益康膠囊微生物限度檢查方法適用性研究

微生物限度檢查是保障藥品使用安全有效的一項重要參數(shù)

，《中華人民共和國藥典》（簡稱《中國藥典》）2020年版四部

明確提出對供試品進(jìn)行微生物限度檢查時所選方法應(yīng)進(jìn)行適用性試驗，從而避免方法缺陷造成的漏檢、誤判

。中藥制劑由于組方藥味成分及其相互作用機(jī)理復(fù)雜， 很多制劑有抑菌作用，進(jìn)行方法適用性試驗對保證檢測方法的科學(xué)性和嚴(yán)謹(jǐn)性尤為重要

。益康膠囊是由人參、黃芪、丹參等十三味藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有調(diào)節(jié)全身代謝，扶正固本等功效，臨床上用于治療冠心病、高脂血癥等

。據(jù)報道，處方中的黃芪、黃精、丹參等藥味均具有一定的抑菌活性

。為保證檢驗結(jié)果真實反映樣品中微生物實際污染程度，筆者按照《中國藥典》

2020年版四部通則1105，1106，1107 要求， 采用3 批樣品進(jìn)行3 次獨立試驗開展方法適用性研究，以期建立益康膠囊的微生物限度檢查方法。

根據(jù)研究目的的需要，選擇了局部空間自相關(guān)的方法，對福州市區(qū)域經(jīng)濟(jì)差異進(jìn)一步分析。局部自相關(guān)作為空間自相關(guān)的一種，是反映每個區(qū)域與周邊地區(qū)之間同一屬性值的相似性，用來驗證局部區(qū)域存在的空間異質(zhì)性。通常用空間聯(lián)系的局域指標(biāo)(LISA)和Moran散點圖等進(jìn)行度量[6]。

1 儀器與材料

1.1 儀器設(shè)備

JE1201 電子天平（上海浦春計量儀器有限公司）；MLS-3781L-PC 型高壓蒸汽滅菌器（松下健康醫(yī)療器械株式會社）；BPH-9272 精密恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）；DNP-9162BS-Ⅱ電熱恒溫培養(yǎng)箱 （上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司）；BSC-1300ⅡA2 生物安全柜（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；WGZ-2XJ 型濁度計（上海昕瑞儀器儀表有限公司）。

[20]Indeed,in herculean preparation and glitzy execution,the summit was reminiscent of the Games six years ago,with schools,offices and factories closed to combat the smog,and a similarly spectacular fireworks display over Beijing’s Olympic Park.

1.2 培養(yǎng)基及試劑

胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基（tryptic soy agar，TSA），胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（trypsin soy broth，TSB），沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（sabouraud dextrose agar，SDA），沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基 （sabouraud dextrose broth，SDB），腸道菌增菌液體培養(yǎng)基，麥康凱液體培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，RV 沙門菌增菌液體培養(yǎng)基， 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基，均由北京陸橋技術(shù)股份有限公司提供。培養(yǎng)基經(jīng)過適用性檢查，符合《中國藥典》2020年版四部

規(guī)定。0.9%無菌氯化鈉溶液（氯化鈉，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；按藥典要求配制、滅菌）。

濕式誘捕器投放高度20、40、60 cm處理誘捕茶尺蠖成蟲總量分別為321、158和148頭，平均每臺為 80.25、39.50 和 37.00 頭，可見高度 20 cm 處理誘捕量最多，并與其他2個處理均達(dá)到顯著差異，高度40和60 cm處理誘捕效果相當(dāng)，因此，濕式誘捕器在茶園的最優(yōu)投放高度為20 cm。

1.3 菌種

供試品對照組：取“2.1”項下1∶10 供試液9.9 ml，加入TSB 0.1 ml，混勻，取其1 ml 注入直徑90 mm 的無菌平皿，平行制備2 個平皿。

1.4 供試品

按照《中國藥典》2020 版四部

對菌種的培養(yǎng)要求進(jìn)行菌液制備。將金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和黑曲霉制備成每1 毫升含菌落數(shù)為5000～10 000 cfu 的菌懸液， 用于微生物計數(shù)；將銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、乙型副傷寒沙門菌制備成每1 毫升不大于100 cfu 的菌懸液， 用于控制菌檢查。

2.5.1 陽性對照組 大腸埃希菌檢查取“2.1”項下1∶10供試液10 ml； 耐膽鹽革蘭陰性菌取1 ml，0.1 ml，0.01 ml 的預(yù)培養(yǎng)物（“2.1”項下1∶10 供試液23℃培養(yǎng)2 h），沙門菌取“1.4”項下供試品10 g；上述供試液分別加入“2.2”項下用于控制菌檢查的對應(yīng)菌液，接種至對應(yīng)的規(guī)定培養(yǎng)基，混勻，33℃培養(yǎng)24 h。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試液制備

取“1.4” 項下供試品10 g， 加入TSB 至100 ml，45℃水浴保溫振蕩15 min，制成1∶10 的供試液；取1∶10的供試液適量，加入TSB 依法制成1∶20、1∶50 供試液

。

2.2 試驗菌液制備

益康膠囊，陜西君碧莎制藥有限公司，規(guī)格：每粒裝0.4 g（含維生素E 33.3 mg），批號：20201121，20210612，20210918。

2.3 計算與結(jié)果判斷

按照《中國藥典》2020年版四部

規(guī)定。

2.4 計數(shù)方法適用性試驗

2.4.3 需氧菌總數(shù)[平皿傾注法（1∶20）]試驗組、供試品對照組和菌液對照組的制備：除將“2.4.1”項下1∶10 供試液更換為1∶20 供試液外， 其他操作步驟同“2.4.1”項下，試驗結(jié)果詳見表2。由表2 可見，采用平皿傾注法（1∶20）進(jìn)行需氧菌總數(shù)方法適用性試驗時，各試驗菌株回收比值均在0.5～2 范圍內(nèi)，表明該方法可行。

銅綠假單胞菌、白色念珠菌、黑曲霉、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、乙型副傷寒沙門菌、大腸埃希菌，以上菌種英文名稱及編號均與《中國藥典》2020年版四部

要求相符。均來源于廣東環(huán)凱微生物科技有限公司，經(jīng)復(fù)蘇傳代并鑒定合格，本次試驗所用菌種均為第4 代。

菌液對照組：取TSB 9.9 ml，按試驗組操作加入5種試驗菌液各0.1 ml（菌落數(shù)為5000～10 000 cfu/ml），進(jìn)行菌種回收試驗。

試驗結(jié)果：稀釋濃度為1∶20 時，枯草芽孢桿菌的回收比值分別為0.91、0.78、0.82； 稀釋濃度為1∶50時，其回收比值分別為0.90、0.84、0.79。由以上數(shù)據(jù)可知，兩個稀釋濃度回收比值較為接近，當(dāng)兩個稀釋濃度回收比值均符合要求時， 宜選取較低稀釋濃度，因此需氧菌總數(shù)計數(shù)可采用平皿傾注法（1∶20）。

以上各組平皿，按照《中國藥典》2020年版四部

要求注入15～20 ml 相對應(yīng)的SDA 或TSA，測定各平皿菌落數(shù)，計算各試驗菌回收比值，結(jié)果詳見表1。由表1 可知，需氧菌總數(shù)采用平皿傾注法（1∶10），枯草芽孢桿菌回收比值小于0.5， 霉菌和酵母菌總數(shù)各試驗菌回收比值均在0.5～2 范圍內(nèi)。表明益康膠囊對枯草芽孢桿菌有抑菌活性，其霉菌和酵母菌總數(shù)可采用平皿傾注法（1∶10）。

2.4.2 需氧菌總數(shù)（預(yù)試驗） 以枯草芽孢桿菌作為敏感菌株，采用平皿傾注法（1∶20，1∶50）對需氧菌總數(shù)重新開展試驗。取“2.1”項下1∶20，1∶50 供試液各9.9 ml，試驗菌液取“2.2”項下枯草芽孢桿菌菌懸液0.1 ml，使每1 ml 供試液含菌量不大于100 cfu，其余照“2.4.1”項進(jìn)行試驗。

學(xué)者錢鐘書也是個善于“偷”時間的人。他從來不參加應(yīng)酬，不論再高規(guī)格、再有面子的飯局，也照拒不誤，因為在他眼里，在飯桌上浪費時間，揮霍生命，是世上最愚蠢的事情。他把這些時間都偷來著書立說，鉆研學(xué)問，成了大學(xué)者。

2.4.1 需氧菌總數(shù)、 霉菌和酵母菌總數(shù)[平皿傾注法（1∶10）]試驗組：取“2.1”項下1∶10 供試液分裝于無菌試管中，每管9.9 ml，分別加入“2.2”項下用于微生物計數(shù)的5 種試驗菌液0.1 ml，混勻，取上述混合液各1 ml 注入直徑90 mm 的無菌平皿中， 每種試驗菌平行制備2 個平皿。

2.5 控制菌檢查方法適用性試驗

按照《中國藥典》2020年版四部

要求，益康膠囊控制菌檢查應(yīng)為大腸埃希菌、耐膽鹽革蘭陰性菌和沙門菌3 種。

冬季參加體育鍛煉，戶外活動最好選在廣場、樹林、草地、空氣清新潔凈的地方，便于機(jī)體在鍛煉時吸入更多新鮮空氣；避免在車輛、行人較多的道路旁和大霧天鍛煉，減少尾氣和煙塵對呼吸系統(tǒng)的影響；同時要注意選擇相對松軟的場地，避免場地堅硬對腳、腿、關(guān)節(jié)、骨骼的傷害。在室內(nèi)進(jìn)行鍛煉時，一定要保持室內(nèi)空氣的流通。因為，人在安靜狀態(tài)下每小時呼出的二氧化碳有20多升。若十多個人同時進(jìn)行鍛煉，一小時就是200升以上，再加上汗水的分解產(chǎn)物，消化道排除的不良?xì)怏w等，會致使室內(nèi)空氣受到嚴(yán)重污染。人在這樣的環(huán)境中會出現(xiàn)頭昏、疲勞、惡心、食欲不振等現(xiàn)象，鍛煉效果自然不佳。

2.5.2 供試品組 大腸埃希菌、 耐膽鹽革蘭陰性菌、沙門菌供試液同“2.5.1”項下，均不加試驗菌液，其他同相對應(yīng)的陽性對照組操作步驟分別制備供試品組。

2.5.3 陰性對照組 上述3 種控制菌檢查，均取稀釋劑代替供試液，其他同相對應(yīng)的供試品組，制備陰性對照組。

2.5.4 試驗結(jié)果 按照《中國藥典》2020年版四部

規(guī)定進(jìn)一步選擇和分離培養(yǎng)， 如果陽性對照組生長良好，表明益康膠囊對該菌無抑菌活性，方法成立；如果無菌落生長，表明樣品對該菌有抑菌活性，則需采用增加培養(yǎng)基體積等適宜的方法去除其抑菌活性后重復(fù)上述試驗，結(jié)果見表3。由表3 可見，陽性對照組均生長良好，供試品組和陰性對照組均無菌落生長，表明益康膠囊可以采用常規(guī)培養(yǎng)基體積進(jìn)行控制菌檢查。

本文分析由制造商主導(dǎo)的Stackelberg博弈的均衡解，制造商主導(dǎo)的Stackelberg博弈的分散決策順序如下：

3 討論

3.1 建立方法適用性試驗遵循的原則

方法適用性試驗的本質(zhì)是建立對樣品影響更小、操作效率更高的方法

，去除樣品抑菌性是其中的重點和難點

，設(shè)計試驗方案時應(yīng)遵循由簡到繁，由單一到聯(lián)合的原則，采取循序漸進(jìn)的方式逐步開展。本研究采用平皿傾注法（1∶10）進(jìn)行微生物計數(shù)時，霉菌和酵母菌總數(shù)各試驗菌株回收比值均在0.5～2 范圍內(nèi)； 需氧菌總數(shù)計數(shù)中枯草芽孢桿菌回收比值小于0.5，遂采用增加稀釋倍數(shù)重新進(jìn)行試驗，采用平皿傾注法（1∶20）時，需氧菌總數(shù)計數(shù)5 種試驗菌株回收比值均在0.5～2 范圍內(nèi)；進(jìn)行控制菌檢查時，采用常規(guī)培養(yǎng)基體積對益康膠囊進(jìn)行方法適用性試驗，結(jié)果陽性對照組均生長良好，陰性對照組均無菌落生長，表明該方法可靠有效。

3.2 耐膽鹽革蘭陰性菌檢查預(yù)培養(yǎng)

耐膽鹽革蘭陰性菌泛指能夠在結(jié)晶紫中性紅膽鹽培養(yǎng)基上生長的微生物， 例如腸桿菌科的細(xì)菌，產(chǎn)氣單胞菌屬和假單胞菌屬都屬于這一類

。該項檢查為了使供試品的受損細(xì)菌充分恢復(fù)但不增殖，需要對1∶10 供試液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)（約2 h）。此時，不能將試驗菌液加入1∶10 供試液進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)， 適宜的培養(yǎng)條件會導(dǎo)致試驗菌株的增殖，可能產(chǎn)生錯誤的試驗結(jié)果。

3.3 小結(jié)

通過方法適用性試驗，本研究建立了益康膠囊的微生物限度檢查方法： 需氧菌總數(shù)采用平皿傾注法（1∶20），霉菌和酵母菌總數(shù)采用平皿傾注法（1∶10）；控制菌檢查采用常規(guī)培養(yǎng)基體積。該方法有效可行，重現(xiàn)性好，可為藥品生產(chǎn)企業(yè)及相關(guān)檢驗機(jī)構(gòu)開展益康膠囊的微生物限度檢查工作提供參考。

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