎng)基中溶磷量分別為45.98和18.52 mg/L，表明了該菌株具有溶解磷酸鈣和一定的降解有機(jī)磷的能力；該菌株在鉀長(zhǎng)石培養(yǎng)基上呈光滑半透明的油滴狀，28℃培養(yǎng)7天之后直徑大小為5.22 mm，具備一定的解鉀能力(圖1)。

圖1 熒光假單胞菌產(chǎn)IAA能力的鑒定及其在不同培養(yǎng)基中的生長(zhǎng)形態(tài)Fig.1 Identification of IAA production and the colonies of P.fluorescens in different mediums

2.2 熒光假單胞菌對(duì)1年生毛桃實(shí)生苗生長(zhǎng)的影響

2.2.1 熒光假單胞菌對(duì)毛桃實(shí)生苗葉綠素含量的影響 通過檢測(cè)葉片SPAD值(圖2)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，使用不同濃度熒光假單胞菌處理毛桃實(shí)生苗均可顯著提高葉片SPAD值。如圖2所示，當(dāng)菌濃度低于4×108CFU/mL時(shí)，毛桃實(shí)生苗葉片SPAD值隨菌液處理濃度的升高而升高，當(dāng)菌液處理濃度超過4×108CFU/mL時(shí)，葉片SPAD值在處理后20和40天時(shí)與4×108CFU/mL處理持平，在處理后60天時(shí)較4×108CFU/mL處理降低，表明4×108CFU/mL濃度處理效果最好，在處理60天時(shí)4×108CFU/mL處理葉片SPAD值較對(duì)照顯著提高了43.5% (P＜0.05)。由于SPAD值體現(xiàn)葉片的相對(duì)葉綠素含量，因此我們進(jìn)一步對(duì)葉片的葉綠素絕對(duì)含量進(jìn)行了量化測(cè)定，結(jié)果顯示熒光假單胞菌處理顯著提高了葉片的葉綠素含量，且4×108CFU/mL為最佳處理濃度(表1)。這些結(jié)果表明熒光假單胞菌處理可以提高桃實(shí)生苗葉片的葉綠素含量，并且4×108CFU/mL熒光假單胞菌濃度處理效果最為顯著。

圖2 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹實(shí)生苗葉片SPAD值的影響Fig.2 Effects of P.fluorescens treatments on SPAD of peach seedling leaves

表1 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹實(shí)生苗葉片葉綠素含量的影響Table 1 Effects of P.fluorescens treatment on chlorophyll content of peach seedling leaves

2.2.2 熒光假單胞菌對(duì)桃樹實(shí)生苗根系構(gòu)型及植株生長(zhǎng)量的影響 首先通過測(cè)定不同處理的桃樹實(shí)生苗根系構(gòu)型，發(fā)現(xiàn)PF處理顯著增加了側(cè)根的數(shù)量，同時(shí)提高了根系表面積和體積，且4×108CFU/mL濃度作用效果最顯著(圖3)。

圖3 不同濃度熒光假單胞菌處理對(duì)毛桃實(shí)生苗根系構(gòu)型的影響Fig.3 Effects of P.fluorescens treatment on root architecture of peach seedling

由表2可看出，與對(duì)照相比，熒光假單胞菌處理顯著提高了桃樹實(shí)生苗的生長(zhǎng)量，4×108CFU/mL熒光假單胞菌濃度處理對(duì)提高桃苗地上與地下部干重提高效果最顯著，分別較對(duì)照提高了151.0%和93.3% (P＜0.05)。

表2 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹實(shí)生苗生物量的影響Table 2 Effects of P.fluorescens treatment on plant growth of peach seedling

2.3 熒光假單胞菌在桃樹嫁接苗根區(qū)土壤的定植

熒光假單胞菌在根區(qū)土壤的有效定植是其發(fā)揮作用的重要前提。在本試驗(yàn)中，通過土壤中熒光假單胞菌中g(shù)yrB基因的拷貝數(shù)來表示熒光假單胞菌的含量，CK組測(cè)得熒光假單胞菌含量表示土壤中本身含有的熒光假單胞菌含量。如圖4所示，在處理后第1周，由于外源施加大量熒光假單胞菌，PF處理桃樹根區(qū)土壤中熒光假單胞菌含量顯著高于CK。隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，在第2周時(shí)PF處理桃樹根區(qū)土壤中熒光假單胞菌含量較第1周顯著降低，但仍高于對(duì)照組，表明PF施入土壤2周有部分定植。在處理后第4～6周，PF處理桃樹根區(qū)土壤中熒光假單胞菌含量緩慢降低，仍顯著高于CK，表明熒光假單胞菌在施入土壤6周時(shí)仍有部分定植。該試驗(yàn)結(jié)果表明，熒光假單胞菌可在桃樹根區(qū)土壤中長(zhǎng)期定植，進(jìn)而發(fā)揮其促生作用。

圖4 不同處理時(shí)間的桃樹根區(qū)土壤的熒光假單胞菌含量Fig.4 The quantity of P.fluorescens in peach root-zone soil at different days after treatment

2.4 熒光假單胞菌對(duì)桃樹嫁接苗根區(qū)土壤的影響

2.4.1 熒光假單胞菌對(duì)土壤pH和土壤養(yǎng)分含量的影響 由表3可知，PF處理可以顯著降低桃樹根區(qū)土壤的pH，相比于CK降低了0.19；PF處理可顯著提高桃樹根區(qū)土壤的養(yǎng)分含量，其中有機(jī)質(zhì)、速效磷、堿解氮、速效鉀和有效鐵含量分別較CK提高了8.4%、42.3%、15.9%、39.5%和6.6% (P＜0.05)。

表3 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹根區(qū)土壤pH及養(yǎng)分含量的影響Table 3 Effects of P.fluorescens treatment on rhizospheric soil pH and nutrient contents of peach

2.4.2 熒光假單胞菌對(duì)土壤酶活性的影響 土壤酶活性是土壤肥力的一個(gè)重要指標(biāo)，在很大程度上反映了土壤中物質(zhì)循環(huán)與轉(zhuǎn)化的強(qiáng)度。如圖5所示，PF處理可以顯著提高桃樹根區(qū)的土壤酶活性，蔗糖酶、脲酶、堿性磷酸酶和過氧化氫酶活性分別較CK提高了37.6%、4.3%、34.2%和40.2% (P＜0.05)。

圖5 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹根區(qū)土壤酶活的影響Fig.5 Effects of P.fluorescens treatment on soil enzyme activity of root-zone of peach

2.4.3 熒光假單胞菌對(duì)土壤微生物群落的影響 如圖6所示，對(duì)于土壤細(xì)菌來說，從門水平上看，CK組的優(yōu)勢(shì)菌門為變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidota)、厚壁菌門(Firmicutes)、放線菌門(Actinobacteriota)和酸桿菌門(Acidobacteriota)，相對(duì)豐度分別為27.8%、11.6%、10.4%、8.0%和7.3%；PF處理和CK細(xì)菌群落組成相似，但其豐度存在差異，與CK相比，PF處理使變形菌門、酸桿菌門和放線菌門相對(duì)豐度分別提高了23.4%、8.6%和8.0%，擬桿菌門和厚壁菌門相對(duì)豐度分別降低了46.7%和35.7%。從屬水平上看，CK優(yōu)勢(shì)菌屬為擬桿菌屬(Bacteroides)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)和芽孢桿菌屬(Bacillus)，相對(duì)豐度分別為3.3%、3.9%和4.6%；PF組優(yōu)勢(shì)屬為擬桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬，與CK相比擬桿菌屬相對(duì)豐度降低了16.6%，鞘氨醇單胞菌相對(duì)豐度提高了32.2%，芽孢桿菌屬相對(duì)豐度為0.6%，與CK相比降低了86.7% (P＜0.05)。

圖6 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹根區(qū)土壤微生物相對(duì)豐度的影響Fig.6 Effects of P.fluorescens treatment on microbial relative abundance of root-zone soil of peach

對(duì)于土壤真菌來說，CK組優(yōu)勢(shì)菌門是子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)和擔(dān)子菌門(Basidiomycota)，相對(duì)豐度分別為71.1%、8.8%和2.9%；與CK相比，PF組子囊菌門相對(duì)豐度降低為67.1%，擔(dān)子菌門相對(duì)豐度降低為1.8%，而被孢霉門相對(duì)豐度較CK升高了21.2%。從屬水平上看，CK組優(yōu)勢(shì)菌屬為木霉菌屬(Trichoderma)、頭束菌屬(Cephalotrichum)、被孢霉屬(Mortierella)和毛殼霉屬(Chaetomium)，相對(duì)豐度分別為14.6%、6.6%、7.7%和8.9%，PF組木霉菌屬和毛殼霉屬相對(duì)豐度較CK分別顯著降低了79.5%和49.7% (P＜0.05)，頭束菌屬和被孢霉屬相對(duì)豐度較CK分別提高了58.0%和21.4%，鐮孢菌屬(Fusarium)相對(duì)豐度較CK顯著升高了45.2% (P＜0.05)，成為PF組優(yōu)勢(shì)菌屬之一。

土壤微生物群落的Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的豐度和多樣性，其中，Chao 1指數(shù)反映微生物群落豐富度，Shannon指數(shù)反映微生物群落多樣性。從圖7看出，對(duì)土壤細(xì)菌菌群而言，PF處理Chao 1和Shannon指數(shù)較CK沒有顯著提高，離散程度也較大；對(duì)于真菌菌群而言，PF處理使土壤真菌群落Chao 1和Shannon指數(shù)較CK分別提高了28.5%和8.5% (P＜0.05)，離散程度也小于CK。

圖7 桃樹根區(qū)土壤細(xì)菌和真菌Alpha多樣性分析Fig.7 Alpha diversity analysis of soil bacteria and fungus in peach root-zone soil

2.5 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹嫁接苗根系生長(zhǎng)的影響

由表4可以看出，與CK相比，PF處理可以促進(jìn)桃樹根系生長(zhǎng)，根系長(zhǎng)度、表面積、體積和根尖數(shù)分別顯著提高了23.2%、67.3%、21.3%和87.0%(P＜0.05)。

表4 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹根系生長(zhǎng)的影響Table 4 Effects of P.fluorescens treatment on root growth of peach

2.6 熒光假單胞菌對(duì)桃樹嫁接苗葉片光合參數(shù)的影響

PF處理顯著提高了桃樹葉片的凈光合速率，在處理后20和40天時(shí)分別較CK顯著提高了23.7%和8.3% (P＜0.05)，PF處理一定程度上也提高了桃樹葉片的氣孔導(dǎo)度和蒸騰速率(圖8)。

圖8 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹葉片光合參數(shù)的影響Fig.8 Effects of P.fluorescens treatment on photosynthetic parameters of peach leaves

2.7 熒光假單胞菌對(duì)桃樹嫁接苗養(yǎng)分含量的影響

由圖9看出，在處理后40天時(shí)，PF處理的桃樹葉片和根系的全氮、全磷和全鉀含量較CK都有顯著提高(P＜0.05)，其中全氮含量在葉片和根中分別提高了4.9%和52.9%，全鉀含量在葉片和根中分別提高了7.5%和17.4%，全磷含量在葉片和根中分別提高了9.2%和17.5%，對(duì)于植物全鐵含量來說，PF處理使桃樹葉片全鐵含量升高了26.0%，使根系全鐵含量降低了9.2%，表明熒光假單胞菌處理可能提高了桃樹含鐵量，并且影響鐵元素在植物體內(nèi)的分配。

圖9 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹養(yǎng)分含量的影響Fig.9 Effects of P.fluorescens treatment on nutrient content of peach

2.8 熒光假單胞菌對(duì)桃樹嫁接苗生物量的影響

由表5可以看出，PF處理可以顯著提高桃樹的生物量，與CK相比，株高提高了14.8% (P＜0.05)，莖粗增加了3.8%，地下部分和地上部分干重分別顯著提高了19.3%和19.9% (P＜0.05)。

表5 熒光假單胞菌處理對(duì)桃樹生物量的影響Table 5 Effects of P.fluorescens treatment on biomass of peach

2.9 桃樹根區(qū)土壤理化性質(zhì)與植物養(yǎng)分含量和生物量的相關(guān)性分析

由表6可知，在本試驗(yàn)中土壤pH與大部分土壤酶活性、土壤速效養(yǎng)分含量、葉片和根系養(yǎng)分含量和生物量顯著負(fù)相關(guān)，大部分土壤養(yǎng)分含量與植株養(yǎng)分含量和生長(zhǎng)顯著正相關(guān)，如土壤速效磷含量與土壤磷酸酶活性、桃樹全磷含量和桃樹生長(zhǎng)量顯著正相關(guān)，然而土壤有效鐵含量與桃樹葉片全鐵含量顯著正相關(guān)，但與根系全鐵含量無顯著相關(guān)關(guān)系。

表6 桃樹根區(qū)土壤理化性質(zhì)、土壤酶活與植株養(yǎng)分含量和生物量的相關(guān)性分析Table 6 Correlation analysis of soil physical and chemical properties, soil enzyme activity of peach root-zone with nutrient content and biomass of peach

3 討論

3.1 熒光假單胞菌的促生特性與根際定植

一株熒光假單胞菌往往具有多種促生機(jī)制，各種促生機(jī)制共同作用，調(diào)控植株生長(zhǎng)。在本試驗(yàn)中，熒光假單胞菌具有多種促生特性，包括產(chǎn)IAA、溶磷、解鉀、產(chǎn)鐵載體的能力，其中該菌株在解無機(jī)磷的定性與定量檢測(cè)中均表現(xiàn)出了較強(qiáng)的溶磷能力，具有很大的應(yīng)用潛力[21]。

在桃樹嫁接苗試驗(yàn)中，多次澆灌處理使熒光假單胞菌表現(xiàn)出了較長(zhǎng)時(shí)間的根際定植，進(jìn)而充分發(fā)揮其促生作用。在實(shí)際生產(chǎn)中，可以進(jìn)行熒光

假單胞菌處理技術(shù)簡(jiǎn)化，比如選在桃樹的關(guān)鍵物候期，結(jié)合平時(shí)施肥與澆水處理。為了提高熒光假單胞菌的定植率和定植時(shí)間，也可以將熒光假單胞菌制成海藻微膠囊埋入根區(qū)土壤從而達(dá)到緩釋的作用[22]。

3.2 熒光假單胞菌對(duì)桃樹根系生長(zhǎng)和光合作用的影響

植物通過根系與土壤進(jìn)行營(yíng)養(yǎng)交換[23]，植物根系吸收水分和養(yǎng)分的能力在一定程度上可以通過根長(zhǎng)和表面積等指標(biāo)來體現(xiàn)[24]。在本試驗(yàn)中，熒光假單胞菌處理顯著提高了桃樹嫁接苗根系的根長(zhǎng)，增加了根系表面積和體積，促進(jìn)了桃樹水分和養(yǎng)分的吸收。植物根系的生長(zhǎng)與側(cè)根的發(fā)育受植物激素IAA的調(diào)控，前人研究證明，產(chǎn)IAA菌產(chǎn)生的IAA作為外源植物激素，可以顯著增加植物側(cè)根和根毛的數(shù)量，提高植株內(nèi)部生長(zhǎng)素的濃度[25]；王婧[26]研究發(fā)現(xiàn)，枯黃假單胞菌產(chǎn)生IAA可顯著促進(jìn)番茄側(cè)根的發(fā)育和提高玉米根長(zhǎng)。在本試驗(yàn)中，PF處理使桃樹嫁接苗根長(zhǎng)和根尖數(shù)顯著增加，這可能歸因于PF產(chǎn)生的微量IAA。

光合作用是植物生長(zhǎng)的生理基礎(chǔ)，光合作用增強(qiáng)，植株生物量也會(huì)隨之增加[27]。在本試驗(yàn)中，PF處理顯著提高了桃樹葉片的凈光合速率，同時(shí)顯著提高了植物干重。PF處理通過光合作用提高植株生物量的方式有以下兩個(gè)方面：首先，葉綠素含量是影響光合作用的重要因素，其含量的增加有利于植物葉片對(duì)光能的捕獲進(jìn)而增強(qiáng)光合作用[28]，在本試驗(yàn)中，PF處理顯著提高了桃樹葉片的葉綠素含量，這與前人研究結(jié)果[29-30]一致；其次，氣孔導(dǎo)度的增加有利于植物光合作用的提高[31]，在本試驗(yàn)中，PF處理使植株葉片氣孔導(dǎo)度增強(qiáng)，促進(jìn)了CO2的吸收，進(jìn)而提高了植株的凈光合速率。

3.3 熒光假單胞菌對(duì)桃樹根區(qū)土壤速效養(yǎng)分和植株養(yǎng)分含量的影響

磷和鉀是植物必需的營(yíng)養(yǎng)元素，在保障作物高產(chǎn)、增強(qiáng)作物抗性和提升作物品質(zhì)等多方面起著不可替代的作用，但土壤中大部分磷和鉀都以難溶性的磷酸鹽和硅酸鹽形態(tài)存在，無法直接被植物吸收利用。具備溶磷和解鉀能力的植物根際促生菌可以將土壤中難溶性磷和鉀轉(zhuǎn)化為植物可直接吸收利用的和K+，提高磷鉀肥利用率，促進(jìn)作物生長(zhǎng)[32-33]。本試驗(yàn)首先鑒定了熒光假單胞菌具有溶磷和解鉀的促生特性，根施處理顯著提高了桃樹根區(qū)土壤速效磷和速效鉀含量，促進(jìn)了桃樹根際土壤中難溶性磷和鉀的轉(zhuǎn)化；同時(shí)熒光假單胞菌處理還顯著降低了根區(qū)土壤的pH，且土壤pH與土壤速效磷、速效鉀含量顯著負(fù)相關(guān)。由于熒光假單胞菌的施用導(dǎo)致了土壤pH的降低，進(jìn)而提高了土壤速效磷鉀養(yǎng)分含量，進(jìn)一步提高了桃樹全磷和全鉀含量和生物量。

鐵元素是植物不可或缺的微量元素，土壤中的絕大部分鐵都是以難溶于水的Fe3+形式存在，不能被根系吸收，有效態(tài)鐵含量很低。根際促生菌產(chǎn)生的鐵載體能活化土壤中的Fe3+，增加土壤鐵的溶解性，從而提高土壤中鐵的有效性，不僅可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)，而且也能幫助植物抵御病原菌的侵染[34]。前人研究證明，土壤有效鐵含量受土壤pH影響較大，每升高一個(gè)pH單位，土壤溶液中鐵的活性減小1000倍[35]。在本試驗(yàn)中，熒光假單胞菌處理提高了桃樹根際土壤有效態(tài)鐵的含量，促進(jìn)了植物對(duì)鐵元素的吸收，顯著增加了桃樹葉片的總鐵含量，一方面可能歸因于熒光假單胞菌具有產(chǎn)生鐵載體的能力，另一方面是由于熒光假單胞菌降低了土壤pH，從而促進(jìn)土壤中無效鐵到有效鐵的轉(zhuǎn)化。

3.4 熒光假單胞菌對(duì)桃樹根區(qū)土壤生物學(xué)特征的影響

土壤是土壤中各種生理生化反應(yīng)的場(chǎng)所。土壤酶在催化土壤多種生化反應(yīng)中起著重要作用，土壤酶活性升高會(huì)加速土壤養(yǎng)分的分解與轉(zhuǎn)化，促進(jìn)植物對(duì)土壤養(yǎng)分的吸收與利用[36]，其中脲酶與植物的氮素營(yíng)養(yǎng)吸收有關(guān)[37]，蔗糖酶活性能夠反映土壤有機(jī)碳累積與分解轉(zhuǎn)化的規(guī)律[38]，磷酸酶能促進(jìn)有機(jī)磷化合物和無機(jī)磷酸鹽轉(zhuǎn)化，有利于植物對(duì)磷的吸收與利用[39]，過氧化氫酶有助于土壤中過氧化氫的分解，降低土壤有害物質(zhì)對(duì)植物體的毒害作用。本試驗(yàn)中，熒光假單胞菌處理提高了土壤酶活性，包括土壤脲酶、蔗糖酶、磷酸酶以及過氧化氫酶，這與前人的研究結(jié)果[40]一致，熒光假單胞菌處理使土壤磷酸酶活性顯著升高，導(dǎo)致了土壤速效磷含量升高，進(jìn)而導(dǎo)致植株全磷含量的增加。

土壤酶大多來源于土壤微生物，土壤微生物也是土壤生化反應(yīng)的主要驅(qū)動(dòng)力[41]。本試驗(yàn)中，熒光假單胞菌處理使土壤細(xì)菌和真菌群落的Shannon和Chao 1指數(shù)提高，提高了土壤微生物群落的豐富度和多樣性。從微生物群落結(jié)構(gòu)上來看，熒光假單胞菌處理改變了細(xì)菌各優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度，其中變形菌門、酸桿菌門和放線菌門的相對(duì)豐度提高，擬桿菌門和厚壁菌門的相對(duì)豐度降低。熒光假單胞菌處理沒有改變土壤中的優(yōu)勢(shì)菌門，這可能是由于它們?cè)谕寥乐械纳鷳B(tài)幅較寬[42]，外源熒光假單胞菌的短期處理對(duì)它們的分布影響較小。變形菌門包含大量有益微生物，如大量α變形桿菌與固氮相關(guān)，酸桿菌門可以通過參與腐殖酸降解的碳循環(huán)、分泌植物激素IAA等促進(jìn)植物生長(zhǎng)，放線菌門可以降解大量有機(jī)物質(zhì)，同時(shí)還可以拮抗病菌，這些菌群在維持土壤生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定中起重要作用[43]。熒光假單胞菌處理也顯著改變了土壤真菌各優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度，其中被孢霉門相對(duì)豐度顯著升高。腐生真菌被孢霉門在有機(jī)質(zhì)含量高的土壤中相對(duì)豐度較高，在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化中起重要作用，前人研究證明，施加被孢霉可以提高園區(qū)土壤的速效磷、鉀、鈣、鎂含量，促進(jìn)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，促進(jìn)植株生長(zhǎng)[44-45]。

土壤的理化性質(zhì)與土壤微生物群落結(jié)構(gòu)是相互影響的，前人研究證明，通過施加微生物菌劑，使栽培基質(zhì)中微生物數(shù)量增加，酶活性升高，促進(jìn)了基質(zhì)中有機(jī)物的分解與轉(zhuǎn)化，促進(jìn)了植物對(duì)養(yǎng)分的吸收與利用[46]。在本試驗(yàn)中，由于外源添加了大量熒光假單胞菌，改善了土壤微生物群落，土壤微生物群落的改變又導(dǎo)致了土壤養(yǎng)分被微生物大量固定，加速了土壤有機(jī)物的合成與轉(zhuǎn)化[47]，根區(qū)微生物活動(dòng)的增加，使根區(qū)土壤酶活性增加，土壤肥力提高，進(jìn)而促進(jìn)了桃樹生長(zhǎng)。

4 結(jié)論

熒光假單胞菌具有產(chǎn)IAA和鐵載體、溶解無機(jī)磷和有機(jī)磷、降解難溶性鉀的促生特性。土壤施用熒光假單胞菌菌懸液可以顯著改善桃樹嫁接苗根區(qū)土壤環(huán)境，增加根區(qū)土壤微生物群落多樣性，改變根區(qū)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，降低土壤pH，提高根區(qū)土壤速效氮磷鉀和鐵含量，提高土壤酶活性，從而促進(jìn)了桃樹嫁接苗側(cè)根的形成和生長(zhǎng)，提高了葉片的凈光合速率和養(yǎng)分含量，進(jìn)而促進(jìn)桃樹生長(zhǎng)。