2型糖尿病小鼠模型建立影響因素研究

代振振,張義堡,崔偉豪,袁海峰,劉穎,徐宏偉

(1 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,山東 青島 266021； 2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬新華醫(yī)院兒童骨科)

近年來，隨著人口老齡化及人們生活水平的提高，糖尿病的患病率逐年升高[1-2]。國際糖尿病聯(lián)合會(IDF)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，2014年我國糖尿病病人達(dá)到9 629萬，我國已成為全球糖尿病患病人數(shù)最多的國家，其中2型糖尿病占93.7%[3]。2型糖尿病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，至今仍未完全闡明。因此，建立理想的2型糖尿病動物模型，已經(jīng)成為深入研究2型糖尿病發(fā)病機(jī)制、藥物治療、預(yù)防及其并發(fā)癥轉(zhuǎn)歸等的重要途徑和手段[4]。鼠類因具有經(jīng)濟(jì)易得、便于飼養(yǎng)等優(yōu)勢，成為制備糖尿病動物模型的優(yōu)先選擇。高糖高脂飲食聯(lián)合鏈脲佐菌素(STZ)或四氧嘧啶注射，是國內(nèi)外學(xué)者建立2型糖尿病鼠類模型廣泛采用的方法，但對于高脂飲食飼喂時間、STZ使用劑量等目前尚無統(tǒng)一的操作標(biāo)準(zhǔn)，這將對2型糖尿病的深入研究產(chǎn)生不利影響[5-6]。本研究采用高糖高脂飲食聯(lián)合STZ腹腔注射方法建立2型糖尿病小鼠模型，并對模型建立影響因素進(jìn)行系統(tǒng)觀察。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

血清胰島素酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測試劑盒和STZ均購自北京Solarbio科技有限公司，肝糖原檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所，檸檬酸和檸檬酸鈉均為國產(chǎn)分析純；高糖高脂飼料為自行配制(豬油10.0%，蔗糖20.0%，蛋黃粉15.0%，膽固醇1.2%，豬膽鹽0.2%，鼠維持飼料53.6%，均為國產(chǎn))；Accu-Chek Performa羅氏卓越血糖儀和血糖檢測試紙(上海羅氏檢測產(chǎn)品有限公司)，ELx 808型酶標(biāo)儀(美國BioTek公司)，7600型全自動生化分析儀(日本日立公司)。

1.2 10 g/L STZ溶液配制

稱取檸檬酸2.10 g，加入雙蒸水100 mL中配成A液；稱取檸檬酸鈉2.94 g，加入雙蒸水100 mL中配成B液。將A液與B液以1∶1混合制備檸檬酸緩沖液，調(diào)節(jié)pH值至4.2～4.4。稱取1.0 g STZ，加入檸檬酸緩沖液至100 mL溶解。配好的溶液置冰上保存，在30 min內(nèi)注射完畢。

1.3 模型建立與分組

取昆明種小鼠60只，體質(zhì)量(26±2)g，購自山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司，動物合格證號為SCXK(魯)20130001。其中雄性40只，隨機(jī)分為4組，包括正常對照組(A組)和低、中、高劑量STZ(60、90、120 mg/kg)組(B～D組)；雌性20只，隨機(jī)分為2組，包括正常對照組(E組)和高劑量STZ(120 mg/kg)組(F組)。普通飼料適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，每籠隨機(jī)取5只小鼠，禁食不禁水12 h，尾靜脈取血檢測空腹血糖，作為該批次小鼠的基礎(chǔ)血糖值。正常對照組(A、E組)小鼠繼續(xù)飼喂普通飼料，不同劑量STZ組(B、C、D、F組)小鼠改為飼喂高糖高脂飼料，喂養(yǎng)30 d后，不同劑量STZ組小鼠腹腔注射相應(yīng)劑量的STZ溶液，正常對照組小鼠腹腔注射檸檬酸緩沖液。繼續(xù)喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水12 h，再次檢測尾血血糖，血糖值≥16.7 mmol/L即為建模成功。對未成模小鼠再次注射同劑量的STZ，1周后測定空腹血糖，注射3次STZ仍未成模者視為未成模。統(tǒng)計(jì)各組小鼠成模率及死亡率。

1.4 觀察指標(biāo)及其檢測方法

對成模小鼠(模型組)持續(xù)觀察6周，分別于第2、4、6周末測定空腹血糖水平，并于第6周末進(jìn)行糖耐量分析。模型組小鼠喂養(yǎng)6周后，禁食12 h，摘取眼球取眼眶血，檢測血清脂質(zhì)代謝、胰島素、糖化血紅蛋白(HbA1c)水平；迅速摘取肝臟，檢測肝糖原含量。正常對照組小鼠于相同時間檢測上述生化指標(biāo)。

1.4.1空腹血糖檢測 采集尾血，采用羅氏血糖儀測定各組小鼠空腹血糖水平。

1.4.2糖耐量實(shí)驗(yàn) 各組小鼠禁食12 h，測定給葡萄糖前(0 h)血糖值，灌胃給予2.5 g/kg葡萄糖，檢測小鼠給葡萄糖后0.5、2.0 h血糖值，計(jì)算血糖曲線下面積。血糖曲線下面積=[(0 h血糖+0.5 h血糖)×0.5]/2+[(2.0 h血糖+0.5 h血糖)×1.5]/2。

1.4.3血清脂質(zhì)代謝水平檢測 采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)及低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.4.4血清HbA1c和胰島素水平檢測 采用全自動生化分析儀檢測各組小鼠血清HbA1c含量，采用ELISA法檢測血清胰島素水平，嚴(yán)格按照試劑盒說明進(jìn)行操作。計(jì)算胰島素敏感指數(shù)(ISI)，ISI=Ln 1/(血糖×胰島素)。

1.4.5肝糖原含量檢測 摘取肝臟后制備100 g/L肝組織勻漿，采用比色法檢測肝糖原含量，嚴(yán)格按試劑盒說明進(jìn)行操作。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

正常對照組小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛順滑有光澤；模型組小鼠觀察6周顯示，其皮毛暗淡無光且雜亂，進(jìn)食進(jìn)水量及尿量逐漸增多，體質(zhì)量增長速度較正常對照組有稍微減緩的趨勢。

2.2 STZ注射后小鼠成模率及死亡率

雄性小鼠給予劑量60 mg/kg STZ注射3次均未有成模者，亦未見小鼠死亡；雄性小鼠給予劑量90 mg/kg STZ初次注射成模率達(dá)到30%，再次注射成模率略有增高，同時出現(xiàn)了小鼠死亡情況；雄性小鼠給予劑量120 mg/kg STZ初次注射成模率即達(dá)到80%，但也出現(xiàn)小鼠死亡情況；雌性小鼠給予劑量120 mg/kg STZ初次注射成模率達(dá)到40%，再次注射成模率略有增高，同時小鼠死亡率明顯升高，達(dá)到70%。初次注射時，注射120 mg/kg STZ雄性小鼠成模率明顯高于注射120 mg/kg STZ的雌性小鼠(χ2=27.47，P<0.05)；第2次及第3次注射時，注射120 mg/kg STZ雌性小鼠死亡率均明顯上升，明顯高于其他組小鼠(χ2=15.56、26.88，P<0.05)，最終累計(jì)成模率明顯低于注射120 mg/kg STZ的雄性小鼠(χ2=27.99、27.47，P<0.05)。見表1～3。

表1 初次注射STZ各組小鼠成模率及死亡率(n=10)

表2 第2次注射STZ各組小鼠累計(jì)成模率及死亡率(n=10)

表3 第3次注射STZ各組小鼠累計(jì)成模率及死亡率(n=10)

2.3 糖尿病模型小鼠血糖穩(wěn)定性

雄性及雌性模型小鼠在成模后2、4、6周時的血糖值均穩(wěn)定在16.7 mmol/L以上，且無明顯波動(P>0.05)，無自愈情況出現(xiàn)。與同性別正常對照組相比，模型組小鼠在0、2、4、6周時的血糖值明顯增高(F=186.31～716.37，P<0.05)。見表4。

表4 對照組和模型組小鼠血糖水平比較

2.4 糖尿病模型小鼠糖耐量變化

補(bǔ)充葡萄糖0.5、2.0 h后，與正常對照組比較，模型組小鼠血糖峰值顯著增高，且下降緩慢，血糖曲線下面積顯著增加，糖耐量明顯降低，差異具有顯著性(F=298.81～600.40，P<0.05)。見表5。

表5 對照組和模型組小鼠糖耐量比較

2.5 糖尿病模型小鼠血清脂質(zhì)代謝水平變化

與正常對照組比較，模型組小鼠血清TG、TC及LDL-C含量均明顯升高，差異均具有顯著性(t=4.58～18.16，P<0.05)；兩組小鼠血清HDL-C水平比較差異無顯著性(P>0.05)。見表6。

表6 對照組和模型組小鼠的脂質(zhì)代謝水平比較

2.6 糖尿病模型小鼠血清HbA1c和胰島素水平以及ISI變化

與正常對照組比較，模型組小鼠血清HbA1c含量明顯升高，ISI明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.79～6.87，P<0.05)；而兩組胰島素水平比較差異無顯著性(P>0.05)。見表7。

2.7 糖尿病模型小鼠肝糖原含量變化

與正常對照組相比較，模型組小鼠肝糖原含量明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=6.63、3.79，P<0.05)。見表7。

表7 對照組和模型組小鼠HbA1c、胰島素、ISI和肝糖原水平比較

3 討 論

2型糖尿病又稱為非胰島素依賴型糖尿病，該病以胰島素分泌絕對或相對不足及胰島素抵抗為主要特征，在此基礎(chǔ)上建立的誘發(fā)性2型糖尿病動物模型得到研究者廣泛應(yīng)用[7]。有研究者利用沙鼠、C57BL/6J小鼠，通過單純高脂高糖飲食誘導(dǎo)的方法成功建立了2型糖尿病模型，但這類模型由于來源困難、價格昂貴、飼養(yǎng)環(huán)境要求高或成模時間長等原因，尚未在國內(nèi)普及[8-9]。部分學(xué)者采用一次大劑量或多次小劑量注射四氧嘧啶及STZ等化學(xué)誘導(dǎo)劑的方法，亦成功建立了2型糖尿病動物模型，但由于該類模型發(fā)病機(jī)制更接近1型糖尿病，近年來已少見應(yīng)用。目前，高糖高脂飲食聯(lián)合化學(xué)藥物誘導(dǎo)成為建立2型糖尿病動物模型的常用方法[4-6]。該類模型不僅具備了人類2型糖尿病的兩大特點(diǎn)(胰島素抵抗及胰島素分泌障礙)，而且大大縮短了成模周期，更有利于2型糖尿病相關(guān)研究工作的開展。

本實(shí)驗(yàn)采用先喂食高糖高脂飼料再進(jìn)行STZ腹腔注射的方法成功建立2型糖尿病小鼠模型。為了深入探討2型糖尿病小鼠模型建立影響因素，本實(shí)驗(yàn)對STZ作用劑量、作用次數(shù)、作用時間及小鼠不同性別等因素對成模率及模型穩(wěn)定性的影響進(jìn)行了系統(tǒng)觀察。

2型糖尿病的發(fā)生與糖脂代謝紊亂密切相關(guān)，肥胖和高能量膳食攝入均可誘發(fā)胰島素抵抗，將大大增加2型糖尿病發(fā)病風(fēng)險[2]。本實(shí)驗(yàn)采用含糖量20%、脂肪含量10%的高糖高脂飼料喂食小鼠，結(jié)果顯示，模型組小鼠血清TG、TC及LDL-C水平均顯著高于正常對照組，符合人類2型糖尿病脂質(zhì)代謝紊亂特點(diǎn)。

四氧嘧啶和STZ均作為特異性胰島β細(xì)胞毒性藥物用于2型糖尿病動物模型的建立。其中STZ是一種氨基葡萄糖-亞硝基脲，在結(jié)構(gòu)上與葡萄糖分子具有較高的相似性，能被胰島β細(xì)胞中葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白2(GLUT2)特異性識別并轉(zhuǎn)運(yùn)至β細(xì)胞中。STZ是一種DNA烷化劑，可特異性誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞發(fā)生DNA損傷等毒性反應(yīng)，導(dǎo)致胰島素分泌不足或生物學(xué)活性受損[4]。與四氧嘧啶相比，STZ對β細(xì)胞的毒性作用更溫和，在建立2型糖尿病動物模型過程中被廣泛采用[10-11]。本實(shí)驗(yàn)在高糖高脂飼料喂食小鼠30 d后，分別給予60、90、120 mg/kg STZ腹腔注射，結(jié)果表明，60、90 mg/kg STZ注射不易形成2型糖尿病模型，而120 mg/kg STZ較為適宜用于2型糖尿病模型建立。各劑量STZ經(jīng)多次注射，成模率均未見明顯提高，但小鼠死亡率卻有所增加，提示2型糖尿病模型建立可能主要與初次注射劑量有關(guān)。此外，在糖尿病模型實(shí)驗(yàn)動物性別的選擇方面，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，雄性小鼠要優(yōu)于雌性小鼠，與相關(guān)文獻(xiàn)報道一致[12]。VITAL等[13]的研究結(jié)果顯示，與雄性糖尿病小鼠相比，在相同的生長發(fā)育階段，雌性糖尿病小鼠胰腺組織的紊亂更為明顯，從而造成了更嚴(yán)重的機(jī)體功能學(xué)改變及代謝紊亂，這可能是在相同的造模條件下，雌性小鼠死亡率明顯高于雄性小鼠的原因之一。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明，成模后糖尿病小鼠模型穩(wěn)定且持久，不會出現(xiàn)自愈情況。

在2型糖尿病發(fā)病過程中，相關(guān)生化指標(biāo)會出現(xiàn)一定變化，臨床上以糖耐量明顯降低、胰島素敏感性下降為主，同時HbA1c及肝糖原水平亦發(fā)生異常改變[14-17]。其中，HbA1c在體內(nèi)合成過程相對緩慢且不可逆，其合成速率與紅細(xì)胞所處環(huán)境中糖的濃度呈正比[17]。而肝糖原對機(jī)體血糖具有調(diào)節(jié)作用，其合成和分解受胰島素控制，當(dāng)胰島素分泌不足或發(fā)生胰島素抵抗時，胰島素對肝糖原的控制能力降低，可導(dǎo)致肝糖原分解增多、含量減少。胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病重要原因之一[18-19]。ISI是描述胰島素抵抗程度的重要指標(biāo)[20]，ISI越低，則胰島素抵抗程度越高。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與正常對照組比較，成模小鼠糖耐量、ISI和肝糖原含量顯著降低，血清HbA1c水平顯著升高，均較符合2型糖尿病主要表型特征和發(fā)病過程，提示2型糖尿病小鼠模型建立成功。成模小鼠胰島素水平與正常對照組比較稍有增高，分析原因可能為，喂食高糖高脂飼料后，胰島素分泌量在基礎(chǔ)水平之上，而STZ對胰島β細(xì)胞的殺傷作用溫和[11]。雖然成模小鼠胰島素水平較正常對照組未有顯著降低，但I(xiàn)SI卻較正常對照組顯著降低，表明胰島素生物活性明顯受損。

綜上所述，STZ單次注射劑量和小鼠性別對2型糖尿病模型成功建立具有一定影響。選用雄性小鼠，通過高糖高脂飲食聯(lián)合一次性120 mg/kg STZ腹腔注射方法建立的糖尿病模型，較為符合人類2型糖尿病特點(diǎn)，可用于2型糖尿病的相關(guān)研究。