天門地區(qū)鲊廣椒中細菌群落結(jié)構(gòu)及乳酸菌類群研究

席啦，向凡舒，張彥，張海波，郭壯*

1(湖北文理學(xué)院 湖北省食品配料工程技術(shù)研究中心，湖北 襄陽，441053) 2(湖北文理學(xué)院 乳酸菌生物技術(shù)與工程襄陽市重點實驗室，湖北 襄陽，441053) 3(安琪酵母股份有限公司生物技術(shù)研究院，湖北 宜昌，443003)

鲊，作為我國流傳千年的一種食物保存方法，通常是用米粉或面粉等加入其他佐料經(jīng)過密封發(fā)酵，在我國云貴川湘鄂贛等地常見[1]。鄂西地區(qū)將辣椒稱為廣椒，則有了鲊廣椒這一特色菜肴，其滋味酸辣咸香，烹飪方式多種多樣。近年來，國內(nèi)針對鲊廣椒的品質(zhì)、工藝和微生物類群等方面均有開展研究。尚雪嬌等[2]采用仿生技術(shù)對當陽地區(qū)鲊廣椒的感官品質(zhì)及有機酸進行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)鲊廣椒中芳香類揮發(fā)性物質(zhì)較少，且在酸味指標上差異較大，而酸味的來源主要為乳酸。王玉榮等[3]采用第二代測序技術(shù)分別對當陽地區(qū)鲊廣椒中的真菌和細菌多樣性進行了解析，結(jié)果顯示念珠菌屬(Candida)、曲霉菌屬(Eurotium)和畢赤酵母屬(Pichia)為鲊廣椒中主要的真菌屬；乳桿菌屬(Lactobacillus)、魏斯氏菌屬(Weissella)和片球菌屬(Pediococcus)等乳酸菌為鲊廣椒中主要的細菌屬[4]。此外，CAI等[5]針對恩施土家族苗族自治州鲊廣椒細菌類群展開了研究，結(jié)果亦表明鲊廣椒中蘊含了大量的Lactobacillus等乳酸菌類群。不同地域和制作工藝等因素可能對鲊廣椒中的微生物類群有著一定的影響[6]，因此解析不同地區(qū)鲊廣椒的微生物類群對全面掌握鲊廣椒中的微生物種類具有重要意義。

作為湖北省直接管轄的縣級市之一，天門市坐落于長江中游城市群，當?shù)匾嘤绪噺V椒的制作與食用習(xí)俗，而其較為特殊的地理環(huán)境可能使天門地區(qū)鲊廣椒與其他地區(qū)鲊廣椒的微生物類群存在一定差異。本研究采用MiSeq高通量測序技術(shù)對天門地區(qū)鲊廣椒中細菌多樣性進行解析的同時，對菌屬之間的相關(guān)性亦展開探討，并進一步預(yù)測菌群功能，此外還采用純培養(yǎng)方式對其中的乳酸菌進行鑒定和保藏，以期在后續(xù)鲊廣椒產(chǎn)業(yè)化加工和產(chǎn)品創(chuàng)新中提供理論參考和菌株支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

樣品采集：15份鲊廣椒樣品分別于2019年10月采集自湖北省天門市人民路市場、官路農(nóng)貿(mào)市場和南湖臨時菜市場，樣品編號為TM01～15。所有樣品均為不同農(nóng)戶家中自制，樣品選擇標準：發(fā)酵時間超過30 d，且未經(jīng)過熟制；色澤呈玉米黃或略帶紅色；不存在除鲊廣椒以外的異味。

基因組提取試劑盒，德國QIAGEN公司；DNA聚合酶、rTaq酶和10×Buffer、dNTP，寶生物工程(大連)有限公司；MRS、LB培養(yǎng)基，青島海博生物技術(shù)有限公司；正向引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)、反向引物806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

Veriti FAST梯度PCR儀，美國ABI公司；UVPCDS8000凝膠成像分析系統(tǒng)，美國Protein Simple公司；Illumina MiSeq PE250高通量測序平臺，美國Illumina公司；R930型機架式服務(wù)器，美國DELL公司；DG250型厭氧工作站，英國Don Whitley公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 宏基因組DNA的提取、PCR擴增和高通量測序

鲊廣椒宏基因組DNA提?。好糠輼悠啡? g，參照基因組提取試劑盒使用方法提取宏基因組DNA。

PCR擴增和高通量測序：在正向引物前段添加8個堿基對作為核苷酸標簽以便進行序列配對。針對提取合格的總DNA的16S rRNA V3～V4區(qū)域進行PCR擴增，擴增條件均參照李娜等[7]的方法，檢測合格的擴增產(chǎn)物寄至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司完成測序。

1.3.2 序列質(zhì)控和生物信息學(xué)分析

參照郭壯等[8]的方法對下機序列進行配對和質(zhì)控，下機后的序列采用QIIME平臺(v1.9.0)進行生物信息學(xué)分析[9]。采用UCLUST兩步法按照100%和97%相似度構(gòu)建分類操作單元(operational taxonomic units，OTU)[10]矩陣，使用ChimeraSlayer軟件將含有嵌合體序列的OTU刪除[11]；余下OTU分別選出1 條代表性序列在數(shù)據(jù)庫[12-13]中進行比對，將OTU的分類學(xué)地位分別鑒定到門、綱、目、科和屬水平上；使用主坐標分析和圍繞中心點的劃分(partitioning around medoid，PAM)聚類分析對鲊廣椒樣品進行β多樣性分析；通過計算所有樣品的Chao 1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)對樣品進行α多樣性分析；采用PICRUSt軟件預(yù)測鲊廣椒的菌群功能[14]。

1.3.3 乳酸菌的分離鑒定

乳酸菌的分離：參照向凡舒等[15]的方法對樣品進行預(yù)處理和倍比稀釋涂布后，將MRS平板于30 ℃厭氧培養(yǎng)36～48 h后取出。選取形狀、顏色、表面光滑程度和大小均有不同，且周圍產(chǎn)生透明圈的疑似乳酸菌菌落，采用平板劃線法進行純化，同時對純化后的菌株進行革蘭氏染色和過氧化氫酶試驗，最后采用甘油保藏法將革蘭氏陽性且過氧化氫酶陰性的菌株保藏于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

乳酸菌的鑒定：首先富集菌體并提取疑似乳酸菌菌株DNA，繼而參照1.3.1中的方法進行PCR擴增，對合格產(chǎn)物進行連接轉(zhuǎn)化，最后挑取陽性克隆子寄至上海桑尼生物科技有限公司測序，返回的序列經(jīng)過手動去引物后在BLAST網(wǎng)站上進行比對[16]。

1.3.4 數(shù)據(jù)處理

使用past3軟件進行Mann-Whitnay檢驗，分析不同聚類間的顯著差異；使用Origin2017軟件繪制主坐標分析圖和柱形圖；使用R(v4.1.0)軟件繪制PAM聚類圖[17]和α指數(shù)小提琴圖；使用GraphPad Prism 9繪制不同聚類間菌屬差異柱形圖；使用Cytoscape(v3.7.2)繪制菌屬相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖；使用STAMP(2.1.3)繪制COG功能差異圖；使用MEGA7.0和R(v4.1.0)軟件共同構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 鲊廣椒樣品的β多樣性分析

本研究首先采用主坐標分析法和PAM聚類分析法來探討不同鲊廣椒樣品的細菌群落結(jié)構(gòu)特征，結(jié)果如圖1所示。由圖1-a可知，第一主成分和第二主成分的占比分別為86.38%和4.74%，且所有樣品在空間排布上呈現(xiàn)出了明顯的聚類和分離趨勢。其中10個樣品(TM02、TM03、TM04、TM05、TM07、TM08、TM09、TM010、TM13和TM15)較為集中的排布在第一主成分的負軸周圍，將其視為聚類Ⅰ。而另外5個樣品(TM01、TM06、TM11、TM12和TM14)則較為分散的排布在第一、三和四象限中，將其視為聚類Ⅱ。

經(jīng)PAM聚類分析發(fā)現(xiàn)，當15份樣品被分為2個聚類時，CH指數(shù)最高，為39，而當樣品被分為3～5個聚類時，CH指數(shù)分別為27、10和5，這表明最佳聚類數(shù)為2。由圖1-b可知，利用主坐標分析將K-Means聚類分析結(jié)果可視化后的2個聚類分離趨勢亦非常明顯，其中10 個樣品全部分布在第二象限和第三象限，而另外5個樣品則全部分布在第一象限和第四象限。K-Means聚類趨勢同主坐標分析得到的聚類其樣品組成完全相同。值得注意的是，聚類Ⅰ中的樣品與聚類Ⅱ相比分布更為集中，這說明聚類Ⅰ中樣品的菌群結(jié)構(gòu)更為相近。

a-基于加權(quán)UniFrac距離的主坐標分析; b-基于OTU水平的PAM聚類分析圖1 基于加權(quán)UniFrac距離的主坐標分析和基于 OTU水平的PAM聚類分析Fig.1 Principal coordinate analysis based on weighted UniFrac distance and PAM cluster analysis based on OTU level

2.2 α多樣性分析

在對樣品進行β多樣性分析的基礎(chǔ)上，本研究進一步通過α指數(shù)來分析2個聚類中的物種豐富度和均勻度。本研究對所有樣品序列均進行了抽平處理，2個聚類的Chao 1指數(shù)、發(fā)現(xiàn)物種數(shù)、香農(nóng)指數(shù)和辛普森指數(shù)如圖2所示。

由圖2可知，聚類Ⅰ的4項α多樣性指數(shù)均小于聚類Ⅱ，且兩個聚類在Chao 1指數(shù)(圖2-a)和發(fā)現(xiàn)物種數(shù)(圖2-b)上的差異非常顯著(P<0.01)，在香農(nóng)指數(shù)(圖2-c)上差異顯著(P<0.05)，而在辛普森指數(shù)(圖2-d)上差異不顯著(P>0.05)。這表明聚類Ⅰ的細菌類群在豐富度和多樣性上均要顯著低于聚類Ⅱ。

圖2 兩個聚類的α多樣性指數(shù)比較分析Fig.2 Comparative analysis of α diversity index of the two clusters注：*表示差異顯著，P<0.05；**表示差異非常顯著，P<0.01；NS表示差異不顯著，P>0.05

2.3 基于細菌門和細菌屬水平的細菌多樣性分析

所有樣品經(jīng)過測序共得到359 236條高質(zhì)量序列，經(jīng)過97%相似度劃分得到11 582個OTU，經(jīng)比對共鑒定到18個門和260個屬。本研究將平均相對含量>1.0%的門和屬作為鲊廣椒中的優(yōu)勢門和屬[18]，2個聚類中的優(yōu)勢門相對含量分布及差異分析如圖3所示。聚類Ⅰ中的優(yōu)勢門為Firmicutes(硬壁菌門，96.99%)和Proteobacteria(變形菌門，2.30%)，聚類Ⅱ中的優(yōu)勢門為Proteobacteria(62.94%)、Firmicutes(22.86%)和Actinobacteria(放線菌門，9.00%)。經(jīng)過Mann-Whitnay檢驗發(fā)現(xiàn)2個聚類在3個門上均差異顯著，且在Firmicutes(圖3-b)和Proteobacteria(圖3-c)上的差異極顯著(P<0.001)。

a-優(yōu)勢細菌門分布;b-硬壁菌門;c-變形菌門圖3 兩個聚類中優(yōu)勢細菌門分布及硬壁菌門和變形菌門相對含量差異分析Fig.3 Analysis on the distribution of dominant bacteria and the relative content difference of Firmicutes and Proteobacteria in the two clusters注：***表示差異極顯著，P<0.001(下同)

2個聚類中的優(yōu)勢屬相對含量分布及差異分析如圖4所示。由圖4可知，聚類Ⅰ中有4個優(yōu)勢屬，分別為Lactobacillus(乳桿菌屬，89.77%)、Tetragenococcus(四聯(lián)球菌屬，3.29%)、Weissella(魏斯氏菌屬，2.20%)和Staphylococcus(葡萄球菌屬，1.52%)，其中乳酸菌含量高達95.26%；聚類Ⅱ中有8 個優(yōu)勢屬，分別為Klebsiella(克雷伯氏菌屬，19.81%)、Kosakonia(小坂菌屬，12.24%)、Tetragenococcus(10.89%)、Lactobacillus(8.17%)、Pseudomonas(假單胞菌屬，5.5%)、Xanthomonas(黃單胞菌屬，4.08%)、Rhizobium(根瘤菌屬，4.08%)和Corynebacterium(棒狀桿菌屬，3.35%)，乳酸菌含量僅為19.06%。經(jīng)Mann-Whitnay檢驗發(fā)現(xiàn)，2個聚類間在Lactobacillus、Klebsiella、Kosakonia和Pseudomonas上均存在極顯著差異(P<0.001)。由此可見，聚類Ⅱ中的優(yōu)勢菌屬數(shù)量要明顯多于聚類Ⅰ，但聚類Ⅰ中乳酸菌含量要遠高于聚類Ⅱ。王玉榮等[4]前期在解析湖北省當陽地區(qū)鲊廣椒細菌類群時得到的結(jié)論與本研究的聚類Ⅰ相似，而與聚類Ⅱ中的菌群結(jié)構(gòu)差異較大。

a-優(yōu)勢細菌屬;b-乳桿菌屬;c-克雷伯氏菌屬;d-小坂菌屬e-假單胞菌屬圖4 兩個聚類中優(yōu)勢細菌屬分布及乳桿菌屬、克雷伯氏菌屬、小坂菌屬和假單胞菌屬相對含量差異分析Fig.4 Analysis on the distribution of dominant bacteria and the relative content difference of Lactobacillus, Klebsiella, Kosakonia and Pseudomonas in the two clusters

聚類Ⅱ中的部分菌屬包含著一些具有條件致病性的菌種，例如隸屬于Klebsiella的Klebsiellapneumoniae被認為是全球性的病原菌，可導(dǎo)致化膿性肝膿腫、肺炎和軟組織感染等[19]；隸屬于Pseudomonas的Pseudomonasaeruginosa對人體健康具有急慢性感染性[20]；而Xanthomonasspp.是一類廣泛的植物病原菌[21]。由此可見，2個聚類樣品在安全品質(zhì)上可能亦存在差異，這或許是不同農(nóng)戶選擇的制作原料在品質(zhì)上存在較大偏差，亦或是制作環(huán)境差異所導(dǎo)致的。

2.4 優(yōu)勢細菌屬的相關(guān)性分析

為探討鲊廣椒中菌群間的相關(guān)關(guān)系，本研究進一步對優(yōu)勢菌屬之間的相關(guān)性進行了分析，結(jié)果如圖5所示。Xanthomonas與Rhizobium顯著正相關(guān)(R=0.540，P<0.05)，與Kosakonia極顯著正相關(guān)(R=0.879，P<0.001)；Pseudomonas與Klebsiella極顯著正相關(guān)(R=0.820，P<0.001)；而Lactobacillus與Xanthomonas(R=-0.596，P<0.05)和Kosakonia(R=-0.552，P<0.05)顯著負相關(guān)，與Pseudomonas(R=-0.698，P<0.01)和Klebsiella呈非常顯著負相關(guān)關(guān)系(R=-0.738，P<0.01)。王玉榮等[22]采用第三代測序技術(shù)解析當陽地區(qū)鲊廣椒中細菌多樣性，結(jié)果表明L.plantarum是其中最主要的菌種，而MAO等[23]的研究表明L.plantarum產(chǎn)生的乳酸等成分可起到抑菌作用。因而從理論上推斷，Lactobacillus對Xanthomonas等具有條件致病性菌屬的生長繁殖可能具有一定的抑制作用。

圖5 鲊廣椒中優(yōu)勢細菌屬的相關(guān)性網(wǎng)絡(luò)圖Fig.5 Correlation network of dominant genus in Zha-chili注：實線表示正相關(guān)，虛線表示負相關(guān)， 線條的粗細代表相關(guān)性的大小。

2.5 不同聚類的細菌類群基因功能差異分析

本研究進一步對不同聚類的菌群功能以及功能差異進行了分析。所有樣品共注釋4 166個COG，分別屬于23個功能大類。2個聚類在功能上存在的差異如圖6所示，聚類Ⅰ在D、L、J、R和F功能上顯著大于聚類Ⅱ(P<0.05)，而聚類Ⅱ在U、A、Q、C、T、O、P、K、G和E功能上顯著大于聚類Ⅰ(P<0.05)，但2個聚類在R、G和E功能上的表達均較高。玉米面作為天門鲊廣椒的主要原料，其營養(yǎng)成分主要為淀粉和蛋白質(zhì)[24-25]，而這兩者通常是為微生物提供營養(yǎng)物質(zhì)的良好來源。因而，在菌群吸收營養(yǎng)物質(zhì)維持生存的同時，必將會引起一些產(chǎn)物的代謝反應(yīng)，這或許是鲊廣椒中細菌類群在碳水化合物和氨基酸的轉(zhuǎn)運與代謝功能上具有較高表達的原因。

A-RNA加工與修飾；C-能量生產(chǎn)和轉(zhuǎn)換；D-細胞周期控制，細胞 分裂，染色體分割；E-氨基酸轉(zhuǎn)運和代謝；F-核苷酸轉(zhuǎn)運和代謝； G-碳水化合物運輸和代謝；J-翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物合成； K-轉(zhuǎn)錄；L-復(fù)制、重組和修復(fù)；O-翻譯后飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，伴侶； P-無機離子及代謝；Q-次生代謝物的生物合成、運輸和分解代謝； R-一般功能預(yù)測預(yù)測；T-信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制；U-細胞內(nèi)運輸、 分泌和囊泡運輸圖6 兩個聚類中細菌基因功能預(yù)測差異分析Fig.6 Differential analysis of predicted bacterial gene functions in the two clusters

2.6 乳酸菌多樣性分析

通過純培養(yǎng)，本研究所采集的15份樣品共分離得到34株疑似乳酸菌分離株，經(jīng)序列比對后鑒定結(jié)果如圖7所示。

圖7 鲊廣椒中乳酸菌分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.7 Phylogenetic tree of lactic acid bacteria isolates from Zha-chili

由圖7可知，所有分離株共被鑒定到10個種，其中有13株鑒定為L.plantarum(植物乳桿菌，38.24%)，6株鑒定為L.brevis(短乳桿菌，17.65%)，5株鑒定為L.curvatus(彎曲乳桿菌，14.7%)，3株鑒定為L.sakei(清酒乳桿菌，8.82%)，2株鑒定為L.alimentarius(食品乳桿菌，5.88%)，各有1株鑒定為L.spicheri(辣味乳桿菌，2.94%)、L.acidipiscis(嗜酸乳桿菌，2.94%)、W.paramesenteroides(類腸膜魏斯氏菌，2.94%)、L.buchneri(布氏乳桿菌，2.94%)和Leuconostocmesenteroides(腸膜明串珠菌，2.94%)。由此可見，L.plantarum為天門地區(qū)鲊廣椒中的優(yōu)勢乳桿菌。

3 結(jié)論

本研究采用高通量測序和傳統(tǒng)微生物學(xué)相結(jié)合的手段對天門地區(qū)鲊廣椒細菌群落結(jié)構(gòu)進行了解析，對其蘊含的乳酸菌類群進行了分離鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，15份天門鲊廣椒樣品被劃分為2個聚類，聚類Ⅰ中的細菌主要為隸屬于Firmicutes的Lactobacillus，而聚類Ⅱ中的細菌主要為隸屬于Proteobacteria的Klebsiella和Kosakonia以及隸屬于Firmicutes的Tetragenococcus，其中L.plantarum、L.brevis和L.curvatus為鲊廣椒中的優(yōu)勢乳酸菌。由此可見，天門地區(qū)鲊廣椒的細菌群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜多樣，乳酸菌類群豐富，通過本研究的開展可為后續(xù)鲊廣椒產(chǎn)業(yè)化的實現(xiàn)和產(chǎn)品的創(chuàng)新提供一定的理論參考和菌種支持。