RAB27B在宮頸癌干細(xì)胞中的作用研究

張科 陳潔 毛聿華 豐為 羅敏

1南方醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院（廣州 510515）；2中國人民解放軍南部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院婦產(chǎn)科（廣州 510000）

宮頸癌是育齡期女性常見的惡性腫瘤之一，常規(guī)的治療方法為手術(shù)治療輔以放療、化療或靶向治療等，早期患者獲益較大。近年來，相關(guān)研究［1-2］表明，其高復(fù)發(fā)率及轉(zhuǎn)移率可能與宮頸癌干細(xì)胞有關(guān)，即干細(xì)胞是宮頸癌復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的種子細(xì)胞。因此尋找宮頸癌干細(xì)胞的發(fā)生發(fā)展機(jī)制，為晚期、復(fù)發(fā)及耐藥患者提供更加有效的治療手段意義重大。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤的側(cè)群細(xì)胞（SPs）具有明顯的干性特質(zhì)，較非側(cè)群細(xì)胞（NSPs）具有明顯的增殖、侵襲及成球克隆能力，成為研究干細(xì)胞的一種有效的替代工具。且發(fā)現(xiàn)SP 細(xì)胞高表達(dá)ABCG2，而ABCG2 基因被認(rèn)為是干細(xì)胞標(biāo)志基因，與腫瘤耐藥息息相關(guān)。研究［3］證實(shí)，利用流式分選及無血清細(xì)胞成球培養(yǎng)方法可以從Hela 及Siha 細(xì)胞中分離出SP 細(xì)胞，通過驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)SP 細(xì)胞具有明顯的干性特征，故而將SP 細(xì)胞作為宮頸癌干細(xì)胞的替代細(xì)胞進(jìn)行研究。

RAB 蛋白可以調(diào)節(jié)腫瘤的增殖，與腫瘤的轉(zhuǎn)移、侵襲也有一定的關(guān)系，這種調(diào)節(jié)作用一般通過調(diào)控細(xì)胞囊泡的分泌、轉(zhuǎn)運(yùn)等發(fā)揮作用［4-5］。研究發(fā)現(xiàn)RAB27B 與胰腺癌［6］、前列腺癌［7-8］、乳腺癌［9-10］、卵巢癌［11］、肺癌［12-13］、肝癌［14-15］、食管癌［16］等多種癌癥的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移及耐藥相關(guān)。且文獻(xiàn)表明RAB 蛋白與結(jié)直腸癌干細(xì)胞［17］、乳腺癌干細(xì)胞［18］、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞［19］干性維持具有一定的調(diào)控作用。單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)行相關(guān)差異基因功能富集分析后發(fā)現(xiàn)宮頸癌非側(cè)群細(xì)胞與側(cè)群細(xì)胞相比，與囊泡分泌相關(guān)的RAB27B具有顯著的差異性。故本文通過敲除RAB27B在宮頸癌SP 細(xì)胞中表達(dá)而探討RAB27B 與宮頸癌干細(xì)胞的相關(guān)關(guān)系。同時(shí)，通過單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測序進(jìn)行相關(guān)差異基因分析后發(fā)現(xiàn)宮頸癌非側(cè)群細(xì)胞與側(cè)群細(xì)胞相比，分泌性卷曲蛋白SFRP1 在二者間表達(dá)具有顯著的差異性，且研究發(fā)現(xiàn)RAB 蛋白以GTP 核苷酸依賴的方式介導(dǎo)SFRP1 的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，而Rab?SFRP1?Wnt 軸可以作為減弱肺癌干性的潛在靶點(diǎn)［20］，故本文初步探討RAB27B 與分泌性卷曲蛋白SFRP1 的相互作用，為確定宮頸癌干細(xì)胞的靶向治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源人宮頸癌SiHa 細(xì)胞系，由中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心提供。人宮頸癌SP 細(xì)胞由流式分選側(cè)群細(xì)胞所得。

1.2 主要試劑1999經(jīng)濟(jì)裝三對siRNA?RAB27B+陰性對照+轉(zhuǎn)染對照及RiboFECT CP Transfection Kit（166T）購自銳博生物［4］；CCK8 試劑盒購自南京凱基；q?PCR 試劑購自艾科瑞；引物購自擎科生物；抗體SFRP1、RAB27B 均購自美國proteintech 公司，二抗購自弗德生物。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染接種4×105～20×105個(gè)細(xì)胞至含有適量完全培養(yǎng)基的6 孔板培養(yǎng)孔中，使轉(zhuǎn)染時(shí)的細(xì)胞密度達(dá)到30%～50%。于室溫?zé)o菌超凈臺內(nèi)［5］用30 μL 1X riboFECTTMCP Buffer 稀釋1.25 μL 20 μmol/L siRNA 儲存液，并用移液槍吹打均勻。再于稀釋好的儲存液中加入3 μL riboFECTTMCP Reagent，并混合均勻，室溫條件下靜置15 min。將6 孔板中原培養(yǎng)基吸凈棄去，后加入riboFECTTMCP混合液，上下左右法輕輕混勻。將培養(yǎng)板置于37 ℃的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h。

1.3.2 蛋白免疫印跡法（Western blot）檢測細(xì)胞目的基因的蛋白表達(dá)提取所需樣品細(xì)胞的蛋白并用BCA法測定蛋白濃度；按照30 μg蛋白上樣，室溫條件下進(jìn)行，設(shè)置濃縮膠電壓為80 V，分離膠電壓為120 V，恒壓電泳至溴酚藍(lán)條帶接近膠底部；按照海綿/3 層濾紙/膠/膜/3 層濾紙/海綿的順序進(jìn)行放置，裝配成“三明治”狀，后將整個(gè)轉(zhuǎn)膜槽置于冰水中，打開電源，設(shè)置電流恒定在250～300 mA，按實(shí)際需要調(diào)整時(shí)間為60～120 min；轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂奶粉（1 g 脫脂奶粉+20 mL PBS 配置）室溫封閉1 h，相應(yīng)抗體4 ℃孵育過夜（一抗：標(biāo)準(zhǔn)抗體稀釋液=1∶1 000）；次日PBS 洗滌3 遍，10 min/次；后二抗（二抗原液：封閉液=1∶10 000）［6］室溫孵育1 h 后再次PBS 洗滌；使用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行條帶發(fā)光顯影，選擇β?actin 作為內(nèi)參對照，選擇合適曝光時(shí)間進(jìn)行拍照保存。

1.3.3 q?PCR 檢測細(xì)胞目的基因的mRNA 表達(dá)提取各組細(xì)胞的RNA 并測定濃度；將RNA 產(chǎn)物及5×Evo M?MLVRT Master Mix 配制成為10 μL 體系后，在PCR 儀上以37 ℃15 min，85 ℃5 s 完成RNA反轉(zhuǎn)錄cDNA；將cDNA、目標(biāo)分子上下游引物、2×SYBR?GreenProTaqHSPremix 按照比例混合，再在real time 7500 fast 儀器上以95 ℃5 s 、58 ℃20 s 、72 ℃30 s 共40 個(gè)循環(huán)的程序完成qPCR。（RAB27B上游引物序列：GACACTGCGGGACAAGAGC，下游引物序列：CTTGCCGTTCATTGACTTCC；SFRP1 上游引物序列：5'?CTTCTACTGGCCCGAGATGCTT?3'，下游引物序列：5'?ATGGCCTCAGATTTCAACT?CGT?3'；GAPDH 上游引物序列：5'?CAGTCAGCCG?CATCTTCTT?3'，下游引物序列：5'?GACAAGCTTC?CCGTTCTCAG?3'。）

1.3.4 Transvell 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞侵襲能力將轉(zhuǎn)染NC 及si 片段48 h 的細(xì)胞收集并計(jì)數(shù)，接種2 × 105細(xì)胞/200 μL 于Transwell 小室內(nèi)，小室外24 孔板內(nèi)加入500 μL 的完全培養(yǎng)基，37 ℃的CO2恒溫馥孵育箱孵育24 h 后取出24 孔板，將小室置于PBS 中輕輕漂洗，并用棉球?qū)⑽⒖啄ど蠈蛹?xì)胞輕輕拭去，后置于4%多聚甲醛中固定20 min；PBS 中輕輕漂洗并吸水紙吸干；后置于0.5%結(jié)晶紫（PBS 配［7］置）染色20 min；PBS 中輕輕漂洗并晾干，顯微鏡下觀察并取多個(gè)視野拍照計(jì)數(shù)。

1.3.5 CCK8 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖能力將轉(zhuǎn)染NC及si 片段48 h 的細(xì)胞收集并計(jì)數(shù)，接種3 000 個(gè)細(xì)胞到96 孔板中，加入100 μL 完全培養(yǎng)基，37 ℃的CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)過夜。后于室溫?zé)o菌超凈臺內(nèi)將96 孔板待測孔中原培養(yǎng)基吸凈棄去，并于待測孔中加入100 μL 溶液（10 μL CCK8 試劑+90 μL 全培溶液配制），注意配制及加樣過程應(yīng)全程避光，后置于5%CO237 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1 h，用酶標(biāo)儀避光條件下測定細(xì)胞在450 nm處的吸光度值［8］。并于第2、3、4、5 天同樣操作測吸光度。

1.3.6 平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的克隆形成能力將各組細(xì)胞接種于6 孔板中，接種細(xì)胞數(shù)目為3 000個(gè)/孔，完全培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)［9］，4 d 更換一次培養(yǎng)基，接種14 d 后，洗滌、固定、染色，隨后用數(shù)碼照相機(jī)拍照。

1.3.7 免疫熒光檢測RAB27B 及SFRP1 的表達(dá)及細(xì)胞亞定位情況 取出樣品，用無菌PBS 緩沖液搖床上洗滌2～3 次，每次5 min；4%多聚甲醛固定15 min；1%BSA/0.5%Triton X?100 配置的通透液通透封閉30 分鐘。用抗體稀釋緩沖液（1XPBS/1%BSA/0.3% Triton X?100）配制RAB27B、SFRP1 一抗溶液，摸索最佳濃度均為1∶200，倒掉孔中通透封閉液，適量PBS 洗滌，每個(gè)孔中加入配制好的一抗溶液200 μL，于4 ℃冰箱孵育過夜。次日，將孔中一抗溶液按標(biāo)簽回收，PBS 緩沖液搖床洗滌，每次5 min，共3 次。后加入抗體稀釋緩沖液配制好的熒光二抗，室溫避光孵育1 h，PBS 緩沖液洗滌3 次，共15 min。洗滌后DAPI 核染色劑避光孵育10 min，洗滌后加入防熒光淬滅劑，熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.3.8 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）檢測細(xì)胞分泌SFRP1 水平加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品后37 ℃孵育2 h；棄去液體，加生物素標(biāo)記抗體工作液，37 ℃孵育1 h；洗板后加HRP 標(biāo)記親和素工作液，37 ℃孵育1 h；洗板后加底物溶液，37 ℃孵育15 min；加終止液，終止反應(yīng)5 min 內(nèi)用標(biāo)儀檢測450 nm 波長處的光密度值。

1.3.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料經(jīng)正態(tài)性檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用t檢驗(yàn)；以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Western blot 檢測SP 細(xì)胞RAB27B 敲除后目的基因蛋白表達(dá)情況通過Western blot 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)SP 細(xì)胞轉(zhuǎn)染si?RAB27B 48 h 后，RAB27B 蛋白表達(dá)量為SP?NC 組（2.86 ± 0.06）vs.SP?R3 組（1.03 ±0.02）；SFRP1 蛋白表達(dá)量為SP?NC 組（1.75 ± 0.06）vs.SP?R3 組（0.91 ± 0.02），差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01，圖1）。

圖1 Western blot 檢測目的蛋白表達(dá)情況Fig.1 The expression of target protein was detected by Western blot

2.2 qPCR 法檢測SP 細(xì)胞RAB27B 敲除前后RAB27B、SFRP1 的表達(dá)情況qPCR 法檢測發(fā)現(xiàn)SP 細(xì)胞中RAB27B 表達(dá)量：SP?NC 組（1.0 ± 0.02）vs.SP?R3 組（0.449 3±0.026 4）；SFRP1 表達(dá)量：SP?NC 組（1.0 ± 0.02）vs.SP?R3 組（0.390 5±0.027 0）。差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P< 0.01）。結(jié)果與West?ern blot 結(jié)果相一致。見圖2。

圖2 SP 細(xì)胞RAB27B 敲除前后RAB27B、SFRP1 的mRNA表達(dá)情況Fig.2 mRNA expression of RAB27B and SFRP1 in SP cells before and after RAB27B deletion

2.3 Transwell 法檢測SP 細(xì)胞敲除RAB27B 前后侵襲能力的變化Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測敲除宮頸癌SP 細(xì)胞RAB27B 后，與NC 組比較，腫瘤細(xì)胞穿過小室膜的細(xì)胞數(shù)目的對比變化（圖3）。結(jié)果顯示，SP?NC 組（290 ± 3.215）vs.SP?R3 組（162 ± 1.856），表明RAB27B 敲除后SP 細(xì)胞穿過小室膜的數(shù)目明顯減少，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 70.76，P<0.005）。提示RAB27B 能提高宮頸癌SP 細(xì)胞的體外遷移能力，與腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)。

圖3 敲低RAB27B 對宮頸癌SP 細(xì)胞侵襲能力影響Fig.3 Effect of RAB27B knockdown on invasion ability of CERVICAL cancer SP cells

2.4 CCK8 法檢測敲除RAB27B 對宮頸癌SP 細(xì)胞生長的影響將si?RNA RAB27B 及NC?RAB27B轉(zhuǎn)染SP 細(xì)胞48 h 后鋪板，在37 ℃、5% CO2條件下分別培養(yǎng)1、2、3、4、5 d后測OD值發(fā)現(xiàn)（圖4），SP?NC 組（2.476 ± 0.058）vs.SP?R3 組（1.004 ± 0.050），差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 25.3，P< 0.005）。表明RAB27B 敲除后SP 細(xì)胞增值能力明顯下降。提示RAB27B 可能在促進(jìn)宮頸癌干細(xì)胞增殖方面發(fā)揮重要作用。

圖4 敲低RAB27B 對宮頸癌SP 細(xì)胞增殖的影響Fig.4 Effect of RAB27B knockdown on proliferation of cervical cancer SP cells

2.5 平板克隆檢測敲除RAB27B 對宮頸癌腫瘤細(xì)胞克隆形成能力的影響平板克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在敲除RAB27B 后，宮頸癌SP 細(xì)胞的增殖成球能力降低（圖5），SP?NC 組（21±0.065）vs.SP?R3 組（10 ± 0.023），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t= 9.526，P=0.011），RAB27B 敲低組的細(xì)胞克隆數(shù)明顯減少，細(xì)胞成球克隆能力明顯下降。即RAB27B 可以促進(jìn)宮頸癌SP 細(xì)胞形成更多細(xì)胞集落，在宮頸癌干細(xì)胞轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及放化療抵抗方面可能發(fā)揮重要作用。

圖5 敲低RAB27B 對宮頸癌SP 細(xì)胞平板克隆形成能力的影響Fig.5 Effect of RAB27B knockdown on plate clon?forming ability of cervical cancer SP cells

2.6 RAB27B、SFRP1 細(xì)胞熒光定位通過免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)RAB27B 在SP 細(xì)胞中主要定位于細(xì)胞核中，在細(xì)胞質(zhì)中也有少量表達(dá)。SFRP1在SP細(xì)胞中也主要定位于細(xì)胞核（圖6）。

2.7 ELISA 酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測RAB27B 敲除后SFRP1的外分泌變化通過酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RAB27B 敲除后的SP 細(xì)胞分泌SFRP1 的能力下降。SP?NC組SFRP1外分泌值為（19.38±0.43）ng/mLvs.SP?si?R3 組（10.66± 0.25）ng/mL，P= 0.008。見圖6。

圖6 RAB27B、SFRP1 細(xì)胞熒光定位Fig.6 Fluorescence localization of RAB27B、SFRP1 cells

3 討論

宮頸癌作為我國女性常見癌癥之一，具有較高的復(fù)發(fā)率及死亡率［1］。隨著宮頸癌篩查的普及，其發(fā)生率有所降低，但對于晚期、復(fù)發(fā)及耐藥患者仍無十分有效的治療手段。越來越多的研究表明，腫瘤的復(fù)發(fā)、耐藥與腫瘤干細(xì)胞高度相關(guān)［2］，且研究發(fā)現(xiàn)RAB 蛋白可以介導(dǎo)乳腺癌干細(xì)胞［18］、膠質(zhì)瘤干細(xì)胞［19］、肺癌干細(xì)胞［20］等干性維持，與結(jié)腸癌等耐藥亦息息相關(guān)［17］。

前期前期單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)測序研究發(fā)現(xiàn)，在宮頸癌SP 細(xì)胞中高表達(dá)而在NSP 細(xì)胞中低表達(dá)，表明RAB27B 在宮頸癌干細(xì)胞中高表達(dá)。且通過查閱TCGA 數(shù)據(jù)庫可知，RAB27B 在正常宮頸組織中低表達(dá)而在宮頸癌組織中高表達(dá)，表明RAB27B在宮頸癌中發(fā)揮促癌基因作用，可以促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)RAB27B 與多種癌癥干細(xì)胞的干性維持密切相關(guān)［18-20］，故本文作者推測RAB27B 在宮頸癌干細(xì)胞的發(fā)生機(jī)制中起著重要作用。

圖7 ELISA 法檢測RAB27B 敲除前后SFRP1 分泌情況變化Fig.7 Changes of SFRP1 secretion before and after RAB27B knockout were detected by ELISA

因?yàn)槟壳皩τ趯m頸癌干細(xì)胞并沒有標(biāo)準(zhǔn)的分離鑒定方法，故本文作者選用流式分選出的具有干性特征的SP細(xì)胞作為研究對象［3］。通過RAB27B 敲低片段及對照片段轉(zhuǎn)染48 h 后進(jìn)行體外相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RAB27B 敲低后的宮頸癌SP 細(xì)胞增殖、侵襲遷移及平板克隆能力明顯降低，進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)RAB27B 在宮頸癌SP 細(xì)胞中具有重要的作用，可以促進(jìn)宮頸癌干細(xì)胞干性能力的增強(qiáng)。在肺癌干細(xì)胞中，RAB37 與SFRP1 共定位于相同囊泡中，且RAB37 以GTP 核苷酸依賴方式介導(dǎo)SFRP1 的轉(zhuǎn)運(yùn)和分泌，故在宮頸癌SP 細(xì)胞中，RAB27B 也可能通過調(diào)控囊泡的分泌而調(diào)節(jié)SFRP1 的分泌。免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RAB27B 與SFRP1 在SP 細(xì)胞中都主要定位于細(xì)胞核，且TCGA 數(shù)據(jù)庫顯示，RAB27B與SFRP1 在宮頸癌中表達(dá)具有一定相關(guān)性，結(jié)合RAB27B 敲低前后SFRP1 蛋白含量及mRNA 含量變化可知，RAB27B 對于SFRP1 的表達(dá)具有一定的調(diào)節(jié)作用。文獻(xiàn)表明，SFRP1 通過WNT、EMT 等多條信號通路對宮頸癌的發(fā)生發(fā)展起到一定的調(diào)節(jié)作用［21-22］。故RAB27B 可能通過調(diào)節(jié)SFRP1 的表達(dá)而對宮頸癌干細(xì)胞干性的維持起到調(diào)控作用。

目前，本文發(fā)現(xiàn)RAB27B 對于宮頸癌干細(xì)胞的增殖、侵襲具有一定的調(diào)節(jié)作用，且文獻(xiàn)表明，RAB 蛋白與多種癌癥的干性維持及耐藥密切相關(guān)［17-19］，故RAB27B 可能成為宮頸癌患者預(yù)后標(biāo)志物及新的治療靶點(diǎn)，可以針對RAB27B 設(shè)計(jì)靶向藥物或者RAB27B 高效安全的抑制劑來抑制宮頸癌干細(xì)胞的存活，從而延長晚期復(fù)發(fā)患者的生存時(shí)間。本文僅在體外細(xì)胞水平驗(yàn)證RAB27B 的作用，并沒有在體內(nèi)小鼠身上進(jìn)一步驗(yàn)證。眾所周知，動物體內(nèi)微環(huán)境是一個(gè)復(fù)雜動態(tài)平衡的過程，由多種機(jī)制共同調(diào)控［4］，是否RAB27B 在動物體內(nèi)發(fā)揮同樣的功效有待研究，后續(xù)可以設(shè)計(jì)皮下成瘤、肝轉(zhuǎn)移及類器官模型加以驗(yàn)證。此外，下一步需要過表達(dá)及敲低SFRP1 觀察宮頸癌干細(xì)胞的干性及RAB27B 的表達(dá)水平變化情況，進(jìn)一步證實(shí)RAB27B 與SFRP1 在宮頸癌干細(xì)胞中相關(guān)關(guān)系。