pH偏移誘導(dǎo)對(duì)大豆親脂蛋白納米顆粒及其解離締合行為的影響

李次力，高遠(yuǎn)，曾劍華，孫冰玉，黃雨洋，朱秀清

(哈爾濱商業(yè)大學(xué) 食品工程學(xué)院，黑龍江省普通高校食品科學(xué)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 黑龍江省谷物食品與綜合加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱，150028)

大豆親脂蛋白(soybean lipophilic protein，SLP)是大豆球蛋白(11S)和伴大豆球蛋白(7S)在蛋白分離或加工過(guò)程中發(fā)生蛋白和磷脂結(jié)合形成的親脂蛋白復(fù)合物，占儲(chǔ)存蛋白的30%左右，作為大豆蛋白的一種新組分，自2007年提出以來(lái)，大豆親脂性蛋白一直備受關(guān)注[1]。

目前，大豆親脂性蛋白主要圍繞其良好的表面活性，如乳化性和起泡性等展開(kāi)研究，與11S和7S球蛋白相比，添加0.000 1%的SLP能使界面張力降低10 mN/m，且SLP乳液在高鹽高濃度條件下表現(xiàn)出一定的熱穩(wěn)定性[2]。WANG等[3]研究認(rèn)為SLP納米乳液是一種有前景的遞送體系，能在低鹽離子濃度下最大限度地提高遞送效率，如LI等[4]通過(guò)大豆親脂蛋白-甲基纖維素復(fù)合物封裝親水性維生素B12建立水包油包水(W/O/W)體系，使其在存儲(chǔ)期間能起到包埋營(yíng)養(yǎng)素，而在消化過(guò)程起到緩釋作用；ZHONG等[5]也發(fā)現(xiàn)SLP納米顆粒是白藜蘆醇良好載體，在十二烷基硫酸鈉作用下SLP解離締合封裝的白藜蘆醇納米顆粒具有良好的抗氧化性和可消化性；本研究團(tuán)隊(duì)前期也發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲誘導(dǎo)SLP自組裝封裝姜黃素形成的納米顆粒具有良好的抗氧化性[6]。然而因?yàn)镾LP磷脂含量高、表面疏水性強(qiáng)以及自身緊湊的結(jié)構(gòu)溶解度大大降低，限制了乳化性等其他功能特性的發(fā)揮，進(jìn)而制約SLP的開(kāi)發(fā)應(yīng)用。

自組裝是基礎(chǔ)粒子由無(wú)序到有序轉(zhuǎn)變的過(guò)程，是一種制備具有吸引特性新粒子的“自下而上”的一種新技術(shù)[7-8]。研究顯示蛋白可以在不同pH-偏移誘導(dǎo)條件下形成具有不同結(jié)構(gòu)性質(zhì)的聚集物，且具有雙親性的蛋白在等電點(diǎn)附近通過(guò)自組裝可以形成具有特殊功能性質(zhì)的球形聚集物，如菠蘿蛋白酶在其等電點(diǎn)附近誘導(dǎo)能形成具有特殊功能的熔球態(tài)結(jié)構(gòu)蛋白[9]；β-乳球蛋白在等電點(diǎn)附近(pI 4.6～5.8)自組裝形成以球形聚集體為主體的穩(wěn)定微凝膠[10]，這有助于其在食品領(lǐng)域中的應(yīng)用，因此如何穩(wěn)定形成的球形顆粒則是當(dāng)前研究重點(diǎn)關(guān)注的問(wèn)題。前期，本研究團(tuán)隊(duì)研究了熱誘導(dǎo)條件下SLP解離締合行為，發(fā)現(xiàn)在90 ℃條件下SLP能形成均一穩(wěn)定的納米體系[11]。然而，目前關(guān)于pH偏移誘導(dǎo)SLP解離締合行為及自組裝納米顆粒表征的研究鮮有報(bào)道。

本研究以SLP為研究對(duì)象，通過(guò)不同pH偏移誘導(dǎo)SLP自組裝形成納米顆粒，利用傅里葉紅外光譜(Fourier infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR)、紫外光譜(ultraviolet spectroscopy，UV)、熒光光譜(fluorescence spectroscopy，F(xiàn)S)和圓二色譜(circular dichroism，CD)表征不同pH偏移誘導(dǎo)解離締合對(duì)SLP結(jié)構(gòu)的影響；采用差示掃描量熱分析(differential scanning calorimetry，DSC)表征不同pH體系誘導(dǎo)對(duì)SLP結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的影響；通過(guò)柔性和乳化性評(píng)估不同pH偏移誘導(dǎo)解離締合行為對(duì)SLP功能性的影響；以期為SLP在食品領(lǐng)域進(jìn)一步開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大豆親脂蛋白，自制；一級(jí)大豆色拉油，九三糧油工業(yè)集團(tuán)有限公司。聚丙烯酰胺凝膠電泳套裝、溴化鉀(光譜純)，北京索萊寶生物科技有限公司；其余試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

J-815圓二色譜，英國(guó)應(yīng)用光物理公司；紫外光譜儀、傅里葉紅外光譜儀、DSC-4000差示量熱掃描儀，美國(guó)珀金埃爾股份有限公司；F-4600型熒光光譜儀，日本日立儀器(上海)有限公司；Nano-ZS-90型馬爾文激光粒度儀，英國(guó)馬爾文儀器有限公司。ALPHA 1-2 LD plus型冷凍干燥機(jī)，德國(guó)Christ公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 pH偏移誘導(dǎo)處理

用濃度為10 mmol/L、pH為1.0～7.0的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)將SLP配制成蛋白濃度為10 mg/mL的溶液，在室溫條件(25±2) ℃下分別誘導(dǎo)0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、12.0、24.0 h；誘導(dǎo)結(jié)束后pH調(diào)回中性(pH 7)，儲(chǔ)藏于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 乳化性

將15 mL質(zhì)量濃度為5 mg/mL的SLP溶液和5 mL大豆油加入到50 mL的EP管中，在10 000 r/min條件下均質(zhì)2 min，用移液器從EP管底部吸取50 μL乳液于5 mL濃度為1 g/L、pH為7.0的SDS溶液中，充分混合后在500 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值。乳化性計(jì)算如公式(1)(2)所示[12]：

(1)

(2)

式中：EAI，乳化活性指數(shù)，m2/g；ESI，乳化穩(wěn)定指數(shù)，min；N，稀釋倍數(shù)，100；c，蛋白質(zhì)濃度，g/mL；Φ，光程，0.01 m；θ，油相體積分?jǐn)?shù)，0.25；A0、A10分別為0和10 min的吸光值。

1.3.3 柔性測(cè)定

在4 mL質(zhì)量濃度為1 mg/mL樣品液中按體積比16∶1加入濃度為0.05 mol/L，pH 7.0的Tris-HCl胰蛋白酶液(250 U/mg)，37 ℃反應(yīng)5 min，用4 mL濃度為50 g/L的三氯乙酸終止反應(yīng)，8 000 r/min離心10 min，取上清液在280 nm波長(zhǎng)下測(cè)吸光值作為柔性指標(biāo)[13]。

1.3.4 差示掃描量熱分析

精確稱(chēng)取2.000 mg樣品密封于50 μL鋁制液體皿中，以升溫速率10 ℃/min，在20～120 ℃內(nèi)利用DSC-4000差示量熱掃描儀測(cè)定樣品的熱流曲線(xiàn)，以空的密封鋁液體坩堝作為參比，試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析采用Pyris Software DSC 4000通用分析軟件進(jìn)行。

1.3.5 粒徑測(cè)定

將樣品用pH 7.2的PBS稀釋成質(zhì)量濃度1 mg/mL的溶液，并經(jīng)0.45 μm水系醋酸纖維素濾膜過(guò)濾，設(shè)定蛋白折光率為1.145，吸光值為0.001，在25 ℃條件下平衡3 min，通過(guò)馬爾文激光粒度儀測(cè)定樣品的粒徑分布曲線(xiàn)。

1.3.6 紫外光譜測(cè)定

取質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的樣品，設(shè)定分辨率為0.2 nm，掃描速率為600 nm/min，通過(guò)紫外光譜儀獲取190～800 nm原始蛋白紫外光譜，利用origin微分變換獲得二階導(dǎo)數(shù)紫外光譜。

1.3.7 內(nèi)源熒光光譜測(cè)定

將樣品液用pH 7.2的PBS稀釋為質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的溶液，在激發(fā)和發(fā)射狹縫均為5 nm、電壓為500 V條件下，以激發(fā)波長(zhǎng)295 nm，300～400 nm波長(zhǎng)掃描得到熒光光譜，掃描3次取平均值最后得到內(nèi)源熒光光譜圖。

1.3.8 外源熒光光譜測(cè)定

將20 μL濃度為8 mmol/L的熒光探針(1-苯胺基-8-萘磺酸，ANS)加入到4 mL濃度為0.1 mg/mL的樣品中，避光靜置3 min后，設(shè)定狹縫為5 nm、激發(fā)波長(zhǎng)390 nm，通過(guò)F-4600型熒光光譜儀掃描400～600 nm熒光發(fā)射光譜。

1.3.9 傅里葉紅外光譜測(cè)定

精確稱(chēng)取2 mg樣品，按質(zhì)量比1∶100加入KBr粉末，經(jīng)充分研磨混合均勻后壓片成型，采用傅里葉紅外光譜儀在分辨率4 cm-1，掃描次數(shù)32條件下掃描4 000～400 cm-1的紅外光譜，經(jīng)基線(xiàn)校準(zhǔn)后，采用Peakfit 4.0.2計(jì)算酰胺I帶(1 700～1 600 cm-1)獲取蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)信息。

1.3.10 圓二色譜的測(cè)定

用濃度為0.01 mol/L，pH為7.0的PBS將樣品稀釋至質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL的溶液，以相應(yīng)磷酸鹽緩沖液為對(duì)照，在光徑10 mm，掃描頻率為90 nm/min，間隔時(shí)間0.25 s條件下采用ChirascanqCD圓二色譜獲取190～260 nm的遠(yuǎn)紫外圓二色譜。

1.4 數(shù)據(jù)與分析

數(shù)據(jù)采用Excel 2013和SPSS 22.0進(jìn)行分析(LSD，P<0.05)和處理，實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP結(jié)構(gòu)影響分析

2.1.1 三級(jí)構(gòu)象分析

由于一階紫外光譜難以辨別蛋白微環(huán)境變化后各個(gè)芳香族氨基酸的貢獻(xiàn)率，故使用紫外二級(jí)導(dǎo)數(shù)光譜辨別不同微環(huán)境條件下芳香族氨基酸暴露程度從而監(jiān)測(cè)蛋白構(gòu)象的變化[14]。pH偏移誘導(dǎo)SLP的二階紫外導(dǎo)數(shù)光譜如圖1-a所示。在280～300 nm存在2個(gè)正吸收峰(288和296 nm)和2個(gè)負(fù)吸收峰(283和291 nm)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，采用波峰和波谷距離“a”與“b”的比值“r”以及藍(lán)移程度來(lái)判斷pH偏移誘導(dǎo)后酪氨酸在SLP三級(jí)構(gòu)象改變的貢獻(xiàn)，r值越大表示酪氨酸和色氨酸暴露程度越大，即蛋白三級(jí)構(gòu)象越松散[15]。

a-二階導(dǎo)數(shù)光譜；b-二階導(dǎo)數(shù)光譜的r值圖1 pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP二階導(dǎo)數(shù)紫外光譜影響Fig.1 Effects of pH-shift induction on the second-derivative UV spectra of SLP

由圖1-b可知，pH偏移誘導(dǎo)引起SLP的r值均大于天然狀態(tài)的r值，且在誘導(dǎo)8～10 h后其r值趨于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)，SLP酪氨酸和色氨酸暴露程度達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，蛋白三級(jí)構(gòu)象伸展趨于動(dòng)態(tài)穩(wěn)定。在0.5～8 h內(nèi)r值變化規(guī)律不是很明顯，可能是SLP非單一組分，且含有較高含量的磷脂成分，在初始偏移誘導(dǎo)處理階段蛋白構(gòu)象轉(zhuǎn)換、蛋白質(zhì)-溶劑熱力學(xué)系統(tǒng)未達(dá)到平衡狀態(tài)，因而r值變化相對(duì)無(wú)序[16]。這與周向軍等[17]在蠶豆分離蛋白pH偏移過(guò)程中研究結(jié)果相一致。

圖2-a為pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP內(nèi)源熒光光譜的影響，結(jié)果顯示pH偏移誘導(dǎo)增加了SLP的內(nèi)源熒光強(qiáng)度，且隨著pH的減小伴隨微小的藍(lán)移，表明pH偏移誘導(dǎo)使得SLP表面分布更多的疏水性氨基酸，并在偏移處理8～10 h后SLP的內(nèi)源熒光強(qiáng)度趨于相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)(圖2-b)。

a-pH偏移誘導(dǎo)10 h時(shí)SLP的內(nèi)源熒光光譜圖； b-pH偏移誘導(dǎo)過(guò)程中SLP的最大內(nèi)源熒光吸收值圖2 pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP內(nèi)源熒光光譜的影響Fig.2 Effects of pH-shift induction on the intrinsic fluorescence spectra of SLP

外源熒光結(jié)果如圖3-a所示，天然SLP具有最小的外源熒光強(qiáng)度和最大的λmax，隨著pH的減小和誘導(dǎo)時(shí)間的增加，SLP外源熒光強(qiáng)度呈增加并趨于穩(wěn)定趨勢(shì)且伴隨一定程度的藍(lán)移；在誘導(dǎo)8～10 h后SLP外源熒光強(qiáng)度變化達(dá)到相對(duì)穩(wěn)定狀態(tài)(圖3-b)，表明大部分酪氨酸和色氨酸殘基暴露于蛋白分子表面，蛋白三級(jí)構(gòu)象變得更加松散。研究顯示，在pH偏移誘導(dǎo)過(guò)程中蛋白主要發(fā)生以下3個(gè)主要反應(yīng)：(1)蛋白大分子解聚而降低分子質(zhì)量；(2)谷氨酸殘基和精氨酸殘基脫氨反應(yīng)；(3)部分氨基酸降解。這些反應(yīng)都增加了蛋白分子中羰基含量并影響疏水相互作用和靜電引力，進(jìn)而達(dá)到pH偏移誘導(dǎo)改變蛋白構(gòu)象，最終使得埋藏于蛋白球形結(jié)構(gòu)核心內(nèi)部的疏水基團(tuán)暴露于分子表面，因而使得表面疏水性增大[18]。這為調(diào)控和構(gòu)造不同結(jié)構(gòu)的SLP-多酚復(fù)合物及其應(yīng)用提供了基礎(chǔ)[19]。

a-pH偏移誘導(dǎo)10 h時(shí)SLP的外源熒光光譜圖； b-pH偏移誘導(dǎo)過(guò)程中SLP的最大外源熒光吸收值圖3 pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP外源熒光光譜的影響Fig.3 Effects of pH-shift induction on the extrinsic fluorescence spectra of SLP

2.1.2 二級(jí)構(gòu)象分析

pH偏移誘導(dǎo)SLP的FTIR透射圖譜、酰胺I帶吸光圖譜、Gauss曲線(xiàn)擬合圖譜(以pH 7為例)、酰胺I帶二階導(dǎo)數(shù)吸光圖譜和二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化如圖4所示。

a-紅外透射光譜圖；b-紅外酰胺I帶吸光圖譜；c-pH 7偏移誘導(dǎo)10 h時(shí)SLP的Gauss曲線(xiàn)擬合圖譜； d-紅外酰胺I帶二階導(dǎo)數(shù)光譜；e-二級(jí)結(jié)構(gòu)含量；f-圓二色譜圖圖4 pH偏移誘導(dǎo)10 h時(shí)對(duì)SLP傅里葉紅外光譜和圓二色譜的影響Fig.4 Effects of pH-shift induction on the FTIR and CD spectra of SLP

由圖4-e可知，由于pH 5偏移誘導(dǎo)處理最接近SLP等電點(diǎn)(pI 5.2)，在該條件下的SLP分子間靜電斥力減弱引起分子間聚集大幅度增加(18.15%)以及形成相對(duì)結(jié)構(gòu)緊密的蛋白構(gòu)象。天然SLP二級(jí)結(jié)構(gòu)的α-螺旋主吸收振動(dòng)峰在1 653 cm-1，隨著pH偏移誘導(dǎo)pH值的減小(pH 7降至1)，酰胺I帶的二階導(dǎo)數(shù)圖譜顯示α-螺旋特征峰在1 653 cm-1吸收強(qiáng)度呈減弱趨勢(shì)，β-折疊特征峰1 612、1 623、1 638 cm-1逐漸增強(qiáng)；其中1 638、1 612 cm-1代表分子間和分子內(nèi)聚集程度反向平行β-折疊結(jié)構(gòu)的吸收強(qiáng)度呈下降趨勢(shì)，分別由15.16%降至9.98%和5.71%將至3.98%。通過(guò)對(duì)酰胺I帶進(jìn)行Gauss多峰擬合求得SLP具體二級(jí)結(jié)構(gòu)含量，發(fā)現(xiàn)α-螺旋相對(duì)含量由19.62%降低至12.67%；同時(shí)伴隨著β-折疊含量呈逐漸增加趨勢(shì)，其相對(duì)含量由34.06%增加至52.14%；與JIANG等[20]采用極端酸pH偏移誘導(dǎo)處理大豆蛋白發(fā)現(xiàn)α-螺旋含量減小而β-折疊含量增加結(jié)果相似。

進(jìn)一步通過(guò)圓二色譜解析pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP二級(jí)構(gòu)象的影響(圖4-f)，CD圖譜中208 nm處為α-螺旋特征峰、216 nm處為β-折疊特征峰，在pH 5偏移誘導(dǎo)處理的SLP圓二譜圖性狀和肩峰位置與天然態(tài)相比發(fā)生明顯變化，該結(jié)果與紅外表征結(jié)果相一致(圖4-d)，可能是由于接近SLP等電點(diǎn)(pI 5.2)，SLP之間靜電斥力減弱、分子內(nèi)氫鍵被破壞同時(shí)疏水相互作用增加導(dǎo)致分子間聚集程度增大，而隨著pH偏移的減小，pH偏移誘導(dǎo)SLP的CD在208和222 nm處肩峰吸收強(qiáng)度下降但峰型和位置沒(méi)有發(fā)生明顯變化，表明pH偏移誘導(dǎo)在一定程度上降低了SLP的α-螺旋結(jié)構(gòu)含量而增加了β-折疊結(jié)構(gòu)含量，該結(jié)果與FTIR的Gauss多峰擬合結(jié)果一致(圖4-e)。這是因?yàn)殡S著偏移誘導(dǎo)pH的減小，游離的氫離子含量增加，大量的氫離子作用于SLP表面正電荷密度增強(qiáng)，使得蛋白表面親水性側(cè)鏈發(fā)生明顯變化而引起蛋白結(jié)構(gòu)伸展并暴露出疏水性殘基，最終導(dǎo)致維系蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵作用力被破壞，引起α-螺旋結(jié)構(gòu)解旋進(jìn)而暴露出更多的β-折疊及無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)[21]。研究發(fā)現(xiàn)在蛋白等電點(diǎn)附近誘導(dǎo)偏移處理同樣能獲得基本保持天然二級(jí)結(jié)構(gòu)而三級(jí)結(jié)構(gòu)松散的類(lèi)似熔球態(tài)蛋白結(jié)構(gòu)，如菠蘿蛋白酶在等電點(diǎn)附近(pH 10)誘導(dǎo)4 h后能獲得內(nèi)源熒光和外源熒光強(qiáng)度增強(qiáng)并保持大量二級(jí)結(jié)構(gòu)的特殊熔球態(tài)蛋白結(jié)構(gòu)[9,22]。

2.1.3 熱穩(wěn)定性分析

pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP構(gòu)象熱穩(wěn)定性影響如圖5所示，pH偏移誘導(dǎo)(10 h)后的SLP均顯示出7S和11S球蛋白典型熱吸收峰，SLP焓值和變性溫度隨著偏移誘導(dǎo)pH的減小呈現(xiàn)出先增大后降低的趨勢(shì)，并在SLP等電點(diǎn)附近出現(xiàn)最大的變性溫度和焓值，MOLINA等[23]和RENKEMA等[24]研究也顯示向日葵和大豆的11S球蛋白在等電點(diǎn)附近變性溫度和焓值達(dá)到最大值。在低pH偏移誘導(dǎo)條件下(pH 由5降到1)SLP的11S球蛋白變性峰溫度由最大值97.27 ℃降至87.29 ℃、7S球蛋白變性峰溫度由最大值76.77 ℃降至64.57 ℃，同時(shí)總焓值由最大值4.87 J/g減少至0.34 J/g，且均小于天然態(tài)；表明低pH偏移誘導(dǎo)引起11S球蛋白和7S球蛋白的六聚體和三聚體解聚，而蛋白分子部分展開(kāi)和蛋白結(jié)構(gòu)內(nèi)部分子斥力增強(qiáng)造成SLP蛋白分子熱穩(wěn)定性下降；這與上文光譜解析pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP蛋白構(gòu)象影響結(jié)果一致。

a-熱流曲線(xiàn)圖；b-變性溫度和總焓值圖5 pH偏移誘導(dǎo)10 h時(shí)對(duì)SLP熱穩(wěn)定性影響Fig.5 Effects of pH-shift induction on thermal stability of SLP

2.2 pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP自組裝納米顆粒尺寸的影響

如圖6所示，天然態(tài)SLP呈多峰分布，在10 000 nm附近有較大的分布；隨著偏移誘導(dǎo)pH的減小，SLP流體動(dòng)力學(xué)半徑先增大后減小，并伴隨著多分散系數(shù)下降，SLP粒徑逐漸趨于單分布；在pH 4條件下誘導(dǎo)偏移處理的SLP顆粒呈窄的單峰分布且具有最大的流體動(dòng)力學(xué)半徑，表明在酸性環(huán)境誘導(dǎo)條件下，SLP分子結(jié)構(gòu)內(nèi)質(zhì)子化程度增大，分子內(nèi)部斥力增強(qiáng)，引起SLP緊湊的結(jié)構(gòu)向無(wú)序狀態(tài)展開(kāi)，并在進(jìn)一步的pH偏移誘導(dǎo)過(guò)程中SLP納米顆粒發(fā)生自組裝，形成形狀較規(guī)則的球體納米顆粒，其分子形態(tài)由無(wú)序聚集狀態(tài)向粒徑分布均勻、尺寸均一、形狀規(guī)整的球形納米顆粒轉(zhuǎn)變，如圖7所示。然而在pH 1和2 條件誘導(dǎo)處理的SLP流體動(dòng)力學(xué)半徑比天然態(tài)SLP要小，并伴隨著在10 nm左右處的顆粒分布增多的現(xiàn)象，這是因?yàn)樵跇O端酸性條件下，SLP分子中的11S六聚體和7S三聚體逐漸解聚引起SLP整體分子流體動(dòng)力學(xué)半徑減小。

a-SLP的粒徑分布圖；b-SLP的粒徑圖；c-SLP的圖圖6 pH偏移誘導(dǎo)10 h時(shí)對(duì)SLP粒徑和多分散系數(shù)的影響Fig.6 Effects of pH-shift induction on the size and polydisperity index of SLP

圖7 pH偏移誘導(dǎo)SLP自組裝納米顆粒行為示意圖Fig.7 Idealized schematic self-assembly of SLP by pH-shift induction

2.3 pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP納米顆粒微觀形態(tài)影響

由圖8可知，pH偏移誘導(dǎo)使SLP由無(wú)規(guī)則、大小不一、棱角分明且質(zhì)地相對(duì)密實(shí)的塊片狀向納米尺度的球形顆粒轉(zhuǎn)變；因pH 5條件處最接近SLP等電點(diǎn)(pI 5.2)，SLP分子表面凈電荷最小、分子斥力減弱以及強(qiáng)烈的疏水相互作用使得SLP分子發(fā)生強(qiáng)烈的集聚效應(yīng)而形成質(zhì)地密實(shí)的顆粒。隨著偏移誘導(dǎo)pH的減小，SLP體系中球形顆粒逐漸增多，在pH 4條件形成的球形顆粒分布較為均勻，而在極端pH條件形成的球形顆粒相對(duì)集中且尺寸較小。SCHMITT等[10]研究發(fā)現(xiàn)在100 nm掃描電鏡下，在pH 4.6～7.0誘導(dǎo)的β-乳球蛋白納米顆粒中，等電點(diǎn)附近(5.0)形成的納米顆粒成團(tuán)狀，而接近中性pH 5.8～7.0 的β-乳球蛋白納米顆粒呈現(xiàn)線(xiàn)狀，pH也大，線(xiàn)狀越突出，但是在低于等電點(diǎn)附近的pH 4.6的蛋白納米顆粒呈現(xiàn)相對(duì)分布均勻的球形納米顆粒，這與本研究基本一致，其差異為本研究在pH 5.0～7.0呈現(xiàn)片狀和塊狀分布形貌，主要是由于本研究采用的掃描電鏡精度過(guò)低(放大倍數(shù)為100 μm)造成的。此外，周向軍等[17]在pH偏移結(jié)合溫和熱處理對(duì)蠶豆分離蛋白結(jié)構(gòu)的影響中也發(fā)現(xiàn)類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象。

a-pH 1；b-pH 2；c-pH 3；d-pH 4；e-pH 5；f-pH 6；g-pH 7圖8 不同pH偏移誘導(dǎo)10 h對(duì)SLP自組裝納米顆粒 微觀形貌的影響Fig.8 Effects of pH-shift induction on SLP self-assembly particles by SEM

2.4 pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP乳化特性的影響

2.4.1 pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP蛋白溶解性的影響

如圖9所示，pH 1誘導(dǎo)處理的SLP溶解度比天然的SLP大(45%)，可能是在極端酸性條件下SLP蛋白分子解聚形成小分子質(zhì)量亞基從而提高溶解度；隨著pH偏移誘導(dǎo)pH由2增大到6，SLP溶解度逐漸減小，可能是pH偏移誘導(dǎo)處理使得SLP蛋白結(jié)構(gòu)部分去折疊、結(jié)構(gòu)伸展，更多的疏水性氨基酸殘基暴露于蛋白表面，引起SLP表面疏水性增強(qiáng)，并在溶液體系中通過(guò)疏水相互作用形成溶解度差的大分子聚集體，從而造成SLP蛋白溶解度下降，與其他學(xué)者[20,25-26]發(fā)現(xiàn)pH偏移誘導(dǎo)引起SPI溶解度降低結(jié)果相符。

圖9 pH偏移誘導(dǎo)(10 h)對(duì)SLP蛋白溶解特性的影響Fig.9 Effects of pH-shift induction (10 h) on the protein solubility of SLP注：不同小寫(xiě)字母表示在P<0.05水平存在顯著性差異

2.4.2 pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP柔性影響

如圖10所示，在等電點(diǎn)附近(pH 5)處理的SLP因處于凈電荷基本為零、由于分子間斥力降低而引起強(qiáng)烈的聚集效應(yīng)形成緊湊的三級(jí)構(gòu)象，從而導(dǎo)致SLP柔性最??；試驗(yàn)結(jié)果顯示pH偏移誘導(dǎo)能使蛋白結(jié)構(gòu)部分去折疊、結(jié)構(gòu)展開(kāi)從而有效降低SLP蛋白剛性結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致SLP柔性增強(qiáng)[13]。

圖10 pH偏移誘導(dǎo)(10 h)對(duì)SLP分子柔性的影響Fig.10 Effects of pH-shift induction (10 h) on the molecule flexibility of SLP

2.4.3 pH偏移誘導(dǎo)對(duì)SLP乳化特性的影響

由圖11可知，在pH 5條件下誘導(dǎo)的SLP由于凈電荷接近零，分子間斥力降低而引起強(qiáng)烈的聚集效應(yīng)形成大量難溶性大分子聚集物，降低溶解度，并使SLP構(gòu)象密實(shí)剛性增強(qiáng)而柔性降低。與天然SLP相比，pH偏移誘導(dǎo)處理提高了SLP乳化活性和乳化穩(wěn)定性；這可能歸功于：pH偏移誘導(dǎo)處理使得蛋白結(jié)構(gòu)部分去折疊、結(jié)構(gòu)伸展，蛋白結(jié)構(gòu)剛性下降而柔性增加，更有利于蛋白分子迅速吸附在油水界面膜上；而且結(jié)構(gòu)伸展后暴露出更多疏水性氨基酸，使得蛋白表面疏水性增強(qiáng)從而提高了SLP表面活性，這與紫外光譜和熒光光譜分析結(jié)果相一致；而且SLP構(gòu)象伸展以及解聚后暴露出埋藏于內(nèi)部的磷脂和oleosin進(jìn)一步提高了SLP的乳化功能特性。其他學(xué)者[20,25-26]也發(fā)現(xiàn)大豆分離蛋白和黑蕓豆分離蛋白經(jīng)pH偏移誘導(dǎo)處理能提高其乳化功能特性。

圖11 pH偏移誘導(dǎo)(10 h)對(duì)SLP乳化特性的影響Fig.11 Effects of pH-shift induction (10 h) on the emulsibility of SLP

此外，在pH 4偏移誘導(dǎo)處理的SLP乳化功能特性表現(xiàn)突出，除了上述原因外，還可能與pH偏移誘導(dǎo)過(guò)程中SLP納米顆粒發(fā)生自組裝，形成形狀較規(guī)則的球體納米顆粒，其分子形態(tài)由無(wú)序聚集狀態(tài)向粒徑分布均勻、尺寸均一、形狀規(guī)整的球形納米顆粒轉(zhuǎn)變有關(guān)，因?yàn)轭w粒均一的蛋白分子能迅速吸附，并形成穩(wěn)定的油水界面膜從而提高乳化活性和乳化穩(wěn)定性[27]；且研究表明，在等電點(diǎn)附近誘導(dǎo)處理的蛋白具有較大電荷補(bǔ)丁和良好吸附能力的多孔納米材料[22, 28]。

3 結(jié)論與討論

本實(shí)驗(yàn)聯(lián)合多光譜、熱分析和動(dòng)態(tài)光散射等技術(shù)，研究了pH偏移誘導(dǎo)SLP解離締合行為并對(duì)其自組裝納米顆粒進(jìn)行表征，通過(guò)觀察不同pH條件下(pH 1～6)SLP蛋白三級(jí)構(gòu)象的影響，詳細(xì)分析了pH偏移誘導(dǎo)10 h對(duì)SLP蛋白構(gòu)象、流體動(dòng)力學(xué)半徑、熱穩(wěn)定性和乳化特性的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，通過(guò)熒光光譜和紫外二階導(dǎo)數(shù)光譜分析發(fā)現(xiàn)pH偏移誘導(dǎo)使得SLP蛋白結(jié)構(gòu)經(jīng)歷去折疊、單帶亞基解離以及再聚集過(guò)程，大約10 h后SLP構(gòu)象趨于穩(wěn)定狀態(tài)，最終使得pH偏移誘導(dǎo)后的SLP蛋白表面分布更多的酪氨酸和色氨酸并且具有松散三維構(gòu)象。SLP經(jīng)pH偏移誘導(dǎo)10 h后，蛋白表面親水性側(cè)鏈發(fā)生明顯變化而最終導(dǎo)致維系蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵作用力被破壞，引起α-螺旋結(jié)構(gòu)解旋，含量下降，而β-折疊含量增加；同時(shí)DSC結(jié)果顯示在等電點(diǎn)處SLP具有最大的抗變性能力，而pH偏移誘導(dǎo)能誘發(fā)SLP聚集體解聚、蛋白結(jié)構(gòu)伸展而引起熱穩(wěn)定性下降。pH偏移誘導(dǎo)過(guò)程中SLP納米顆粒發(fā)生自組裝，形成形狀較規(guī)則和尺寸均一的球體納米顆粒，其分子形態(tài)由無(wú)序聚集狀態(tài)向粒徑分布均勻狀態(tài)轉(zhuǎn)變，在pH 4條件下誘導(dǎo)偏移處理的SLP顆粒呈較窄的正態(tài)分布且具有最大的流體動(dòng)力學(xué)半徑，并呈現(xiàn)出良好的分子柔性和乳化特性。