藥用昆蟲凹紋胡蜂三氯甲烷部位化學(xué)成分研究

黃艷敏，龐秀琴，許靜蕾，唐宋元，李勇鍵，楊志斌，肖 懷*

（1.云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南大理 671000；2.藥用特種昆蟲開發(fā)國家地方聯(lián)合工程研究中心，云南大理 671000；3.中國西南藥用昆蟲及蛛形類資源開發(fā)利用2011協(xié)同創(chuàng)新中心，云南大理 671000；4.大理大學(xué)藥學(xué)院，云南大理 671000）

《神農(nóng)本草經(jīng)》最早記載了胡蜂類藥材，將其列為上品，主治嗌痛、干嘔、心腹脹滿痛，久服輕身益氣〔1〕。胡蜂亦作為傳統(tǒng)民族驗(yàn)方，用于預(yù)防和治療多種炎癥引起的疾病。如景頗族驗(yàn)方胡蜂酒已被《中華人民共和國藥典》所收錄〔2〕；彝族醫(yī)生習(xí)用胡蜂成蟲、蜂巢、分泌物入藥，用于祛風(fēng)除濕、消腫止痛、攻毒殺蟲〔3〕。胡蜂是一種益多害少的資源昆蟲，其成蟲、幼蟲、蜂巢及蜂毒可藥用、食用，還可用于生物防治〔4〕。近年來，越來越多的研究人員關(guān)注胡蜂的資源價(jià)值，對其蜂毒活性、營養(yǎng)成分、蛋白質(zhì)含量、重金屬、常微量元素、揮發(fā)性及脂溶性成分等進(jìn)行了研究〔5-10〕。胡蜂基源眾多，全國約200種，其中云南省分布154種〔11〕。開展系統(tǒng)深入的研究有利于胡蜂資源的可持續(xù)開發(fā)應(yīng)用。凹紋胡蜂Vespa aurariaSmith的干燥成蟲可入藥，其性味甘、平、有毒，具有消腫解毒等功效，主要用于治療風(fēng)濕痹痛、癰腫瘡毒、蜘蛛和蜈蚣咬傷等病癥〔3〕。目前，關(guān)于凹紋胡蜂化學(xué)成分的研究還很少。本研究從凹紋胡蜂的三氯甲烷提取部位中分離鑒定出11個(gè)化合物，分別為：環(huán)（丙氨酸-脯氨酸）（1）、環(huán)（脯氨酸-脯氨酸）（2）、環(huán)（脯氨酸-甘氨酸）（3）、環(huán)（脯氨酸-酪氨酸）（4）、環(huán)（蘇氨酸-脯氨酸）（5）、N-乙酰基異亮氨酸（6）、N-乙酰基-4-（4-羥基苯）乙胺（7）、煙酸（8）、1-甲基-1，2，3，4-四氫咔啉-3-羧酸（9）、3-吲哚乙酸（10）、（2R，3S）-2-（3'4'-dihydroxyphenyl）-3-acetylamino-7-（N-acetyl-2"-aminoethyl）-1，4-benzodioxane（11）。見圖1。

圖1 化合物1~11的化學(xué)結(jié)構(gòu)

1 儀器與材料

Bruker AVⅢ-400型核磁共振波譜儀（德國Bruker公司）；Waters 2535制備型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；Agilent 1260分析型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（德國Heidolph公司）；EYELA循環(huán)冷凝泵（日本東京理化器械株式會(huì)社）；Sephadex LH-20葡聚糖凝膠（美國GE Healthcare公司）；柱層析硅膠、薄層層析硅膠（青島海洋化工有限公司）；氘代試劑（上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；色譜用洗脫溶劑分別為經(jīng)過重蒸的工業(yè)純?nèi)軇┗蚧瘜W(xué)純?nèi)軇?；展開劑所用溶劑均為分析純，均購自天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司。

實(shí)驗(yàn)用凹紋胡蜂由云南省德宏傣族景頗族自治州芒市軒崗鄉(xiāng)胡蜂養(yǎng)殖基地提供，大理大學(xué)昆蟲生物醫(yī)藥研究院楊自忠教授鑒定為凹紋胡蜂Vespa aurariaSmith，標(biāo)本保存于云南省昆蟲生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

2 提取與分離

將32 kg凹紋胡蜂干燥成蟲碾碎，用95%乙醇冷浸提取4次，混合提取液，減壓濃縮至無醇味，加適量蒸餾水混懸后，用石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇依次萃取。將三氯甲烷萃取液減壓濃縮至干得到40 g浸膏，后將其進(jìn)行硅膠（200~300目）柱層析，用石油醚-三氯甲烷（1∶0→0∶1）和三氯甲烷-甲醇（1∶0→5∶1）梯度洗脫，薄層色譜法檢識，合并為8段（Fr.1~Fr.8）。Fr.3（14.3 g）經(jīng)反復(fù)硅膠（200~300目）柱層析，以石油醚-丙酮溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，得到9個(gè)組分Fr.3-1~Fr.3-9。Fr.3-9（0.8 g）通過半制備反相高效液相色譜（甲醇-水，5∶95→95∶5）梯度洗脫和Sephadex LH-20凝膠柱色譜（氯仿-甲醇，1∶1），得到化合物1（79.0 mg）、化合物2（30.5 mg）。Fr.4（6.4 g）經(jīng)反復(fù)硅膠（200~300目）柱層析，以三氯甲烷-乙酸乙酯（1∶1）為洗脫劑進(jìn)行等度洗脫，得到10個(gè)流分Fr.4-1~Fr.4-10。Fr.4-7（108.2 mg）采用半制備反相高效液相色譜，甲醇-水（5∶95→95∶5）梯度洗脫得到化合物7（13.4 mg）。Fr.4-8（114.2 mg）反復(fù)經(jīng)硅膠柱色譜（300~400目）、半制備高效液相色譜（甲醇-水，5∶95→95∶5）和Sephadex LH-20凝膠柱色譜（甲醇）得到化合物6（6.2 mg）和化合物10（4.3 mg）。Fr.4-10（116.3 mg）經(jīng)半制備反相高效液相色譜（甲醇-水，5∶95→95∶5），得到Fr.4-10-1~Fr.4-10-5。Fr.4-10-1（24.3 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（甲醇）反復(fù)等度洗脫得到化合物4（5.0 mg）、化合物5（4.5 mg）、化合物8（9.3 mg）。Fr.4-10-2（20.6 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（甲醇）等度洗脫得到化合物3（13.0 mg）。Fr.5（4.5g）經(jīng)硅膠（200~300目）柱層析，以乙酸乙酯-甲醇（25∶1→0∶1）為溶劑系統(tǒng)梯度洗脫，得到20個(gè)組分，F(xiàn)r.5-1～Fr.5-20。Fr.5-5（116.3 mg）經(jīng)Sephadex LH-20凝膠柱色譜（三氯甲烷-甲醇，1∶1）等度洗脫得到化合物11（22.1 mg）。Fr.6（1.85 g）采用半制備高效液相色譜（甲醇-水，5∶95→95∶5）梯度洗脫，得到化合物9（7.0 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色粉末（氯仿），分子式為C8H12N2O2。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：4.18-3.98（2H，m，Ala-H-2，Pro-H-2），3.64-3.42（2H，m，Pro-H-5），2.41-2.22（1H，m，Pro-H-3a），2.10-1.93（2H，m，Pro-H-4），1.91-1.81（1H，m，Pro-H-3b），1.42（3H，d，J=5.7 Hz，Ala-H-3）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：170.9（Pro-C-1），166.6（Ala-C-1），59.3（Pro-C-2），51.2（Ala-C-2），45.5（Pro-C-5），28.2（Pro-C-3），22.8（Pro-C-4），15.8（Ala-C-3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔12〕報(bào)道基本一致，化合物1鑒定為環(huán)（丙氨酸-脯氨酸）。

化合物2：黃色粉末（甲醇），分子式為C10H14N2O2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.35（1H×2，t，J=7.8 Hz，Pro-H-2，H-2'），3.62-3.41（2H×2，m，Pro-H-5，5'），2.39-2.21（2H×2，m，Pro-H-3，3'），2.14–1.86（2H×2，m，Pro-H-4，H-4'）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：168.6（Pro-C-1，C-1'），61.8（Pro-C-2，C-2'），46.3（Pro-C-5，C-5'），28.8（Pro-C-3，C-3'），24.3（Pro-C-4，C-4'）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔13〕報(bào)道基本一致，鑒定化合物2為環(huán)（脯氨酸-脯氨酸）。

化合物3：白色粉末（甲醇），分子式為C7H10N2O2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：4.23（1H，m，Pro-H-2），4.10（1H，brd，J=16.8，Gly-H-2a），3.73（1H，d，J=16.8 Hz，Gly-H-2b），3.53（2H，m，Pro-H-5），2.39-2.25（2H，m，Pro-H-3），1.95（2H，m，Pro-H-4）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：172.1（Pro-CO），166.5（Gly-CO），59.9（Pro-C-2），47.1（Pro-C-5），46.4（Gly-C-2），29.5（Pro-C-3），23.4（Pro-C-4）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔14〕報(bào)道基本一致，化合物3鑒定為環(huán)（脯氨酸-甘氨酸）。

化合物4：白色粉末（氯仿），分子式為C14H16N2O3。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.05（2H，d，J=8.4 Hz，Try-H-2'，6'），6.78（2H，d，J=8.4 Hz，Try-H-3'，5'），4.23（1H，dd，J=9.7，2.8 Hz，Try-H-2），4.09（1H，J=7.5 Hz，Pro-H-2），3.60（2H，m，Pro-H-5），3.46（1H，dd，J=14.5，3.9 Hz，Tyr-H-3a），2.78（1H，dd，J=14.5，9.9 Hz，Tyr-H-3b），2.33（1H，m，Pro-H-3a），2.01（1H，m，Pro-H-3b），1.92（2H，m，Pro-H-4）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：169.9（s，Pro-CO），165.4（Tyr-CO），155.8（Tyr-C-4'），130.5（Tyr-C-2'，6'），127.0（Tyr-C-1'），116.2（Tyr-C-3'，5'），59.3（Pro-C-2），56.4（Tyr-C-2），45.6（Pro-C-5），36.1（Tyr-C-3），28.5（Pro-C-3），22.6（Pro-C-4）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔15〕報(bào)道基本一致，化合物4鑒定為環(huán)（脯氨酸-酪氨酸）。

化合物5：黃色油狀液體（氯仿），分子式為C9H14N2O3。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：4.36（1H，dt，J=7.0，3.5 Hz，Thr-H-2），4.10（1H，m，Pro-H-2），3.71（1H，brs，Thr-OH），3.53（2H，m，Pro-H-5），2.35（1H，m，Pro-H-3a），2.10（1H，m，Pro-H-3b），2.03（1H，m，Pro-H-4a），1.91（1H，m，Pro-H-4b），1.34（3H，d，J=6.6 Hz，Thr-H-4）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：170.3（Thr-C-1），165.5（Pro-C-1），65.7（Thr-C-3），59.5（Pro-C-2），59.1（Thr-C-2），45.4（Pro-C-5），28.2（Pro-C-3），22.8（Pro-C-4），19.1（Thr-C-4）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔16〕報(bào)道基本一致，化合物5鑒定為環(huán)（蘇氨酸-脯氨酸）。

化合物6：白色粉末（甲醇），分子式為C8H15NO3。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：4.05（1H，d，J=5.8 Hz，H-2），1.86（3H，s，H-2′），1.79-1.67（1H，m，H-3），1.27（2H，ddd，J=12.1，7.3，4.5Hz，H-4），1.05（3H，dt，J=13.8，7.5 Hz，H-6），0.79-0.67（3H，m，H-5）；13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：176.1（C-1），174.1（C-1'），58.0（C-2），36.1（C-3），24.5（C-4），21.4（C-2'），14.8（C-6），10.6（C-5）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔17〕報(bào)道基本一致，化合物6鑒定為N-乙?；惲涟彼?。

化合物7：白色固體（甲醇），分子式為C10H13NO2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.02（2H，d，J=8.5 Hz，H-2，6），6.70（2H，d，J=8.5 Hz，H-3，5），3.35（2H，t，J=2.5 Hz，H-8），2.68（2H，t，J=7.4Hz，H-7），1.90（3H，s，H-2'）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：173.4（C-1'），157.1（C-4），131.4（C-1），130.9（C-2，6），116.4（C-3，5），42.6（C-8），35.8（C-7），22.7（C-2'）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔18〕報(bào)道基本一致，化合物7鑒定為N-乙?；?4-（4-羥基苯）乙胺。

化合物8：白色粉末（氯仿），分子式為C6H5NO2。1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：9.05（1H，s，H-2），8.77（1H，s，H-6），8.21（1H，s，H-4），7.44（1H，dd，J=7.9，4.9 Hz，H-5）；13C-NMR（100 MHz，CDCl3）δ：169.6（C-7），152.7（C-6），148.3（C-2），135.9（C-4），129.3（C-3），123.9（C-5）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔19〕報(bào)道基本一致，化合物8鑒定為煙酸。

化合物9：淡黃色粉末（甲醇），分子式為C13H14N2O2。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：7.42（1H，d，J=7.8 Hz，H-5），7.28（1H，d，J=8.1 Hz，H-8），7.07（1H，t，J=7.6 Hz，H-7），6.98（1H，t，J=7.5 Hz，H-6），4.13（1H，d，J=6.6 Hz，H-1），3.92（1H，dd，J=12.1，5.0 Hz，H-3），3.43-3.31（1H，m，H-4a），3.02-2.90（1H，m，H-4b），1.68（3H，d，J=6.7 Hz，H-10）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：138.8（C-8a），131.8（C-9a），127.5（C-4b），123.4（C-7），120.7（C-6），119.3（C-5），112.4（C-8），107.9（C-4a），59.7（C-3），51.2（C-1），24.4（C-4），17.2（C-10）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔20〕報(bào)道基本一致，化合物9鑒定為1-甲基-1，2，3，4-四氫咔啉-3-羧酸。

化合物10：白色粉末（甲醇），分子式為C10H9NO2。1H-NMR（400 MHz，D2O）δ：7.42（1H，d，J=7.9 Hz，H-8），7.32（1H，d，J=8.1 Hz，H-7），7.18（1H，d，J=6.2 Hz，H-2），7.14-7.03（1H，m，H-5），6.98（1H，t，J=7.4 Hz，H-6），3.56（2H，s，H-10）；13C-NMR（100 MHz，D2O）δ：178.3（-COOH），136.0（C-8），128.5（C-9），124.8（C-2），121.9（C-5），119.3（C-6），118.1（C-4），111.7（C-7），107.4（C-3），39.5（C-10）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔21〕報(bào)道基本一致，化合物10鑒定為3-吲哚乙酸。

化合物11：淡黃色粉末（甲醇），分子式為C20H22N2O6。1H-NMR（400 MHz，CD3OD）δ：6.85（1H，d，J=1.7 Hz，H-2'），6.82（1H，s，H-6），6.80（1H，d，J=2.0 Hz，H-5'），6.75（1H，s，H-8），6.74（1H，d，J=1.8Hz，H-5），6.72（1H，d，J=1.9 Hz，H-6'），5.68（1H，d，J=7.0，5.2 Hz，H-3），4.68（1H，d，J=7.0 Hz，H-2），3.29（2H，t，J=7.2 Hz，H-2''），2.64（2H，t，J=7.3 Hz，H-1''），1.91（3H，s，CH3），1.87（3H，s，CH3）；13C-NMR（100 MHz，CD3OD）δ：173.3（CO），173.2（CO），147.1（C-4'），146.4（C-3'），144.2（C-8a），142.1（C-4a），134.1（C-7），128.7（C-1'），123.2（C-6），120.5（C-6'），118.0（C-8），117.9（C-5），116.0（C-5'），115.5（C-2'），78.3（C-2），78.2（C-3），42.1（C-2''），35.7（C-1''），22.6（CH3），22.5（CH3）。以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)〔22〕報(bào)道基本一致，化合物11鑒定為（2R，3S）-2-（3'，4'-dihydroxyphenyl）-3-acetylamino-7-（N-acetyl-2''-aminoethyl）-1，4-benzodioxane。

4 討論

本研究對凹紋胡蜂的化學(xué)成分進(jìn)行研究，從三氯甲烷部位分離鑒定出11個(gè)化合物，均為首次從該藥用昆蟲中分離得到，其中包括5個(gè)環(huán)二肽類化合物（1~5）。環(huán)二肽是由兩個(gè)氨基酸通過脫水縮合形成肽鍵環(huán)合而成，是一種重要的生物活性分子，其骨架是比較穩(wěn)定的六元含氮雜環(huán)，含兩個(gè)氫鍵受體、兩個(gè)氫鍵供體〔23〕。許多環(huán)二肽具有抗菌、抗癌、鎮(zhèn)痛、抗感染、抑制毒素生成等生物活性〔24〕。化合物11屬于多巴胺類二聚體，在該昆蟲提取物較大極性的乙酸乙酯萃取部位也分離到了多個(gè)類似成分。此類化合物普遍存在于昆蟲體內(nèi)，種類較多，部分化合物含量也比較高，其生物活性、種間差異等有待進(jìn)行深入研究探討。