利用煙草廢棄物制作生物農(nóng)藥的探究

潘昌濱 劉青鋒 安登龍 郭敏杰

(茅臺學(xué)院，貴州 仁懷 564500)

我國是煙草第1大種植國和消費國，近5a煙草的年產(chǎn)量達230萬t[1]，煙草種植及其產(chǎn)品加工在國民經(jīng)濟發(fā)展中發(fā)揮重要的作用[2]。據(jù)欒倩倩[3]研究，煙草加工產(chǎn)生的廢棄物約占煙草產(chǎn)量18%～25%，每年產(chǎn)生的煙草廢棄物在41.4萬t以上，并且大部分廢棄物未得到有效利用[4]。

煙草(Nicotiana tabacum L.)是茄科煙草屬植物[5]，一年生或有限多年生草本，全體被腺毛，根粗壯，莖稈高0.7～2m且直立，基部稍木質(zhì)化，煙草制品除了吸食外，還有很多潛在價值。目前煙草已經(jīng)鑒定出的化合物高達3000多種，其中葉綠素、蛋白質(zhì)、淀粉、煙堿、茄尼醇及香料等成分含量較高，具有很高的應(yīng)用價值[6]。

煙稈及其廢棄物中含有煙堿、茄尼醇、果膠、蛋白質(zhì)、氨基酸、有機酸和糖類等重要化合物，其中煙堿、茄尼醇等物質(zhì)是其所特有的組分并且含量很高[7]，一定劑量的煙堿可預(yù)防老年癡呆癥、帕金森氏綜合癥和藥物性胃潰瘍的生成[8]，茄尼醇是合成治療心血管疾病、抗癌、抗?jié)兊刃滦退幬锏闹虚g體，如輔酶Q10和維生素K2等[9]藥物合成的中間體，本身具有抗菌、消炎、止血的作用[10]。目前煙草種植管理技術(shù)以及生產(chǎn)經(jīng)營方式較為粗放，在采摘煙葉后，大部分的煙稈被丟棄或焚燒，不僅造成煙草秸稈資源浪費[11]，而且會影響生態(tài)環(huán)境[12]。因此，探究煙草廢棄物制作生物農(nóng)藥，為煙草廢棄物資源化利用做鋪墊。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

煙草春季種植，秋天采摘，煙草廢棄物產(chǎn)生于采摘過程中的殘次煙葉、采摘結(jié)束后的廢棄秸稈以及烘烤產(chǎn)生的煙葉邊角料，試驗用的煙草廢棄物是烘烤殘次煙葉和煙草秸稈,2021年9月取于貴州省貞豐縣。利用EM菌種、紅糖、水和煙草廢棄物(煙稈、煙葉)混勻厭氧發(fā)酵3個月制成生物農(nóng)藥[13]，其中水、紅糖與煙稈、煙葉(干重計)的比例為5∶1.2∶1。

紅薯葉于7月初采集于貴州省仁懷市某紅薯地，剪碎的紅薯葉經(jīng)揉搓后按重量1∶1與水混勻，用兩層紗布過濾的濾液放在燒杯中備用。生物碳粉是醬香型酒糟經(jīng)過高溫?zé)峤庵瞥珊螅霉腆w粉碎機(常州億通分析儀器制造有限公司，型號XA-1)粉碎并經(jīng)過100目篩制成。農(nóng)藥指的是高效氯氟氰菊酯類，其有效成分及含量是高效氯氟氰菊酯類5%、水乳劑、中等毒。

紅糖購買于廣西馬山南華糖業(yè)有限公司，EM菌種購買于河南南華千牧生物科技有限公司，黏蟲(Mythimna separata Walker)、豌豆蚜蟲(Acyrthosiphon pisum)均采集于貴州省仁懷市高粱地。

1.2 試驗方法

1.2.1 煙堿含量檢測方法

在《煙草及煙草制品總植物堿的測定 光度法》(GB/T 23225-2008)標(biāo)準(zhǔn)基礎(chǔ)上，參考錢建瑞等[14]、儲志兵等[15]研究，利用標(biāo)準(zhǔn)品(煙堿濃度1.08mg·mL-1)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，煙葉經(jīng)前處理得到待測樣品，利用安捷倫1260高效液相色譜儀檢測煙堿含量。

1.2.2 黏蟲試驗(時間2h)

第1階段分為6個組(煙葉液、煙稈液、紅薯葉、農(nóng)藥、碳粉、空白組)，每組選用45只相近的黏蟲幼蟲，每隔15min左右噴灑1次藥劑，觀察并記錄黏蟲的行為及死亡情況；第2節(jié)階段分為5個組(100%煙葉液、50%煙葉液、25%煙葉液、10%煙葉液、農(nóng)藥)，每組投放30只相近的黏蟲幼蟲，每隔約15min噴灑1次藥劑，觀察并記錄黏蟲的行為及死亡情況。

1.2.3 蚜蟲試驗(時間4h)

數(shù)30只大小相近的豌豆蚜蟲分別放在4個培養(yǎng)皿(1個對照組、3個煙葉組)中，用100mL的0%、25%、50%和100%發(fā)酵液比例倒入噴壺中，向培養(yǎng)皿的蚜蟲噴灑2次后蓋上蓋子觀察半數(shù)死亡時間和全部死亡時間，試驗時間是4h。

1.3 數(shù)據(jù)分析

參考絕對致死劑量(Absolute lethal dose，LD100)、半數(shù)致死劑量(Median lethal dose，LD50)的定義[16]，試蟲致死數(shù)指在一定時間內(nèi)使用某藥劑使試蟲死亡的數(shù)量，當(dāng)試蟲致死數(shù)量占到總數(shù)1/2的時間稱為半數(shù)死亡時間，全部試蟲死亡的時間稱為全數(shù)死亡時間。該試驗的農(nóng)藥(高效氯氟氰菊酯類)和煙堿[17]是神經(jīng)性毒物，有試蟲暈死一段時間后再恢復(fù)爬行的現(xiàn)象，這里把暈死定義為試蟲出現(xiàn)不動且會恢復(fù)爬動或死亡的現(xiàn)象，死亡指試蟲超過15min不動即認為死亡。

煙草廢棄物生物農(nóng)藥試驗的指標(biāo)有煙堿濃度、致死數(shù)、有半數(shù)死亡時間和全數(shù)死亡時間，試驗數(shù)據(jù)的記錄和分析采用Excel 2013，結(jié)果以“平均值(M)±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 廢棄煙葉的煙堿含量

煙草廢棄物的煙稈干燥物的硬度太大，無法使用固體粉碎機(型號XA-1)粉碎，在本研究中沒有檢測其煙堿含量。煙草烘烤后的廢棄煙葉煙堿含量在1.98%～2.06%，結(jié)果是(2.01±0.03)%，與劉項[18]的研究成果相近。假設(shè)廢葉的煙堿全部溶解在液體中，則100%、50%、25%和10%試驗組的煙堿濃度是2.79mg·mL-1、1.39mg·mL-1、0.70mg·mL-1、0.28mg·mL-1。

表1 廢棄煙葉樣品中煙堿的含量

表2 不同煙葉液濃度對蚜蟲的毒性試驗

2.2 不同藥劑對黏蟲毒性作用

在煙葉液、煙稈液、紅薯葉液、農(nóng)藥和碳粉液等不同藥劑試驗中，對照組不噴灑任何液劑，見表3。第1次噴灑后，噴煙葉液和碳粉液的黏蟲立即出現(xiàn)逃避現(xiàn)象，煙稈液和紅薯葉液的黏蟲在噴灑2min后開始逃避，農(nóng)藥組的逃避現(xiàn)象不明顯。最早出現(xiàn)死亡的是煙葉組(14∶32，10只)，其次農(nóng)藥組在14∶37死亡1只、14∶40死亡2只，煙稈液組在15∶10死亡2只，其他組無死亡現(xiàn)象。煙葉液組的半數(shù)死亡時間出現(xiàn)在15∶36—15∶50、全數(shù)死亡時間是16∶22，其次是農(nóng)藥組死亡6只、煙稈組死亡2只，其他組無死亡現(xiàn)象。試驗期間，對照組黏蟲始終正常如初，碳粉液組始終逃避，紅薯葉液組后期少數(shù)不動外其他一直逃避，煙稈液組后期有部分黏蟲與農(nóng)藥組相似。此外，試驗發(fā)現(xiàn)有的黏蟲在死亡后一段時間出現(xiàn)恢復(fù)爬動的現(xiàn)象，主要與煙草廢棄物的煙堿及農(nóng)藥的氯氟氰菊酯類都是神經(jīng)性毒素有關(guān)。因此，不同藥劑對黏蟲幼蟲的毒性作用效果從強到弱為煙葉液﹥農(nóng)藥﹥煙稈液﹥碳粉液﹥紅薯葉液。

2.3 不同濃度煙葉液對黏蟲的毒性作用

前面研究發(fā)現(xiàn)煙葉液對黏蟲的毒性作用效果最好，為了進一步探究不同濃度煙葉液的殺蟲效果，設(shè)計100%煙葉液(原液)、50%煙葉液、25%煙葉液、10%煙葉和對照組(農(nóng)藥)對黏蟲幼蟲的作用效果，見表4。第1次噴藥劑后，100%煙葉液組逃避最強烈、50%組和對照組相近、25%組較強烈、10%組不明顯。100%煙葉組在14∶19死亡1只，對照組在14∶21暈死1只但在4min后恢復(fù)爬動，25%組在15∶04死亡2只，其他組無死亡。同濃度煙葉液組隨給藥次數(shù)增加，黏蟲的逃避行為先增強后減弱；黏蟲的逃避行為強度隨著煙葉液濃度降低而下降，并且濃度越低與農(nóng)藥組的暈死態(tài)越相似。煙葉液在15∶45時添加碳粉，但對黏蟲幾乎無影響。總之，不同濃度藥劑的毒性試驗從強到弱為100%煙葉液﹥25%煙葉液﹥農(nóng)藥﹥50%煙葉液﹥10%煙葉液。

表4 不同濃度煙葉液對黏蟲的毒性作用

2.4 不同濃度煙葉液對蚜蟲的毒性作用

不同煙葉液濃度對蚜蟲的半數(shù)死亡時間、全數(shù)死亡時間不同，見表2。其中,25%的半數(shù)死亡率時間是60min，50%和100%的半數(shù)死亡率時間都是50min。在240min內(nèi)只有100%組全部死亡，50%組死亡率是96.67%、25%組死亡率是93.33%、對照組死亡率是3.33%，說明煙葉液濃度越高對蚜蟲的毒害作用越強。

3 討論與結(jié)論

本研究參考了LD50、LD100[16]和KT50[19]，定義半數(shù)死亡時間和全數(shù)死亡時間。盡管試驗內(nèi)容有不同藥劑濃度，但試驗時間只有2h或4h，因此有異于LD50、LD100的試驗設(shè)計，將來可進一步進行煙草廢棄物的LD50、LD100和KT50研究。

試驗觀察用到死亡、恢復(fù)和暈死的狀態(tài)記錄，是由于農(nóng)藥(高效氯氟氰菊酯類)及煙堿[17]都是神經(jīng)類毒物，使試蟲的暈死和死亡狀態(tài)難以真實區(qū)分，因此在記錄過程中常有暈死和死亡交叉記錄的情況。

煙草廢棄物的煙堿含量只檢測了煙葉中煙堿含量是由于煙稈在干燥后硬度極高，實驗室的破碎設(shè)備無法破碎，所以在本試驗中沒有檢測，建議將來補充煙葉、煙稈中煙堿含量的檢測。表3中煙稈液的殺蟲效果比煙葉液差，可能與煙稈的煙堿含量[20]低于煙葉煙堿含量有關(guān)。

表4中100%煙葉液組比表3的煙葉液的毒殺效果差，可能與表4的試蟲日齡大于表3的蟲齡，導(dǎo)致試蟲抗藥性增加有關(guān)。此外，表3給藥方式是噴灑，而表4是蘸刷，表4給藥效果比表3的差，因此給藥對試藥效果也有影響。在表4中，25%煙葉濃度對黏蟲的毒性作用強于50%可能與毛筆蘸刷不均勻有關(guān)。

紅薯葉液組后期有少數(shù)黏蟲不爬動，可能與前期一直逃避過度消耗能量有關(guān)，也可能是紅薯葉里某些成分開始起作用。黏蟲遇到紅薯葉會逃避的真實原因尚需進一步研究，將來可嘗試高粱與紅薯套種防治黏蟲的效果以推進酒用高粱的生物防治。

試驗中蚜蟲全數(shù)死亡時間是黏蟲的2倍，可能與給藥形式不同有關(guān)，蚜蟲只給藥1次(噴2下)而黏蟲給藥7次(噴2下/次)，黏蟲的給藥劑量遠大于蚜蟲；此外可能與試驗氣候有關(guān)，蚜蟲試驗在陰冷潮濕的3月，黏蟲試驗在炎熱干燥的7月。

農(nóng)藥(氯氟氰菊酯類)是常用的廣譜性高效殺蟲劑，由于對蚜蟲和黏蟲等效果較好，近年來得到廣泛應(yīng)用[21]，但是其在植物[22]、動物[23]有殘留，影響人類健康安全和生態(tài)環(huán)境安全。本研究初步證明,利用煙草廢棄物(煙葉液、煙稈液)防治豌豆蚜蟲、黏蟲有效果，將進一步研究煙草廢棄物防治酒用高粱等作物害蟲的半數(shù)擊倒時間(KT50)、致死濃度和給藥方式等，以早日實現(xiàn)生產(chǎn)應(yīng)用。

試驗結(jié)果表明，煙草廢棄物中煙葉的煙堿含量是(2.01±0.03)%；不同藥劑對黏蟲幼蟲的毒性作用效果從強到弱為煙葉液﹥農(nóng)藥﹥煙稈液﹥碳粉液﹥紅薯葉液，其中煙葉液的全數(shù)死亡時間是112min；不同濃度藥劑的毒性試驗從強到弱為100%煙葉液﹥25%煙葉液﹥農(nóng)藥﹥50%煙葉液﹥10%煙葉液；煙葉液對豌豆蚜蟲的防治效果與其濃度呈正比，其100%組的全數(shù)死亡時間是240min、半數(shù)死亡時間是50min。因此，初步證明利用煙草廢棄物(煙葉、煙桿)制作生物農(nóng)藥是可行的。