整合素α4在美洲大蠊提取物黏糖氨酸抗肝纖維化中的作用

魯 杰， 周義霞， 劉 葉， 高 雅， 陳科璇， 李頂春， 陳一暉， 劉懷鄂， 王宏圖， 李 武

昆明醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 感染與肝病科， 昆明 650032

整合素參與了細(xì)胞的存活、增殖、黏附、遷移、侵襲等功能，調(diào)節(jié)血管生成、腫瘤生長(zhǎng)、細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix, ECM)的降解[1-2]，在多種疾病中上調(diào)，且與肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)的活化有著重要關(guān)聯(lián)[3-5]，在肝癌、肝纖維化、乙型肝炎、丙型肝炎及非酒精性脂肪性肝病等慢性肝病中的相關(guān)研究也越來(lái)越多。整合素α4(integrin α4, ITGA4)也稱CD49d，作為黏附受體是細(xì)胞骨架動(dòng)力學(xué)和細(xì)胞遷移的重要調(diào)節(jié)因子，主要在T淋巴細(xì)、B淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、嗜堿細(xì)胞、NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞上表達(dá)。炎癥反應(yīng)和免疫失調(diào)是導(dǎo)致肝纖維化的主要病理機(jī)制。ITGA4激活后可促進(jìn)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等白細(xì)胞向黏膜、骨髓、脾臟、肝臟等炎癥部位遷移，因此參與了肝纖維化中的炎癥反應(yīng)、適應(yīng)性免疫和固有免疫的每一步[6]，在肝纖維化的發(fā)生機(jī)制中具有不可替代的作用。黏糖氨酸(aticky sugar amino acid, SSAA)是利用現(xiàn)代工藝從美洲大蠊中提取的以黏糖氨酸為主要有效成分的制劑，具有抗菌、抗腫瘤、營(yíng)養(yǎng)肌肉神經(jīng)、保肝、抗纖維化作用。為此，本文以SSAA的抗肝纖維化作用為基礎(chǔ)，CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化造模，設(shè)定不同的SSAA干預(yù)濃度，研究ITGA4等細(xì)胞因子在肝纖維化中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 美洲大蠊提取物SSAA，昆明賽諾制藥有限公司提供，系肝龍膠囊原藥(批準(zhǔn)文號(hào)：國(guó)藥準(zhǔn)字Z2005113；執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)：YBZ04142005)。以每150 mg SSAA固體溶于15 mL生理鹽水，配置成10 mg/mL的SSAA的混懸液；CCl4與橄欖油溶液以V∶V=3∶7配制成30%的CCl4/橄欖油溶液。以1 g秋水仙堿溶于5 mL的磷酸鹽緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline, PBS)配制成200 mg/mL的秋水仙堿溶液，搖勻后再取0.1 mL溶于100 mL PBS中，配制成0.2 mg/mL的秋水仙堿溶液，冰箱保存?zhèn)溆谩＝】礢PF級(jí)SD大鼠80只，雄性，體質(zhì)量180～220 g，由昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)部提供。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào): SCXK(滇)K2020-0004。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中飼養(yǎng)條件相同，定期清潔、消毒。

1.2 試劑 秋水仙堿購(gòu)自上海源葉生物科技有限公司；CCl4購(gòu)自天津化學(xué)試劑三廠；橄欖油購(gòu)自Alladdin公司；肝纖四項(xiàng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成公司；總RNA提取試劑Trizol購(gòu)自Thermofisher公司；RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA試劑盒購(gòu)自Thermofisher公司；PCR試劑盒購(gòu)自Roche公司；PCR引物由昆明碩擎生物技術(shù)有限公司合成；ITGA4、ITGB1、α平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)抗體購(gòu)自Cell Signaling公司；TGFβ1抗體購(gòu)自Proteintech公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)2、TIMP1抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology公司；β-actin抗體購(gòu)自Proteintech公司；蘇木素-伊紅(HE)染色液購(gòu)自Solarbio公司。

1.3 方法 將80只大鼠隨機(jī)分為7組，空白對(duì)照組(n=10)、SSAA組(n=10)、CCl4模型組(n=12)、秋水仙堿組(n=12)、SSAA低劑量組(n=12)、SSAA中劑量組(n=12)、SSAA高劑量組(n=12)?？瞻讓?duì)照組和SSAA組分別以蒸餾水與配置的10 mg/mL的SSAA溶液按大鼠體質(zhì)量120 mg/kg灌胃。CCl4模型組、秋水仙堿組及SSAA低、中、高劑量組以30%的CCl4/橄欖油溶液1 mL/kg腹腔注射，2次/周，連續(xù)12周造模，同時(shí)秋水仙堿組以0.2 mg/mL的秋水仙堿溶液按大鼠體質(zhì)量0.2 mg/kg灌胃，1 次/d；SSAA低、中、高劑量組以配置的10 mg/mL的SSAA溶液分別按大鼠體質(zhì)量以30 mg/kg、60 mg/kg、120 mg/kg灌胃[7]，2次/d。末次灌胃后，予所有大鼠禁食24 h，不禁水。取樣前，先予大鼠乙醚吸入麻醉，眼眶處采血，然后取肝左中部及右上葉前部標(biāo)本，行血液、肝組織標(biāo)本檢測(cè)。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 血清ALT、AST檢測(cè) 大鼠眼眶取血，采用全自動(dòng)生化檢測(cè)儀檢測(cè)血清ALT、AST，步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書執(zhí)行。

1.4.2 肝組織病理染色 選取肝右葉，取0.5 cm×0.4 cm×0.4 cm肝組織，將肝組織固定在4%多聚甲醛中，脫水、透明、浸蠟后包埋在石蠟中并切片成4 μm厚的連續(xù)切片，脫蠟、水化后行HE染色、天狼猩紅染色。

1.4.3 免疫組化染色 將肝組織于室溫下固定在4%多聚甲醛中，常規(guī)制備石蠟切片，石蠟切片脫蠟至水化、抗原修復(fù)、阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶、血清封閉等步驟后，加第一抗體4 ℃孵育過(guò)夜；加第二抗體37 ℃孵育1 h，加新鮮配置的DAB顯色液顯色后，復(fù)染細(xì)胞核、脫水封片，顯微鏡下觀察、拍照，棕褐色為陽(yáng)性。

1.4.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)大鼠肝組織各因子轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá) Trizol分離提取肝組織中總RNA，將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明操作，通過(guò)目的基因定量拷貝數(shù)=2-△△CT方法分析數(shù)據(jù)。基因引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR引物Table 1 PCR primer

1.4.5 大鼠肝組織Western Blot檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)12周結(jié)束后提取大鼠肝組織總蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度，Western Blot測(cè)定肝組織ITGA4、ITGB1、α-SMA、TGFβ1、TIMP2、TIMP1蛋白水平，β-actin作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 各組ALT、AST水平比較 CCl4模型組中的ALT、AST水平與各組相比均顯著升高；秋水仙堿或SSAA干預(yù)后能顯著降低ALT、AST水平，以SSAA高劑量組降低轉(zhuǎn)氨酶效果最顯著(P值均<0.05)(表2)。

表2 各組ALT、AST水平Table 2 Transaminase levels in each group

2.2 各組HE染色結(jié)果 空白對(duì)照組和SSAA組HE染色結(jié)果顯示有相對(duì)完整的肝組織結(jié)構(gòu)及正常的肝細(xì)胞形態(tài)，肝細(xì)胞索從中央靜脈呈放射狀排列，而CCl4模型組中大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、肝細(xì)胞水腫變性和肝小葉結(jié)構(gòu)破壞，秋水仙堿或SSAA低、中、高劑量干預(yù)后肝小葉結(jié)構(gòu)較CCl4模型組改善，少見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及肝細(xì)胞水腫，并且SSAA高劑量組對(duì)抑制肝細(xì)胞炎癥和保護(hù)肝小葉結(jié)構(gòu)效果最顯著(圖1)。

圖1 各組HE染色結(jié)果(×200)

2.3 各組天狼猩紅染色結(jié)果 空白對(duì)照組和SSAA組的天狼猩紅染色結(jié)果顯示未見(jiàn)明顯膠原沉積，CCl4模型組中肝細(xì)胞水腫變性、大量膠原沉積導(dǎo)致肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，秋水仙堿或SSAA低、中、高劑量干預(yù)后膠原沉積較CCl4模型組減少，以SSAA高劑量組抑制膠原生成的效果最顯著(圖2)。

2.4 各組肝纖維化相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄水平比較 CCl4模型組中的ITGA4、TGFβ1、α-SMA、TIMP2轉(zhuǎn)錄水平均顯著高于其他組(P值均<0.05)，秋水仙堿或SSAA干預(yù)后能降低各因子轉(zhuǎn)錄水平。在ITGA4、ITGB1、TGFβ1和TIMP2轉(zhuǎn)錄中，SSAA低劑量組抑制效果最顯著；在α-SMA轉(zhuǎn)錄中，SSAA高劑量組抑制效果最顯著，但各因子轉(zhuǎn)錄水平在SSAA低、中、高劑量組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(圖3)。

2.5 各組中肝纖維化相關(guān)因子蛋白表達(dá)結(jié)果 CCl4模型組中的ITGA4、TGFβ1、α-SMA、TIMP1和TIMP2蛋白表達(dá)高于其他組，MMP2蛋白表達(dá)低于其他組，在秋水仙堿或SSAA干預(yù)后均能抑制ITGA4、TGFβ1、α-SMA、TIMP1、TIMP2表達(dá)，促進(jìn)MMP2表達(dá)，且以SSAA高劑量組效果最明顯；而在ITGB1的蛋白表達(dá)中，各組未見(jiàn)明顯表達(dá)差異(圖4)。

2.6 各組中TGFβ1、α-SMA的免疫組化結(jié)果 CCl4模型組的TGFβ1、α-SMA的表達(dá)顯著高于其他組。秋水仙堿或SSAA干預(yù)后均能抑制表達(dá)，且以高劑量SSAA組改善效果最明顯(圖5、6)。

圖2 各組天狼猩紅染色結(jié)果(×200)Figure 2 Sirius red staining in each group(×200)

注：與空白對(duì)照組相比，#P<0.05；與SSAA組相比，△P<0.05；與CCl4模型組相比，＊P<0.05。

圖4 各組相關(guān)因子的蛋白表達(dá)情況

圖5 各組中TGFβ1的免疫組化結(jié)果(×200)

圖6 各組中α-SMA的免疫組化結(jié)果(×200)

3 討論

細(xì)胞遷移對(duì)發(fā)育、傷口愈合和免疫反應(yīng)等都是必不可少的過(guò)程。當(dāng)肝細(xì)胞暴露于損傷應(yīng)激時(shí)，會(huì)啟動(dòng)病原相關(guān)分子模式和損傷相關(guān)分子模式，觸發(fā)一系列的炎癥反應(yīng)通路，釋放細(xì)胞因子、趨化因子入血，募集循環(huán)中的單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞遷移至肝臟[8]。此外，肝內(nèi)肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞、膽管上皮細(xì)胞等產(chǎn)生大量的TGFβ1和分泌其他的炎癥介質(zhì)，促進(jìn)Kupffer細(xì)胞調(diào)節(jié)HSC轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞，獲得收縮、促炎和纖維化特性[9]?；罨腍SC表達(dá)α-SMA，產(chǎn)生過(guò)量ECM[10]。HSC分泌的ECM(主要是膠原蛋白)積累會(huì)扭曲正常的肝臟結(jié)構(gòu)并形成纖維疤痕，隨著膠原沉積的增加，再生的肝細(xì)胞形成結(jié)節(jié)會(huì)進(jìn)一步導(dǎo)致肝硬化。膠原蛋白主要受MMP和TIMP組成的MMP/TIMP系統(tǒng)調(diào)節(jié)。整合素是一組細(xì)胞表面受體，在外介導(dǎo)細(xì)胞與ECM的結(jié)合，在內(nèi)介導(dǎo)信號(hào)通路來(lái)啟動(dòng)或抑制細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。整合素也可促進(jìn)TGFβ1活化，促進(jìn)組織纖維化的發(fā)生，包括皮膚瘢痕形成、肝臟纖維化、腎臟纖維化、軟骨纖維化、心肌纖維化、肺纖維等[11-14]。

本研究以CCl4誘導(dǎo)大鼠肝纖維化造模，給藥12周后HE染色見(jiàn)肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂、喪失，炎細(xì)胞浸潤(rùn)，肝細(xì)胞水腫、變性、壞死；天藍(lán)猩紅染色示膠原蛋白增多，造模成功。秋水仙堿或SSAA藥物干預(yù)后能降低肝臟的轉(zhuǎn)氨酶，抑制肝臟炎癥，減少膠原蛋白的生成，顯著改善肝小葉結(jié)構(gòu)，證明秋水仙堿或SSAA具有抗肝纖維化及保護(hù)肝細(xì)胞的作用，其中以高劑量(120 mg/kg)的SSAA組效果最明顯。雖然實(shí)驗(yàn)證明秋水仙堿有一定的抗肝纖維化作用，但其副作用大，基本不用于臨床治療，只作為實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)在肝纖維化的相關(guān)細(xì)胞因子檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)，與CCl4模型組相比，SSAA干預(yù)后能抑制TGFβ1、α-SMA表達(dá)，調(diào)節(jié)MMP/TIMP系統(tǒng)，減少細(xì)胞基質(zhì)生成，重要的是ITGA4在不同程度的肝纖維化中差異性表達(dá)，有顯著的差異趨勢(shì)，與促肝纖維化的相關(guān)因子TGFβ1、α-SMA的表達(dá)升高一致，明確了ITGA4參了肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展。

整合素是由18個(gè)α亞基和8個(gè)β亞基非共價(jià)結(jié)合成24種不同的異質(zhì)二聚體，在組織中的表達(dá)具有特異性，是一種重要的黏附受體。每個(gè)整合素異二聚體由一個(gè)大的胞外域，一個(gè)跨膜域和一個(gè)短的胞質(zhì)尾構(gòu)成，胞外區(qū)為氨基末端，胞內(nèi)區(qū)為羧基末端。整合素在動(dòng)、植物細(xì)胞中廣泛表達(dá)，受到刺激時(shí)會(huì)發(fā)生構(gòu)象改變，并增加與配體的親和力。細(xì)胞接頭蛋白識(shí)別整合素上短的氨基酸序列，感知ECM后誘導(dǎo)自身構(gòu)象變化，增加對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)配體的親和力，將信號(hào)從ECM傳遞到細(xì)胞內(nèi)部，同時(shí)胞內(nèi)與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架結(jié)合，招募更多的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，啟動(dòng)各種下游信號(hào)通路[15]。整合素是細(xì)胞對(duì)ECM環(huán)境反應(yīng)的重要介質(zhì)，能夠?qū)植拷M織成分變化作出快速反應(yīng)。

ITGA4亞基是整合素家族中研究最少的整合素之一，在細(xì)胞遷移方面?zhèn)涫荜P(guān)注，以往的研究重點(diǎn)是介導(dǎo)炎癥性疾病中的T淋巴細(xì)胞的遷移。人源化的抗ITGA4的單克隆抗體——那他珠單抗已被證明可以減少炎癥性疾病中T淋巴細(xì)胞的遷移，臨床上多用于治療多發(fā)性硬化癥和克羅恩病，但在抗肝纖維化機(jī)制研究中的作用知之甚少。與前面討論的經(jīng)典整合素不同，ITGA4不需要接頭蛋白將整合素連接到細(xì)胞骨架，可直接與黏附蛋白特異性結(jié)合觸發(fā)黏著斑激酶磷酸化，從而促進(jìn)遷移[16]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)[17]已表明，在藥理上抑制ITGA4可防止白細(xì)胞在炎癥部位聚集。ITGA4主要與整合素β1、β7亞基結(jié)合，主要配體是炎癥中的小靜脈內(nèi)皮上被誘導(dǎo)的血管細(xì)胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-1, VCAM-1)、黏膜地址素細(xì)胞黏附分子-1(mucosal adhesion-cell adhesion molecule-1, MAdCAM-1)和纖粘連蛋白，但都不是同時(shí)結(jié)合。VCAM-1介導(dǎo)細(xì)胞遷移于外周組織，MAdCAM-1介導(dǎo)細(xì)胞遷移于腸道組織[18]。研究[19]報(bào)道，阻斷α4β7減少了α4β7+CD4 T淋巴細(xì)胞的腸道和肝臟募集，顯著減少了小鼠的黏膜炎癥、肝臟炎癥和纖維化，而且改善了非酒精性脂肪性肝炎相關(guān)的代謝紊亂。

在本實(shí)驗(yàn)中未發(fā)現(xiàn)ITGB1蛋白表達(dá)在肝纖維化中有顯著差異，后期仍需進(jìn)一步明確ITGB1、ITGB7是否參與肝纖維化的發(fā)生及進(jìn)行更深入的機(jī)制研究。綜上所述，本研究明確了ITGA4參與了肝纖維化的發(fā)生，不管是在肝臟炎癥反應(yīng)還是免疫機(jī)制的作用上，這是一個(gè)新的抗肝纖維化機(jī)制突破口。

倫理學(xué)聲明：本研究方案于2021年2月26日由昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批通過(guò)，批號(hào)：2021-206，符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：魯杰負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫論文；周義霞、高雅、陳科璇參與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)；李頂春、劉葉、陳一暉擬定寫作思路；劉懷鄂、王宏圖修改論文；李武指導(dǎo)撰寫論文并最后定稿。