磷脂酶C對大豆原油脫膠效果的研究

李 軍，楊靜媚，蘇 沛，姜碧若，楊小平，徐浩宇，畢艷蘭

(1.河南工業(yè)大學 糧油食品學院，鄭州 450001； 2.中儲糧油脂工業(yè)東莞有限公司，廣東 東莞 523147)

原油中通常含有一定量的膠溶性雜質(zhì)，主要包括磷脂、蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)和糖基甘二酯等[1]。膠溶性雜質(zhì)的存在不但影響油脂的穩(wěn)定性，還會影響油脂精煉和深度加工的效果[2]。因此，脫膠工序在油脂精煉過程中必不可少。

傳統(tǒng)的油脂脫膠方式有水化脫膠和酸化脫膠。水化脫膠用于去除原油中大部分的水化磷脂[3]；酸化脫膠可把部分非水化磷脂轉(zhuǎn)化為水化磷脂而脫除[4-5]。然而，傳統(tǒng)的脫膠方式不僅化學品消耗大、水耗高，而且脫膠油得率低、殘磷量高[6]，這給精煉后續(xù)工序帶來較大的操作負擔，同時也使成品油的品質(zhì)降低，影響成品油的使用特性[7]。

近年來，酶法脫膠因反應條件溫和、環(huán)境友好，符合綠色、環(huán)保、可持續(xù)的發(fā)展戰(zhàn)略理念，越來越受到油脂加工行業(yè)的關(guān)注與青睞[8-11]。磷脂酶C主要作用于磷脂sn-3位的酯鍵，生成易溶于水的磷酸膽堿、磷酸乙醇胺、磷酸肌醇等而被脫除，同時生成的甘二酯可增加中性油的得率。目前，關(guān)于采用磷脂酶C酶法脫膠的研究已有報道[12-14]，但大多集中在磷脂脫除效果和脫膠油得率方面[11-13]，而很少關(guān)注脂肪酸和甘油酯的組成和含量變化，尤其是甘二酯含量以及油腳中磷脂組成和含量的變化。

本文以大豆原油為原料，對磷脂酶C的酶法脫膠效果進行研究，考察脫膠油中磷脂含量和中性油得率變化、甘油酯和脂肪酸的組成和含量變化以及油腳中磷脂組成和含量的變化。在單因素實驗的基礎(chǔ)上，采用正交實驗對脫膠工藝參數(shù)進行優(yōu)化，為在油脂行業(yè)推廣酶法脫膠技術(shù)提供一定的數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料與試劑

大豆原油，由新鄭中儲糧油脂有限公司提供；磷脂酶C，Novozyme公司。

檸檬酸、氧化鋅、鹽酸、氫氧化鉀、硫酸聯(lián)氨、鉬酸鈉、正己烷、無水硫酸鈉、乙醚、異丙醇、三氯甲烷、冰乙酸、碘化鉀、可溶性淀粉、硫代硫酸鈉、甲酸，均為分析純，購于當?shù)卦噭┙?jīng)銷商。

1.1.2 儀器與設(shè)備

BSA224S分析天平(精確至0.1 mg)，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；LT1001E精密電子天平，常熟市天量儀器有限責任公司；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器，鞏義市予華儀器責任有限公司；HH-6A數(shù)顯恒溫磁力攪拌水浴鍋，常州榮華儀器制造有限公司；WGL-125B電熱鼓風干燥箱，天津市泰斯特儀器有限公司；CenLee16K臺式高速離心機，湖南湘立科學儀器有限公司；DL-1萬用電爐，北京中興偉業(yè)儀器有限公司；PHS-3C數(shù)顯臺式酸度計，上海浦春計量儀器有限公司；8860氣相色譜分析儀，美國安捷倫公司；TU-1810紫外可見光分光光度計，北京普斯通用儀器有限責任公司；Bruker AVANCE III 500 MHz核磁儀，德國布魯克公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 大豆原油的脫膠

1.2.1.1 酶法脫膠

稱取100 g大豆原油于500 mL圓底燒瓶中，水浴加熱至80℃后，加入0.11～0.17 mL 0.45 g/mL檸檬酸溶液，繼續(xù)攪拌反應25 min。然后，將溫度降至45～60℃，加入2%蒸餾水和20～50 mg/100 g(以油的質(zhì)量計，下同)的磷脂酶C，繼續(xù)攪拌反應1～4 h。待反應結(jié)束后，將體系溫度升到90℃，滅酶10 min。將油樣在10 000 r/min下離心15 min，分別收集上層油相和底部油腳。上層油相于103℃下干燥1 h，在玻璃干燥器中冷卻后，稱量質(zhì)量計算脫膠油得率，然后將脫膠油轉(zhuǎn)入樣品瓶，測定含磷量。底部油腳采用31P NMR測定其磷脂組成。

1.2.1.2 酸化脫膠

酸法脫膠的操作過程，除不添加磷脂酶C之外，其他與1.2.1.1完全相同。

1.2.2 大豆原油基本理化指標測定

水分及揮發(fā)物含量測定參照GB 5009.236—2016《食品安全國家標準 動植物油脂水分及揮發(fā)物的測定》，酸值測定參照GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》，過氧化值測定參照GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》。

1.2.3 大豆原油和脫膠油脂肪酸組成測定

油樣先進行甲酯化，再采用氣相色譜法測定脂肪酸含量，其中甲酯化方法參考GB 5009.168—2016《食品中脂肪酸的測定》，氣相色譜條件具體參考文獻[15]。采用峰面積歸一化法定量。

1.2.4 大豆原油和脫膠油甘油酯組成測定

大豆原油和脫膠油甘油酯組成的測定參考宗蕾等[16]的方法。

1.2.5 大豆原油和脫膠油含磷量的測定

大豆原油和脫膠油中含磷量的測定參照GB/T 5537—2008《糧油檢驗 磷脂含量的測定》，采用鉬藍比色法。

1.2.6 油相pH的測定

油相pH的測定參考Jahani等[17]的方法。稱取2 mL待測油水乳化液與2 mL去離子水于離心管，充分混合，在10 000 r/min下離心10 min，移除上層油相，使用pH計測定剩余水相pH。

1.2.7 油腳中磷脂組成測定

稱取一定量的油腳溶于0.6 mL氘代氯仿和0.6 mL 甲醇的混合溶液中，再加入0.6 mL EDTA緩沖溶液調(diào)整pH至8.5，待油腳完全溶解后，旋渦振蕩1 min，在3 000 r/min下離心10 min，取下層清液注入核磁管，于Bruker AVANCE III 500 MHz核磁儀中進行測定，測定參數(shù)為5 mm PABBO探頭、zgpg30脈沖序列、次數(shù)1 024次、脈沖等待時間2 s。

1.2.8 數(shù)據(jù)處理

所有實驗至少重復兩次，數(shù)據(jù)采用“平均值±標準偏差”的形式表示，數(shù)據(jù)顯著性采用SPSS 16.0進行分析，以p值為0.05作為判斷顯著性的臨界限。

2 結(jié)果與討論

2.1 大豆原油指標測定結(jié)果

本研究所用原料為汽提大豆原油，其主要理化指標如表1所示。

表1 大豆原油理化指標

由表1可知，大豆原油的水分及揮發(fā)物含量為0.23%，略高于GB/T 1535—2017《大豆油》中對水分及揮發(fā)物含量(≤0.02%)的要求，這與原油汽提時溶劑和水分未完全去除有關(guān)。大豆原油的酸值(KOH)和過氧化值分別為1.02 mg/g和0.66 mmol/kg，符合GB/T 1535—2017《大豆油》和GB 2716—2018《植物油》中對原油酸值(KOH)(≤4 mg/g)和過氧化值(≤9.85 mmol/kg)的要求。大豆原油的含磷量達到808.75 mg/kg。

大豆原油的脂肪酸和甘油酯組成見表2。

表2 大豆原油脂肪酸和甘油酯組成 %

由表2可知，大豆原油中主要包括10.80%棕櫚酸、4.25%硬脂酸、20.34%油酸、54.87%亞油酸和7.63%亞麻酸，符合GB/T 1535—2017《大豆油》中各脂肪酸含量的范圍。大豆原油的甘油酯組成包括0.59%甘一酯、2.10%甘二酯和97.31%甘三酯。少量甘一酯和甘二酯的存在是由于大豆收獲過程中自身含有或者脂肪酶水解造成的。

2.2 磷脂酶C脫膠單因素實驗

2.2.1 脫膠溫度對脫膠油中含磷量的影響

在大豆原油質(zhì)量100 g、0.45 g/mL檸檬酸添加量0.13 mL、加酶量40 mg/100 g、加水量2%、脫膠時間4 h的條件下，考察脫膠溫度(45～60℃)對脫膠油中含磷量的影響，結(jié)果如圖1所示。

注：圖中不同小寫字母表示差異顯著，p<0.05。下同圖1 脫膠溫度對脫膠油中含磷量的影響

由圖1可知，隨著脫膠溫度的升高，脫膠油中的含磷量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。脫膠油的含磷量在脫膠溫度為50℃時最低，為1.04 mg/kg。當反應溫度低于酶的最適溫度時，隨著溫度的升高，酶的活性增強；當反應溫度高于酶的最適溫度時，隨著溫度的升高，酶的活性減弱甚至喪失。因此，選擇50℃為磷脂酶C的最適脫膠溫度。

2.2.2 加酶量對脫膠油中含磷量的影響

在大豆原油質(zhì)量100 g、0.45 g/mL檸檬酸添加量0.13 mL、加水量2%、脫膠溫度50℃、脫膠時間4 h的條件下，考察加酶量(20～50 mg/100 g)對脫膠油中含磷量的影響，結(jié)果如圖2所示。

圖2 加酶量對脫膠油中含磷量的影響

由圖2可知，隨著加酶量的增加，脫膠油中的含磷量總體呈現(xiàn)先下降后升高的趨勢。脫膠油的含磷量在加酶量為40 mg/100 g時達到最低值1.04 mg/kg，低于酸化脫膠油(加酶量為0)的含磷量(1.63 mg/kg)。隨著加酶量的進一步增加，脫膠油的含磷量反而有所回升，其原因為加酶量的進一步增加引起水分活度降低，導致酶活性下降。Gomez等[18]研究發(fā)現(xiàn)不同種類的胞外酶對水分活度的敏感性具有很大差異，且酶活性隨水分活度的增加先增加后減少。因此，選擇40 mg/100 g作為磷脂酶C的最適添加量。

2.2.3 檸檬酸添加量對脫膠油中含磷量的影響

在大豆原油質(zhì)量100 g、加酶量40 mg/100 g、加水量2%、脫膠溫度50℃、脫膠時間4 h的條件下，考察0.45 g/mL檸檬酸添加量(0.11～0.17 mL)對脫膠油中含磷量的影響，結(jié)果如圖3所示。表3為不同體積0.45 g/mL檸檬酸添加量所對應的pH。

表3 不同體積0.45 g/mL檸檬酸添加量下的pH

圖3 0.45 g/mL檸檬酸添加量對脫膠油中含磷量的影響

由圖3可知，隨著加酸量的增大(即pH的降低)，脫膠油中的含磷量呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。脫膠油的含磷量在檸檬酸添加量為0.13 mL(pH 5.10)時達到最低值1.04 mg/kg。隨著檸檬酸添加量的進一步增加，脫膠油的含磷量迅速回升，在檸檬酸添加量為0.17 mL時，脫膠油含磷量達到9.66 mg/kg，其原因為過多的酸導致體系pH過低，使磷脂酶活性大幅度降低。因此，選擇0.13 mL(pH 5.10)作為檸檬酸最適添加量(最適pH)。

2.2.4 脫膠時間對脫膠油中含磷量的影響

在大豆原油質(zhì)量100 g、0.45 g/mL檸檬酸添加量0.13 mL、加酶量40 mg/100 g、加水量2%、脫膠溫度50℃的條件下，考察脫膠時間(1～4 h)對脫膠油中含磷量的影響，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著脫膠時間的延長，脫膠油中的含磷量總體呈現(xiàn)下降趨勢，剛開始的1～2 h內(nèi)，油中含磷量迅速下降，這是由于大部分磷脂與水結(jié)合而被脫除。隨著脫膠時間的延長，磷脂與水在磷脂酶C的作用下轉(zhuǎn)化為磷酸膽堿、磷酸肌醇等進入水相。當脫膠時間達到4 h時，脫膠油的含磷量降低至1.04 mg/kg。從油脂加工角度來說，進一步延長時間降低脫膠油的含磷量已意義不大。因此，選擇4 h作為最適脫膠時間。

圖4 脫膠時間對脫膠油中含磷量的影響

2.3 磷脂酶C脫膠正交實驗

在單因素實驗基礎(chǔ)上，固定脫膠時間為4 h，采用4因素3水平正交表進行正交實驗，優(yōu)化酶法脫膠工藝參數(shù)，結(jié)果如表4所示。

表4 磷脂酶C脫膠正交實驗設(shè)計及結(jié)果

由表4的極差(R)分析結(jié)果可知，3個因素的影響順序依次是加酶量>脫膠溫度>檸檬酸添加量，即加酶量對磷脂酶C脫膠的影響最為顯著，其次是脫膠溫度、檸檬酸添加量。磷脂酶C脫膠的最佳方案為A2B2C3，即最佳反應條件為0.45 g/mL檸檬酸添加量0.15 mL、加酶量40 mg/100 g、脫膠溫度50℃、脫膠時間4 h。

在最佳脫膠條件下，本文測定了磷脂酶C脫膠油的含磷量、得率、酸值、甘油酯組成和脂肪酸組成(大豆原油質(zhì)量200 g)，結(jié)果如表5、表6所示。

表5 最佳脫膠條件下磷脂酶C添加前后脫膠油含磷量、得率、酸值及甘油酯組成

表6 磷脂酶C脫膠大豆油的脂肪酸組成及相對含量 %

由表5可知，最佳條件下磷脂酶C脫膠油的含磷量低于酸化脫膠油的含磷量，這是由于磷脂酶C水解使得更多的磷脂以磷酸膽堿、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等形式溶于水相而被去除。與酸化脫膠油相比，磷脂酶C脫膠油的酸值有所回升，是由于更多的磷脂以磷酸膽堿、磷酸肌醇、磷酸乙醇胺等形式脫除，減少了對游離脂肪酸的吸附。

由表5還可知，與酸化脫膠油的甘油酯組成相比，磷脂酶C脫膠油中甘二酯相對含量增加，說明磷脂酶C起到了很好地水解磷脂的作用。由于表5中數(shù)據(jù)表征的是油脂中甘一酯、甘二酯、甘三酯的相對含量，所以由于甘二酯的增多，導致磷脂酶C脫膠油中甘三酯的相對含量降低。

磷脂酶C水解磷脂致使甘二酯增加，理論上可以達到增加脫膠油得率的目的，即磷脂酶C脫膠油的得率應大于酸化脫膠油的得率。然而，表5的結(jié)果顯示兩者無顯著差異，這主要是由于實驗室的反應體系較小，且采用的籃式離心機在離心效果方面不如工業(yè)上使用的碟片式離心機。

另外，甘一酯和甘二酯含量的提升雖然可增加中性油的得率，但是也存在后續(xù)精煉脫臭過程中有害成分縮水甘油酯和3-氯丙醇酯增加的風險。Codex標準指出，甘一酯和甘二酯含量超過3%～4%會顯著影響縮水甘油酯的增加量[19]。本研究酶法脫膠油中甘一酯和甘二酯的含量為2.5%，未達到顯著影響縮水甘油酯生成的界限。而且，實際生產(chǎn)過程中可根據(jù)縮水甘油酯和3-氯丙醇酯的實際含量，考慮合適的脫臭工藝條件如雙溫脫臭工藝，進一步防控其生成。

由表6可知，與大豆原油相比，磷脂酶C脫膠油的脂肪酸組成沒有變化，豆蔻酸、棕櫚酸、硬脂酸和油酸的相對含量無顯著差異，亞油酸的相對含量僅降低0.93百分點，亞麻酸的相對含量僅升高0.15百分點，說明磷脂酶C脫膠基本不影響油脂的脂肪酸組成及相對含量，這一結(jié)果與Mahmood-Fashandi等[20]的報道一致。

2.4 油腳中磷脂的表征

為了更好地了解酸化脫膠和磷脂酶C脫膠過程中磷脂的變化情況，因脫膠油中磷脂含量太低而無法通過核磁進行定量，對油腳中磷脂的相對含量通過31P NMR進行了測定，結(jié)果如圖5和表7所示。

注：PA.磷脂酸；PE.磷脂酰乙醇胺；PI.磷脂酰肌醇；PC.磷脂酰膽堿圖5 酸化脫膠和磷脂酶C脫膠油腳中磷脂的31P NMR圖譜

表7 酸化脫膠和磷脂酶C脫膠油腳中磷脂的相對含量 %

由圖5、表7可知，酸化脫膠油腳中磷脂以磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)和磷脂酸(PA)為主，未檢測到溶血磷脂，這與俞樂[21]的研究結(jié)果是相似的。與酸化脫膠油腳相比，磷脂酶C脫膠油腳中磷脂的組成無變化，這主要是由于磷脂酶C作用于磷脂sn-3位，不會引起磷脂組成的變化。另外，與酸化脫膠油腳磷脂各組分的相對含量相比，磷脂酶C脫膠油腳中磷脂各組分的相對含量也無顯著差異，這說明磷脂酶C對PC、PE、PI和PA的作用無選擇性。

3 結(jié) 論

酶法脫膠實驗表明，磷脂酶C能有效脫除大豆原油中的磷脂。與酸化脫膠油相比，磷脂酶C脫膠油中含磷量降至1.00 mg/kg，甘二酯相對含量增加1.15百分點，而甘三酯相對含量減少。磷脂酶C脫膠油得率與酸化脫膠油得率無顯著差異。磷脂酶C脫膠油與大豆原油的脂肪酸組成和相對含量基本一致。與酸化脫膠油腳相比，磷脂酶C脫膠油腳中磷脂的組成無變化，各組分相對含量也無顯著差異。磷脂酶C對磷脂酰膽堿、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和磷脂酸的作用無選擇性。