二氫楊梅素對(duì)小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞TK基因的致突變作用

馬秀玲,李逸飛,孫 圣,李海山

(中檢科健(天津)檢驗(yàn)檢測(cè)有限責(zé)任公司,天津 300309)

二氫楊梅素是一種存在于自然界的黃酮醇類化合物,屬于天然膳食成分之一,可從蛇葡萄、楊梅科和藤黃科等植物的莖葉中分離得到,除具有抗氧化、抗血栓、消炎和清除自由基的功效外,還有預(yù)防酒精肝、脂肪肝和清除身體中的自由基等特殊功效[1-3]。劑量如果添加不當(dāng),就易引起一定的毒性反應(yīng),白倩[4]課題組研究結(jié)果表明:致癌物誘導(dǎo)的人正常乳腺M(fèi)CF-10A細(xì)胞癌變發(fā)生可被AMP抑制,這一作用機(jī)理與其抑制DNMT1活性和表達(dá)水平,降低致癌物誘導(dǎo)的抑癌基因ATM啟動(dòng)子的甲基化增強(qiáng),進(jìn)而上調(diào)ATM表達(dá)有關(guān)聯(lián)性[4]。二氫楊梅素因?yàn)槌煞侄?易獲取,在工業(yè)化生產(chǎn)中有充足的原料,所以被廣泛應(yīng)用在食品中,如乳制品中添加適量二氫楊梅素在保持乳制品原有口感與風(fēng)味的同時(shí),還可以增加養(yǎng)肝護(hù)肝的功能;在解酒產(chǎn)品應(yīng)用上二氫楊梅素能抵抗酒精中毒和酒精依賴性,具有很好地預(yù)防治療酒精性肝損傷效果[5]。筆者通過實(shí)驗(yàn)從藤茶中提取的二氫楊梅素對(duì)小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞TK基因位點(diǎn)是否具有致突變作用,為研究二氫楊梅素在后期的安全應(yīng)用提供了一定的理論依據(jù)[6]。小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞基因突變實(shí)驗(yàn)(即MLA)是一種廣泛使用的體外遺傳毒理的致突變實(shí)驗(yàn)之一,檢測(cè)的靈敏度較高[7-10]?？蓹z測(cè)出包擴(kuò)點(diǎn)突變、大的缺失、重組、染色體異倍性和其他較大范圍基因組改變?cè)趦?nèi)的多種遺傳改變[11-13]。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器設(shè)備

二氫楊梅素(CAS號(hào):27200-12-0),購自西安天豐生物科技股份有限公司,批號(hào):NF-20190314,質(zhì)量濃度大于98%。

SW-CJ-1FD超凈工作臺(tái),蘇州蘇潔;MCO-20AICCO2培養(yǎng)箱,三洋;DMi1倒置顯微鏡,萊卡;L90滅菌鍋,GRE IRM;TD5A-WS離心機(jī),賽特湘儀離心機(jī)儀器;SHKE4000-1CE搖床,賽默飛;Quintix224-1CN電子天平,賽多利斯。

1.2 試 劑

DMEM高糖培養(yǎng)基,批號(hào):70040060,生產(chǎn)廠家:Biosharp;馬血清,批號(hào):925T051,生產(chǎn)廠家:Solarbio;環(huán)磷酰胺(CP),CAS號(hào):6055-19-2,批號(hào):A0355341,生產(chǎn)廠家:ACROS;甲磺酸乙酯(EMS),CAS號(hào):62-50-0,批號(hào):M18M11K109878,生產(chǎn)廠家:源葉生物;胸腺嘧啶核苷(T),批號(hào)WXBC8037V,生產(chǎn)廠家:Sigma;次黃嘌呤(H),批號(hào):305A0414,生產(chǎn)廠家:SoLarbio;氨甲嘌呤(M),批號(hào):H25J9Z66420,生產(chǎn)廠家:源葉生物;甘氨酸(G),批號(hào):709T069,生產(chǎn)廠家:SoLarbio;三氟胸苷(TFT),批號(hào):20190045,生產(chǎn)廠家:Sigma。

1.3 細(xì)胞概述

小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞是國(guó)際上廣泛認(rèn)可和使用并且可用于研究基因是否發(fā)生突變的細(xì)胞系,其來源于CGMCC。正式生產(chǎn)前,使用THMG培養(yǎng)基處理24 h,使用THG培養(yǎng)基處理48 h,并經(jīng)突變清除測(cè)試證實(shí)已去除存在的突變細(xì)胞[14-15]。小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞如圖1所示。

圖1 小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞Fig.1 Mouse lymphoma cells L5178Y

1.4 代謝活化系統(tǒng)(大鼠肝S9)

代謝活化系統(tǒng)(大鼠肝S9)是指物質(zhì)本身無毒或毒性較小,在人體內(nèi)經(jīng)過生物轉(zhuǎn)化后,形成的代謝產(chǎn)物毒性增大,甚至產(chǎn)生致癌、致突變和致畸作用的過程。苯巴比妥鈉和β-萘黃酮聯(lián)合應(yīng)用作為誘導(dǎo)劑制備的大鼠肝臟9 kg,經(jīng)離心后所得上清液分裝EP管中,-80 ℃保存?zhèn)溆肹16-17]。實(shí)驗(yàn)S9購自天津市特福瑞環(huán)?？萍加邢薰?生產(chǎn)單位:MoLecuLar ToxicoLgy,Inc.(MOLTOX),保存在-80 ℃冰箱。S9中酶活檢測(cè)[18]如表1所示,S9混合液由S9、MgCl2、KCl、6-磷酸葡萄糖納(G-6-P)、輔酶Ⅱ(NADPNA2)和磷酸鹽緩沖液(PBS)組成,其中S9占總體系的10%(即體積比),最終濃度分別為8 mmol/L的MgCl2、33 mmol/L的KCl、5 mmol/L的G-6-P和4 mmol/L的輔酶Ⅱ。

表1 大鼠肝S9中酶活檢測(cè)

1.5 方 法

1.5.1 小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞給藥質(zhì)量濃度篩選

根據(jù)實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)中的溶解度,選定組間距為2倍,質(zhì)量濃度分別為5 000,2 500,1 250,625,312.5,156.25,78.13 μg/mL,包含最大細(xì)胞毒性至幾乎無細(xì)胞毒性,同時(shí)增設(shè)陰性對(duì)照組(無菌水)[19],且每T25細(xì)胞瓶接種細(xì)胞數(shù)為2×105個(gè)/mL。細(xì)胞活力計(jì)數(shù)(即活細(xì)胞計(jì)數(shù))使用臺(tái)盼藍(lán)染色體法,用計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)活細(xì)胞。各劑量組質(zhì)量濃度的相對(duì)存活率=活細(xì)胞÷陰性對(duì)照組活細(xì)胞。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)樣品的配制

準(zhǔn)確稱量樣品2.5 g,加入5 mL無菌水,混勻后過膜,臨用現(xiàn)配,配制質(zhì)量濃度為500 mg/mL,對(duì)應(yīng)的終質(zhì)量濃度為5 000 μg/mL。將配制好的樣品按2倍梯度逐級(jí)稀釋至配制質(zhì)量濃度分別為250,125,62.5,31.25,15.63,7.81,3.91 mg/mL,對(duì)應(yīng)的終質(zhì)量濃度分別為2 500,1 250,625,312.5,156.25,78.13,39.06 μg/mL,加樣過程中樣品常溫放置,加樣過程應(yīng)不超過12 h[20-22]。對(duì)照品甲磺酸乙酯(終質(zhì)量濃度為10 μg/mL)、環(huán)磷酰胺(終質(zhì)量濃度為3 μg/mL)溶于生理鹽水。

1.5.3 分組給藥

正式實(shí)驗(yàn)以每T25細(xì)胞瓶中加入5 mL的DMEM液(含馬血清10%,雙抗5%)為總體系,實(shí)驗(yàn)樣品按總體系的1%作為加樣量,即0.05 mL/T25細(xì)胞瓶。代謝活化系統(tǒng)為0.5 mL,同時(shí)增設(shè)陽性對(duì)照組,分別為環(huán)磷酰胺(CP)、甲磺酸乙酯(EMS)及陰性對(duì)照組(無菌水)。在50 mL無菌離心管中按照細(xì)胞所需個(gè)數(shù),逐一稀釋、對(duì)照品和10%的S9組分混合液。加樣記錄如表2所示,給藥時(shí)間為3 h。

表2 加樣記錄表

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的細(xì)胞,每T25細(xì)胞瓶確保細(xì)胞數(shù)為5×105個(gè)/mL,在加入受試物或?qū)φ掌泛笤诖x或非代謝活化條件下培養(yǎng)37 ℃、振搖18次/min處理3 h后,以速率為1 000 r/min離心5 min,棄上清,磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后重新加入完全培養(yǎng)液DMEM(含馬血清10%,雙抗5%),并將細(xì)胞調(diào)整為2×105個(gè)/mL[23-24]。

1.5.4PE0(即第0天的平板接種效率)測(cè)定

取培養(yǎng)至3 h后的細(xì)胞懸浮液,作梯度稀釋,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為8 個(gè)/mL,以每孔200 μL加樣量接種在96孔板內(nèi),每個(gè)劑量接種2塊平板,37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)12 d,培養(yǎng)結(jié)束后觀察并計(jì)錄每塊96孔板內(nèi)大小集落數(shù)。

1.5.5 表 達(dá)

將培養(yǎng)3 h的細(xì)胞懸浮液(按1.5.4節(jié)所得細(xì)胞懸浮液)做2 d表達(dá)培養(yǎng),每天計(jì)數(shù),用培養(yǎng)液DMEM(含馬血清10%,雙抗5%)調(diào)整細(xì)胞數(shù),確保每個(gè)劑量實(shí)驗(yàn)組的細(xì)胞數(shù)低于1×106個(gè)/mL,計(jì)算相對(duì)細(xì)胞活力(RSG)。

1.5.6PE2(即第2天的平板接種效率)測(cè)定

取適量按1.5.5節(jié)中表達(dá)結(jié)束的細(xì)胞懸浮液,作梯度稀釋,調(diào)整細(xì)胞為8個(gè)/mL,以每孔200 μL加樣量接種在96孔板內(nèi),每個(gè)劑量接種2塊平板,37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)連續(xù)培養(yǎng)12 d,培養(yǎng)結(jié)束后觀察并計(jì)錄每塊96孔板內(nèi)大小集落數(shù)。

1.5.7MF(即加入TFT后的細(xì)胞突變頻率)測(cè)定

取適量按1.5.5節(jié)中表達(dá)結(jié)束的細(xì)胞懸浮液,調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×104個(gè)/mL,加入三氟胸苷(TFT),混合后以每孔200 μL加樣量接種在96孔板內(nèi),每個(gè)劑量接種2塊平板[25],37 ℃、5%的二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d,培養(yǎng)結(jié)束后觀察并計(jì)錄每塊96孔板內(nèi)大小集落數(shù)[23]。

1.6 分析程序

1.6.1 實(shí)驗(yàn)成立條件

實(shí)驗(yàn)所用小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞的自發(fā)突變頻率為50×10-6～200×10-6;陰性對(duì)照組的平板效率PE0為60%～140%,PE2為70%～130%;陽性對(duì)照組的MF與陰性對(duì)照組有較為明顯的差異[23],即與對(duì)照組的比值至少達(dá)到3倍。

1.6.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)各組別大小集落數(shù)均采用SPSS軟件TTEST檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,實(shí)驗(yàn)各組別與陰性對(duì)照組相比,P>0.05,則認(rèn)為無顯著性差異。陽性對(duì)照組與陰性對(duì)照組相比,*P<0.05,則具有顯著性差異。

平板效率(PE0,PE2)計(jì)算公式為

(1)

式中:EW為無集落生長(zhǎng)的孔數(shù);TW為總孔數(shù);1.6為每孔接種細(xì)胞數(shù)。

相對(duì)存活率(RS)計(jì)算公式為

(2)

式中:PEtg為處理組的平板效率;PEnc為陰性對(duì)照組的平板效率。

相對(duì)懸浮生長(zhǎng)(RSG)計(jì)算公式為

(3)

式中:D2tg為處理組第2天表達(dá)與0天相比的細(xì)胞增殖倍數(shù);D2nc為陰性對(duì)照組第2天表達(dá)與0天相比的細(xì)胞增殖倍數(shù)。

相對(duì)總生長(zhǎng)(RTG)計(jì)算公式為

RTG=(RSG×RSn)×100%

(4)

式中RSn為第2天的相對(duì)存活率。

突變頻率(MF)計(jì)算公式為

(5)

式中:EW為無集落生長(zhǎng)的孔數(shù);TW為總孔數(shù);N為每孔接種細(xì)胞數(shù);PE2為第2天的相對(duì)存活率。

1.6.3 陽性結(jié)果的判定

受試物組只要有一個(gè)劑量及以上(質(zhì)量濃度)組的MF顯著高于陰性對(duì)照組,或是陰性對(duì)照的3倍以上,并且具有劑量依賴性趨勢(shì),結(jié)果可判定為陽性。如果僅在相對(duì)存活率低于20%的高劑量情況下出現(xiàn)陽性,則結(jié)果就判為“可疑”[23]。

1.6.4 陰性結(jié)果的判定

樣品在有或無代謝活化條件下,與陰性對(duì)照相比,各質(zhì)量濃度突變頻率均未見顯著性升高,不能誘發(fā)小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因的突變,故樣品在小鼠淋巴瘤細(xì)胞的TK位點(diǎn)未發(fā)生突變,進(jìn)一步對(duì)可疑結(jié)果應(yīng)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.6.5 集落數(shù)判定

突變集落按照大集落(直徑≥1/4孔徑,密度低)和小集落(直徑<1/4孔徑,密度高)分別計(jì)數(shù),極小集落再繼續(xù)培養(yǎng)3 d后計(jì)數(shù)[26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞給藥質(zhì)量濃度的確定

與陰性對(duì)照組相比,二氫楊梅素對(duì)小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞無明顯的細(xì)胞毒性,在代謝活化系統(tǒng)(+S9)下相對(duì)存活率為87.2%～98.4%,陰性對(duì)照組中活細(xì)胞數(shù)為1.25×106個(gè)/mL;在非代謝活化系統(tǒng)(-S9)下相對(duì)存活率為89.84%～93.75%,陰性對(duì)照組中活細(xì)胞數(shù)為1.28×106個(gè)/mL。根據(jù)二氫楊梅素的溶解度及細(xì)胞毒性結(jié)果,確定以5 000 μg/mL,組間距為2倍,共8個(gè)梯度作為正式實(shí)驗(yàn)劑量,結(jié)果如表3所示。

表3 受試物對(duì)細(xì)胞的毒性

2.2 代謝活化系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在有S9條件下,3 h暴露后,實(shí)驗(yàn)樣品二氫楊梅素質(zhì)量濃度為39.06～5 000 μg/mL劑量范圍內(nèi),樣品二氫楊梅素與陰性對(duì)照相比,各質(zhì)量濃度突變頻率均未見顯著性升高,不能誘發(fā)小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因的突變,故在有代謝活化條件下樣品二氫楊梅素體外哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因突變實(shí)驗(yàn)結(jié)果為陰性,結(jié)果如表4所示。

表4 代謝活化系統(tǒng)(+S9)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 非代謝活化系統(tǒng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在無S9,經(jīng)3 h暴露,樣品二氫楊梅素質(zhì)量濃度為39.06～5 000 μg/mL的條件下與陰性對(duì)照相比,各質(zhì)量濃度突變頻率均未見顯著性升高,不能誘發(fā)小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因的突變。結(jié)果如表5所示。

表5 非代謝活化系統(tǒng)(-S9)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在筆者實(shí)驗(yàn)條件下,陰性對(duì)照-S9的PE0為106.03%,+S9的PE0為111.98%,均在60%～140%;陰性對(duì)照-S9的PE2為155.31%,+S9的PE2為111.98%,均在70%～130%;陰性對(duì)照-S9的MF為52.32×10-6,+S9的MF為51.2×10-6。有代謝活化系統(tǒng)時(shí)陽性對(duì)照的MF是陰性對(duì)照的8.8倍,在無代謝活化系統(tǒng)時(shí)陽性對(duì)照的MF是陰性對(duì)照的11.5倍,故實(shí)驗(yàn)均滿足成立的條件。

樣品二氫楊梅素在有或無代謝活化生產(chǎn)條件下,與陰性對(duì)照相比,各質(zhì)量濃度突變頻率均未見顯著性升高P均大于0.05,不能誘發(fā)小鼠淋巴瘤細(xì)胞基因的突變,故樣品二氫楊梅素細(xì)胞基因突變結(jié)果為不具致突變性。

3 結(jié) 論

在進(jìn)行MLA實(shí)驗(yàn)時(shí),使用小鼠淋巴瘤細(xì)胞L5178Y在MF平板上可以觀察到兩類集落,即大集落和小集落,將直徑大于微孔直徑的1/4的集落稱之為大集落,反之則為小集落。一般認(rèn)為大集落和正常生長(zhǎng)的集落的產(chǎn)生是由于TK基因位點(diǎn)及其附近小范圍的遺傳物質(zhì)改變所引起的,如點(diǎn)突變和小的缺失等;而小集落和緩慢生長(zhǎng)的集落則可能涉及較大范圍的染色體改變,且損傷的范圍可能涉及到較大范圍的染色體改變。TK基因突變實(shí)驗(yàn)已被廣泛用于檢測(cè)外來化合物的遺傳毒性。在前期預(yù)實(shí)驗(yàn)中,采用臺(tái)盼藍(lán)法檢測(cè)在二氫楊梅素的質(zhì)量濃度分別為5 000,2 500,1 250,625,312.5,156.25,78.13 μg/mL條件下對(duì)小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞的毒性作用,結(jié)果表明二氫楊梅素對(duì)小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞存活率均無顯著性降低。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定了二氫楊梅素的最高質(zhì)量濃度設(shè)為5 mg/mL,作為正式實(shí)驗(yàn)最高劑量。結(jié)果表明:在實(shí)驗(yàn)中,隨著給樣質(zhì)量濃度的增加,突變頻率MF與陰性組比并未出現(xiàn)顯著上升趨勢(shì),即P>0.05,表明二氫楊梅素質(zhì)量濃度為39.06～5 000 μg/mL時(shí)未見誘導(dǎo)小鼠淋巴瘤L5178Y細(xì)胞突變率的增加,對(duì)該TK突變實(shí)驗(yàn)無致突變性。當(dāng)前在遺傳領(lǐng)域的評(píng)價(jià)方法中,通常采用體外和體內(nèi)遺傳毒性實(shí)驗(yàn)相結(jié)合的方法,以減少毒性受試物的假陰性結(jié)果。故對(duì)二氫楊梅素的致突變作用,還需要進(jìn)一步通過體內(nèi)或體外的毒理實(shí)驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。