微小RNA在原發(fā)性膽汁性膽管炎發(fā)病機(jī)制和診療中的作用

潘仕達(dá)，蘇 楠，左焱玫，王福生，孟繁平

原發(fā)性膽汁性膽管炎（primary biliary cholangitis,PBC）是一種自身免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性、膽汁淤積性肝臟疾病[1]，目前發(fā)病機(jī)制不明[2]。膽管上皮細(xì)胞損傷及碳酸氫鹽傘受損在PBC的發(fā)病過程中較為關(guān)鍵[3]。臨床上主要以生物化學(xué)指標(biāo)升高、抗線粒體抗體陽性或肝臟組織病理學(xué)改變作為該病的診斷標(biāo)準(zhǔn)。

微小RNA（microRNA, miRNA）是一種長度為19～25個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小分子RNA，可通過與靶基因結(jié)合干擾mRNA翻譯[4]，且其異常表達(dá)與包括腫瘤、自身免疫病及感染性疾病在內(nèi)的多種疾病密切相關(guān)[5-11]。據(jù)報(bào)道，miRNA在PBC患者的肝組織和血清中有顯著變化[12-15]，通過下游因子介導(dǎo)膽道損傷和免疫失調(diào)。其中，miRNA可介導(dǎo)膽管功能障礙，抑制膽管細(xì)胞增殖，造成肝臟纖維化。此外，miRNA也可影響機(jī)體自身抗體分泌，通過抑制調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞（regulatory T cell,Treg）、誘導(dǎo)輔助性T淋巴細(xì)胞（T helper cell, Th）增加、促進(jìn)CD4+T細(xì)胞活化、調(diào)節(jié)外泌體介導(dǎo)免疫反應(yīng)等方式參與PBC發(fā)病機(jī)制。不同miRNA表達(dá)差異也在PBC的診斷和病情評(píng)估中發(fā)揮作用[16]。本文將綜述miRNA在PBC機(jī)制調(diào)控、診斷和治療中的研究進(jìn)展，為PBC相關(guān)miRNA研究提供思路。

1 miRNA與PBC發(fā)病機(jī)制

PBC的主要發(fā)病機(jī)制為免疫細(xì)胞被過度活化而特異性攻擊小膽管細(xì)胞，導(dǎo)致膽管細(xì)胞功能障礙和膽道損傷。在PBC患者中有＞200個(gè)miRNA表達(dá)存在異常，miRNA與PBC患者的免疫失調(diào)和膽道損傷具有重要的聯(lián)系[12，16]。詳見表1。

表1 參與PBC發(fā)病機(jī)制的miRNAsTable 1 miRNAs involved in PBC pathogenesis

1.1 miRNA介導(dǎo)PBC的膽管細(xì)胞功能障礙及膽道損傷 PBC患者中不同miRNA表達(dá)差異可介導(dǎo)靶基因促進(jìn)膽道炎癥、細(xì)胞凋亡和氧化應(yīng)激[12]，如 miR-506、miR-26a、miR-34、miR-125b、miR-139-5p等。其中，miR-506是參與PBC發(fā)病最重要的miRNA之一。膽管細(xì)胞頂膜的Cl-/HCO-3陰離子交換蛋白2（anion exchanger 2, AE2）能使細(xì)胞內(nèi)HCO3-進(jìn)入膽道，維持膽管上皮細(xì)胞（biliary epithelial cell, BEC）的碳酸氫鹽傘，保護(hù)BEC免受有害膽汁酸影響[34-35]。而PBC患者膽管細(xì)胞中過表達(dá)的miR-506可與AE2結(jié)合，抑制其表達(dá)和轉(zhuǎn)染，損傷膽管細(xì)胞，使其分泌功能受損[16]。IL-8、IL-12和TNF-a等促炎因子可促進(jìn)miR-506表達(dá)，增強(qiáng)細(xì)胞應(yīng)激和對(duì)膽汁酸的敏感性，并誘導(dǎo)膽管細(xì)胞產(chǎn)生PBC樣特性，促進(jìn)免疫激活[19]。miR-506參與III型肌醇1, 4, 5-三磷酸受體（type Ⅲ isoform of the inositol 1, 4,5-trisphosphate receptor, InsP3R3）對(duì)膽汁碳酸氫鹽分泌的調(diào)節(jié)過程[18-19，35]。InsP3R3表達(dá)下調(diào)可導(dǎo)致胞內(nèi)Ca2+信號(hào)傳導(dǎo)和碳酸氫鹽分泌障礙[36]，而miR-506可特異性結(jié)合InsP3R3導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Ca2+釋放減少，引發(fā)膽汁淤積[16，18]。

此外，PBC中上調(diào)的miR-26a可降低多梳家族蛋白EZH2表達(dá)，抑制Bmi1對(duì)膽管細(xì)胞的增 殖[26，37]。 上 調(diào)的 miR-34a，miR-132 可 能 導(dǎo)致Nrf2/Keap1軸異常，影響正常氧化應(yīng)激[23]，而miR-34a還通過轉(zhuǎn)化生長因子（transforming growth factor, TGF）-β1/smad通路靶向轉(zhuǎn)化生長因子β同源誘導(dǎo)因子-2（transforming growth factor-beta-induced factor homeobox 2, TGIF2）促進(jìn)PBC中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和肝纖維化[31]。同樣介導(dǎo) TGF-β1 的 miR-125b則通過TGF-β1/TGF-β1R/血管內(nèi)皮生長因子-A通路影響膽道衰老與肝纖維化[17]。高表達(dá)的 miR-139-5p通過 c-FOS/NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)TNF-α水平升高，加重PBC炎性反應(yīng)[27]。然而也有研究報(bào)道稱通過JNK-FOXO3通路上調(diào)miR-34b/c可防止肝纖維化[33]。

miR-191-3p、miR-21、miR-210等 miRNAs的異常表達(dá)可影響膽汁代謝。在PBC患者中，miR-191-3p下調(diào)促進(jìn)肢體表達(dá) 1樣蛋白表達(dá)，促進(jìn)膽汁淤積性肝損傷，而過表達(dá)miR-191-3p可負(fù)性調(diào)控其靶基因肝受體同源物-1表達(dá)，抑制Cyp7a1和Cyp8b1表達(dá)，降低膽汁酸水平，減輕肝損傷[32]。此外，miR-21、miR-210也與壞死性凋亡和膽汁淤積有關(guān)，它們通過周期依賴性激酶2相關(guān)蛋白1或法尼酯X受體轉(zhuǎn)錄共激活因子—混合型白血病組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶4促進(jìn)肝細(xì)胞壞死變性和膽汁淤積[21，38-40]。其中，miR-21還與PBC中的免疫細(xì)胞活化有關(guān)，參與CD8+T細(xì)胞活化，高表達(dá)的miR-21增加了細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ和IL-17表達(dá)，并靶向程序性細(xì)胞死亡因子4，阻止細(xì)胞凋亡，促進(jìn) PBC 發(fā)病[20，35]。

1.2 miRNA介導(dǎo)PBC的免疫失調(diào) PBC的具體發(fā)病機(jī)制尚不明，但可在病程進(jìn)展中觀察到免疫耐受失調(diào)[3]。miRNA異常表達(dá)可能與促進(jìn)CD4+T細(xì)胞活化、抑制Treg免疫功能、誘導(dǎo)Th增加、持續(xù)激活B淋巴細(xì)胞影響自身抗體分泌、調(diào)節(jié)外泌體介導(dǎo)抗原特異性免疫反應(yīng)有關(guān)。

研究證實(shí)，miR-425、miR-181a、miR-92a、miR-155、miR-146a等可通過特定信號(hào)通路促進(jìn)CD4+T細(xì)胞活化。其中，下調(diào)的miR-425通過T細(xì)胞抗原受體（T cell receptor, TCR）信號(hào)通路上調(diào)N-Ras，促進(jìn)CD4+T細(xì)胞活化，誘導(dǎo)IL-2、IFN-γ等促炎因子過度產(chǎn)生[25，41]。而miR-181a可通過下調(diào)靶基因bcl-2介導(dǎo)促炎Th17增加和抑炎Treg減少[42]。在PBC患者中下調(diào)的miR-92a也可增加促炎Th17活化，增加IL-17表達(dá)介導(dǎo)組織炎癥發(fā)生[43]，然而miR-92a的下調(diào)對(duì)Treg無明顯影響[24]。上述研究表明，miR-181a和miR-92a在PBC中的下調(diào)以不同方式作用于促炎Th17，增加IL-17表達(dá)介導(dǎo)組織炎癥發(fā)生。而miR-155和miR-146a參與對(duì)Treg的調(diào)控。高表達(dá)的miR-155與細(xì)胞因子信號(hào)抑制因子-1（suppressor of cytokine signaling, SOCS-1）和Treg標(biāo)志物FoxP3表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)[44]，而SOCS-1可增強(qiáng)Treg的免疫抑制功能[45]。作為Toll樣受體（Toll-like receptor, TLR）的負(fù)調(diào)節(jié)因子，miR-146a可減少炎癥介質(zhì)響應(yīng)TLR刺激[46-47]，并靶向信號(hào)傳導(dǎo)轉(zhuǎn)錄激活因子1（signal transducer and activator transcription-1, Stat1）控制Treg介導(dǎo)IFN-γ調(diào)節(jié)[48]。在PBC患者中，miR-155和miR-146a的表達(dá)顯著增加[30]，通過負(fù)調(diào)節(jié)SOCS-1/Stat1和TLR介導(dǎo)免疫反應(yīng)破壞機(jī)體Th1和Th2動(dòng)態(tài)平衡抑制Treg免疫功能，加重PBC炎性反應(yīng)。

除參與T細(xì)胞調(diào)控外，miRNA也參與B淋巴細(xì)胞激活和相關(guān)抗體分泌。Zhang等[28]觀察到在miR-223-3p、miR-21-5p下調(diào)的PBC患者中，線粒體抗丙酮酸脫氫酶復(fù)合體E2亞基（pyruvate dehydrogenase complex E2, PDC-E2）特異性B淋巴細(xì)胞被持續(xù)激活，抗核抗體（gp210、sp100）水平顯著升高。miR-223-3p，miR-21-5p的潛在靶基因（TGFBR2、MEF2C、FOXP1和RBPJ）參與細(xì)胞分化、遷移、細(xì)胞凋亡、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等途徑，提示miR-223-3p，miR-21-5p可能與B細(xì)胞分化和激活、分泌及PDC-E2抗體相關(guān)[49]。

血清外泌體的miRNA可能在免疫調(diào)控中發(fā)揮作用，如miR-451a、miR-642a-3p等。miR-451a已被證明可調(diào)節(jié)樹突狀細(xì)胞（dendritic cell, DC）細(xì)胞因子[50]，miRNA-642a可調(diào)節(jié)單核細(xì)胞TLR4翻譯[51]。而PBC患者外泌體miR-451a和miR-642a-3p含量升高[29]，提示miRNA可能參與適應(yīng)性免疫反應(yīng)，協(xié)調(diào)抗原遞呈細(xì)胞，參與對(duì)DC的激活并上調(diào)表面標(biāo)志物的表達(dá)。上述研究結(jié)果證實(shí)miRNA通過不同的信號(hào)通路參與PBC的發(fā)病，這也為PBC及膽汁淤積性肝病提供了潛在的治療靶點(diǎn)。

2 miRNA在PBC中的診斷和治療潛力

作為潛在的生物標(biāo)志物，miRNA具有蛋白標(biāo)志物無法比擬的優(yōu)勢(shì)，其能夠穩(wěn)定存在于循環(huán)中且與多種人類疾病密切相關(guān)。PBC患者miRNA的異常表達(dá)在診斷和評(píng)估治療效果方面可能具有價(jià)值，詳見表2。

表2 PBC潛在生物標(biāo)志物的miRNATable 2 miRNA as potential biomarkers for PBC

續(xù)表2

2.1 miRNA作為輔助早期診斷和鑒別診斷的生物標(biāo)志物 PBC的臨床診斷主要基于抗線粒體M2型（Anti-mitochondrial antibody subtype M2,AMA-M2）抗體、血清ALP、谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（glutamyl transpeptidase, GGT）等生物化學(xué)指標(biāo)以及組織病理學(xué)的改變。研究證實(shí)miRNA可輔助PBC診斷及與其他肝病的鑒別。

最早的研究報(bào)道稱，在PBC患者肝組織中miR-122a，miR-26表達(dá)下調(diào)，而miR-328，miR-299-5p表達(dá)上調(diào)[12]。在PBC外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cells, PBMCs）中也發(fā)現(xiàn)了miRNA的表達(dá)異常，miR-15a-5p、miR-20a-5p、miR-140-3p、miR-106b-5p表達(dá)升高，而miR-3645、miR-181a-5p表達(dá)降低[13]。另有報(bào)道稱在PBMCs中miR-155，miR-146a表達(dá)也顯著增加[30]。最近研究報(bào)告了一組miRNA組合（miR-122-5p、miR-141-3p及 miR-26b-5p） 對(duì) PBC 具有較高診斷準(zhǔn)確性（AUC為0.905，95% CI：0.857～0.953，敏感度80.5%，特異度88.3%），該miRNA組合的診斷準(zhǔn)確度高于ALP（AUC為0.537，95% CI：0.195～ 0.434，P ＜ 0.001）、抗核抗體（antinuclear antibody, ANA）（AUC為0.739，95% CI：0.012 ～ 0.213，P=0.0282），但低于AMA-M2抗體（AUC為0.982，95% CI：0.0618～0.198，P=0.0002）。對(duì)PBC不同臨床階段（臨床前、無癥狀、有癥狀和肝功能不全）患者分析后（AUC分別為0.835、0.879、0.867和0.901）得出，該組合診斷性能與疾病狀態(tài)無關(guān)[53]。

在鑒別方面，下調(diào)的miR-505-3p，miR-139-5p，miR-197-3p可能作為PBC患者臨床診斷和與病毒性肝炎鑒別診斷的重要標(biāo)記分子[54]，而miR-26a，miR-299-5p，miR-328，miR-let-7a在 PBC患者中的上調(diào)可能在鑒別自身免疫性肝炎與PBC中發(fā)揮重要作用[30]。在另一項(xiàng)研究中，AMA-M2陰性PBC患者血清miR-21，miR-150水平明顯高于健康對(duì)照及AMA-M2陽性PBC患者，且與AMA-M2抗體滴度呈負(fù)相關(guān)（miR-21：r=0.4，P=0.001； miR-150：r=0.3，P=0.016）；相比于肝硬化或肝纖維化患者，非肝硬化PBC患者miR-21表達(dá)顯著增加（P＜0.05）[55]。該結(jié)果也為AMA-M2陰性且無明顯肝硬化的早期PBC診斷提供潛在檢測(cè)指標(biāo)。除miR-21外，miR-214在患有嚴(yán)重肝纖維化（F3～F4）膽道閉鎖患者肝組織中表達(dá)顯著上調(diào)，ROC分析顯示，預(yù)測(cè)嚴(yán)重肝纖維化miR-214截點(diǎn)水平為0.805（P=0.0046）[56]。因此，miR-21，miR-214可能作為肝纖維化的非侵入性預(yù)測(cè)因子。

2.2 miRNA早期分期評(píng)估輔助預(yù)測(cè)PBC疾病進(jìn)展 在PBC不同分期和亞型中，miRNA存在表達(dá)差異。研究顯示，19個(gè)miRNAs在緩慢進(jìn)展型PBC患者與肝功能衰竭和門靜脈高壓患者之間存在表達(dá)差異，而晚期PBC患者血清中miR-139-5p的表達(dá)明顯低于早期PBC患者和健康對(duì)照，這也提示其在預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展方面具有潛在價(jià)值[27]。另一項(xiàng)研究報(bào)道了中重度膽管炎（2～3級(jí)）PBC患者的miR-299-5p表達(dá)水平顯著高于輕度膽管炎（0～1級(jí)）[57]。相比之下，活動(dòng)性肝炎的嚴(yán)重程度與miR-299-5p表達(dá)水平無相關(guān)性[30]。與上述研究結(jié)果相似的是，miR-223-3p和miR-21-5p從PBC I期到III期顯示出一致的下調(diào)和表達(dá)抑制[49]。而在T細(xì)胞中，miR-let-7b的表達(dá)水平與Mayo風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、IL-18、ALP水平呈負(fù)相關(guān)，并隨著PBC嚴(yán)重程度的增加而表達(dá)降低（I＞II/III＞IV期）[52]。上述miRNAs有可能成為預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展的關(guān)鍵生物標(biāo)志物。

2.3 miRNA在PBC中作為療效評(píng)價(jià)靶點(diǎn)的潛力 熊去氧膽酸（ursodeoxycholic acid, UDCA）是治療PBC的一線藥物，但仍有40%的PBC患者應(yīng)用UDCA治療效果不佳。目前采用的療效評(píng)價(jià)存在耗時(shí)較長，檢測(cè)指標(biāo)多等問題。在研究難治性PBC相關(guān)miRNA時(shí)發(fā)現(xiàn)，血清DBIL、AST、ALT、GGT水平升高與miR-122、miR-378f表達(dá)上調(diào)有關(guān)，miR-4311表達(dá)降低與AST和ALT水平下降有關(guān)，miR-4714-3p水平與TBIL、LDH水平呈負(fù)相關(guān)。研究者指出miR-125b，miR-let-7b，miR-520a-5p等miRNAs可能成為難治性PBC的潛在生物標(biāo)志物[15]。研究顯示，對(duì)UDCA耐藥的PBC患者PBMC中的miR-299-5p的表達(dá)增加，miR-299-5p表達(dá)與ALP、GGT和IgM水平正相關(guān)[30]，提示通過miR-299-5p靶向蛋白與PBC的疾病活動(dòng)和狀況相關(guān)。另一項(xiàng)研究也表明UDCA的治療反應(yīng)與膽管減少癥的關(guān)系更密切[58]。上述研究初步地對(duì)耐藥PBC患者與健康人的miRNA表達(dá)差異進(jìn)行討論，后續(xù)仍需要在耐藥組和敏感組PBC患者中進(jìn)行進(jìn)一步的對(duì)比和驗(yàn)證，同時(shí)注意UDCA治療對(duì)PBC患者miRNA表達(dá)水平變化的影響。

2.4 基于miRNA作為靶點(diǎn)治療PBC的進(jìn)展 在dnTGF-βRII小鼠中，研究者利用依諾沙星上調(diào)miR-346-5p、miR-326-3p、miR-181a、miR-145a-5p等miRNAs的表達(dá)，從而下調(diào)關(guān)鍵效應(yīng)T細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，來介導(dǎo)IFN-γ和穿孔素的CD8+T細(xì)胞效應(yīng)功能下調(diào)，有效地阻止自身免疫性膽道疾病的進(jìn)展[59]。部分miRNA抑制劑（反義寡核苷酸）和miRNA類似物如miR-375抑制劑、antagomiR-155和miR-24類似物等已應(yīng)用于某些疾病的治療。但目前僅有miR-125a納米顆粒和miR-103-3p外泌體在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞活化中應(yīng)用的報(bào)道[60-61]。miRNA在體內(nèi)不能保持有效抑制所需的高劑量，使得miRNA靶向藥物在臨床應(yīng)用中受到限制[62]，病毒介導(dǎo)的miRNA轉(zhuǎn)染相關(guān)免疫反應(yīng)的不良反應(yīng)也未得到有效解決。

3 總結(jié)及展望

miRNA在PBC發(fā)病及進(jìn)展的過程中具有關(guān)鍵作用，其機(jī)制研究將有利于探索PBC新的治療靶點(diǎn)，且特定miRNA組合可能在臨床實(shí)踐中具有診斷價(jià)值。雖然miRNA在PBC療效預(yù)測(cè)方面的作用也已被初步證實(shí)，但受限于樣本量及標(biāo)準(zhǔn)治療的影響，后續(xù)需要來自多個(gè)中心的更多人群以及接受治療前后的對(duì)比差異研究，來評(píng)估m(xù)iRNA與治療反應(yīng)以及預(yù)后預(yù)測(cè)的臨床結(jié)果之間的相關(guān)性。miRNA作為無創(chuàng)生物標(biāo)志物展現(xiàn)出獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，是早期病情評(píng)估的重要補(bǔ)充。而探究在PBC發(fā)病過程中參與的miRNA可提供潛在的治療靶點(diǎn)選擇，為PBC提供新的診療策略思路。