基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討補(bǔ)腎祛風(fēng)法代表藥對(duì)“益智仁-防風(fēng)”在糖尿病腎病治療中的有效成分及作用機(jī)制

芮 凱，王 獻(xiàn)，趙靖宇，馬天鵬，蔣 歡，楊 旭，謝毅強(qiáng)，李 凱

（海南醫(yī)學(xué)院，海南 ?？?571199）

糖尿病腎?。╠iabetic kidney disease，DKD）是糖尿病最主要的微血管并發(fā)癥之一，是目前引起終末期腎臟疾?。╡nd-stage-renal-disease，ESRD）的主要原因［1］。根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)研究，截止2019 年全球糖尿病患病人數(shù)約4.64 億，到2045 年，糖尿病患者 人 數(shù) 預(yù) 計(jì) 將 超 過7 億［2］。糖 尿 病 發(fā) 病10～20 年后，大約20%～40%患者會(huì)發(fā)展為DKD，最終進(jìn)展為ESRD［3］。在慢性腎病中，DKD 致死率比例逐漸升高，DKD 已成為ESRD 的首位原因［4］。目前，西醫(yī)治療DKD 的主要策略是血糖、血壓的控制和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制，雖然近年來SGLT2 抑制劑等新藥表現(xiàn)出DKD 的治療作用，但其不良反應(yīng)及惡化的腎終點(diǎn)事件限制了其臨床運(yùn)用［5］。

“補(bǔ)腎祛風(fēng)法”是中醫(yī)臨床治療DKD 的常用治法，由全國首屆國醫(yī)大師郭子光教授針對(duì)DKD“腎虛兼風(fēng)”病機(jī)而確定的治法［6］。益智仁是海南地區(qū)的“四大南藥”之一，其性溫、味辛，入脾胃經(jīng)，有溫脾止瀉、攝唾涎、暖腎、固精縮尿的功效。防風(fēng)性微溫，味辛、甘，入膀胱、肺、脾、肝經(jīng)，有祛風(fēng)解表，勝濕止痛，止痙的功效?！耙嬷侨?防風(fēng)”是補(bǔ)腎祛風(fēng)法的代表性藥對(duì)，能有效針對(duì)DKD 中腎虛兼風(fēng)這一病機(jī)［7，8］。在團(tuán)隊(duì)的前期研究中，已經(jīng)證實(shí)了益智仁治療DKD 有效，如益智仁通過抑制炎性途徑，保護(hù)腎臟功能、減少微量蛋白泄露、改善糖尿病病理改變等［9］，且證實(shí)其具體作用機(jī)制為介入NLRP3 炎癥信號(hào)通路，抑制NLRP3 炎性因子表達(dá)從而減輕腎臟炎性反應(yīng)［10］。本團(tuán)隊(duì)已通過藥效實(shí)驗(yàn)證實(shí)了“益智仁-防風(fēng)”治療DKD 的有效性［11］，但其具體的有效成分及作用機(jī)制還需進(jìn)一步的深入研究。

補(bǔ)腎祛風(fēng)法是在中醫(yī)整體觀念指導(dǎo)下治療DKD 的有效方法?；谘a(bǔ)腎祛風(fēng)法的藥對(duì)“益智仁-防風(fēng)”在治療DKD 研究中，仍然存在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確、作用機(jī)制不清楚，難以從整體到分子水平進(jìn)行全面系統(tǒng)研究的問題。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)系統(tǒng)整體的研究思路中“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”作用機(jī)制與中醫(yī)整體觀念、藥物配伍增效理念相契合［12］。同時(shí)DKD 發(fā)病和較多因素有關(guān)［13］，基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究益智仁-防風(fēng)藥對(duì)“多成分-多靶點(diǎn)-多通路”的作用機(jī)制能夠?yàn)椤耙嬷侨?防風(fēng)”藥對(duì)的應(yīng)用和DKD 的治療提供更多研究思路和方案。

1 資料與方法

1.1 分析益智仁、防風(fēng)潛在活性成分的篩選及對(duì)應(yīng)靶蛋白的查找

在中藥數(shù)據(jù)平臺(tái)中，分別以益智仁、防風(fēng)為關(guān)鍵詞檢索其主要化合物成分，篩選指標(biāo)為OB＞30%、DL＞0.18；并通過靶基因預(yù)測(cè)平臺(tái)以combinescore≥0.5 篩選出有效靶點(diǎn)。

1.2 DKD 相關(guān)靶點(diǎn)篩選

在疾病靶基因數(shù)據(jù)庫中，以Diabetic Kidney disease 為關(guān)鍵詞，選擇結(jié)合分?jǐn)?shù)（Score gda）＞0.8 的蛋白作為特異性靶基因。

1.3 益智仁-防風(fēng)與DKD 交集靶基因的篩選及通路預(yù)測(cè)

通過維恩分析對(duì)組分靶點(diǎn)和特異性靶基因進(jìn)行分析，獲得關(guān)鍵靶基因后通過蛋白質(zhì)互作平臺(tái)對(duì)其作用通路進(jìn)行預(yù)測(cè)。

1.4 相關(guān)軟件與數(shù)據(jù)平臺(tái)

主要使用的中藥成分及其預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫為：NPASS（http：/ /bidd2. nus.edu. sg/NPASS）、HIT（http：/ /lifecenter. biosino. org/hit/）、BATMAN-TCM（http：/ /bionet. ncpsb. org/batmantcm/）、TCMSP（http：/ /lsp. nwu.edu. cn/tcmsp. php）、PubChem（https：/ /pubchem. ncbi.nlm.nih.gov/）；主要使用的靶基因預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫為：STITCH（http：/ /stitch.embl.de/）、Swisstarget prediction（http：/ /swisstarget prediction.ch/）、TargetNet（http：/ /targetnet.scbdd.com）；主要使用的蛋白互作平臺(tái)數(shù)據(jù)庫為：STRING（https：/ /string-db.org/）、GeneMANIA（http：/ /genemania.org/）；DAVID（https：/ /david. ncifcrf.gov/）、Cytoscape 3.6.1（http：/ /www. cytoscape. org）、OMICshare（https：//www.omicshare.com/）被用來構(gòu)建分析互作網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 防風(fēng)、益智仁有效化學(xué)成分以及有效靶點(diǎn)篩選

利用中藥數(shù)據(jù)平臺(tái)（TCMSP 平臺(tái)）查詢防風(fēng)、益智仁主要化合物成分。

2.1.1 （1）防風(fēng)：二十五烷酸（Pentacosanoic acid）、香豆素類木質(zhì)素類（2-［（2S）-7-oxo-2，3-dihydrofuro［4，5-g］chromen-2-yl］propan-2-yl（E）-2-methylbut -2-enoate）、十七烷類（heptadeca-1，8-dien-4，6-diyn-3，10-diol）、黃花菜木脂素（（2R，3R）-3-（4-hydroxy-3-methoxy-phenyl）-5-methoxy-2-methylol-2，3-dihydropyrano［5，6-h］［1，4］benzodioxin-9-one）、白芷靈類（anomalin）、二芥子酸（divaricatacid）、11-hydroxysec-o-beta-d-glucosylhamaudol_qt、ledebouriellol，部分成分為查找到其確切中文名稱，參考現(xiàn)有研究［14］后保留數(shù)據(jù)庫中英文名稱。

2.1.2 （2）益智仁：豆甾醇（stigmasterol）、胡蘿卜甾醇（daucosterol）、谷甾醇（sitosterol）、谷甾醇棕櫚酸酯（sitosterol palmitate）。

使用靶基因預(yù)測(cè)平臺(tái)（STITCH、Swisstarget prediction、TargetNet）對(duì)有效化合物或類似物進(jìn)行在線預(yù)測(cè)靶基因，設(shè)置條件combinescore≥0.5 篩選出有效靶點(diǎn)為124 個(gè)。

2.2 相關(guān)基因的挖掘

使用糖尿病腎病疾病靶基因數(shù)據(jù)庫（OMIM、DisGeNET）檢索已經(jīng)確證報(bào)道收錄數(shù)據(jù)庫的靶蛋白，收集原始數(shù)據(jù)，選擇得結(jié)合分?jǐn)?shù)＞0.5 的蛋白作為特異性靶基因。獲得靶點(diǎn)301 個(gè)，其中前10 個(gè)特異性靶基因詳見表1。

表1 特異性靶基因列表Tab 1 Specificity targeted gene list

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建分析（富集）

將前兩步篩選出的組分靶點(diǎn)和特異性靶基因進(jìn)行維恩分析，獲得關(guān)鍵靶基因36 個(gè)，其中包括MLK、MKK4、MEK1、MEK2、NF-kappaB、AKT、CDK2、HBXAP、NLK、MB、GSK3B、HLA-DPB1、PIK3R5、CDK6 等。

將篩選出的有效化合物靶點(diǎn)對(duì)應(yīng)其所屬化合物，構(gòu)建關(guān)系對(duì)文件后錄入Cytoscape 軟件作圖，進(jìn)行Hub 分析后發(fā)現(xiàn)在篩選到的效化合物中，十七烷類（heptadeca-1，8-dien-4，6-diyn-3，10-dio）、二芥子酸（divaricatacid）等具有高連接度，可能為潛在的關(guān)鍵化合物，結(jié)果見圖1。

圖1 關(guān)鍵化合物Fig 1 Key compounds

收集共同基因數(shù)據(jù)導(dǎo)入蛋白質(zhì)互作平臺(tái)（STRING、GeneMANIA）提取互作關(guān)系對(duì)文件保存，錄入Cytoscape 軟件作圖，進(jìn)行Hub 分析后發(fā)現(xiàn)GSK3B、ILF2、STAT3、CDK1、ESR2、SHC1 等處于關(guān)聯(lián)中心位置，可能為關(guān)鍵靶基因，見圖2。

圖2 關(guān)鍵靶基因Fig 2 Key target genes

2.4 基因富集分析

將獲取的關(guān)鍵靶基因錄入David 數(shù)據(jù)庫關(guān)鍵基因GO 功能富集和KEGG 富集。排名靠前的主要相關(guān)信號(hào)通路如下：JNK、cell apoptosis、PBX3、ERK5 pathway 等。靶基因映射信號(hào)通路后，獲得的結(jié)果富 集 通 過NF-kappaB 、classical MAP kinase、JNK and p38 MAP kinase、ERK5 等炎癥或免疫途徑發(fā)揮作用。見圖3。

圖3 關(guān)鍵通路Fig 3 Key pathways

3 討論

補(bǔ)腎祛風(fēng)法論治DKD 臨床療效確切?！澳I虛”病機(jī)貫穿DKD 始終，DKD 腎虛的病機(jī)古代醫(yī)籍已有記載，《金匱要略》載“男子消渴，小便反多，以飲一斗，小便一斗，腎氣丸主之”，論述了DKD 腎虛病機(jī)導(dǎo)致口渴、小便頻數(shù)等癥?！妒?jì)總錄》載“消渴病久，腎氣受傷，腎主水，腎氣虛寒，氣化失常，開合不利，水液聚于體內(nèi)，而出現(xiàn)水腫”，論述了DKD 腎虛病機(jī)導(dǎo)致水腫一癥。DKD 具有腎虛的臨床表現(xiàn)，現(xiàn)代醫(yī)家統(tǒng)計(jì)了DKD 臨床四診信息［15］，其中神疲乏力、夜尿頻多、畏寒肢冷、腰膝怕冷等均是腎虛的臨床表現(xiàn)。DKD 病程中的蛋白尿與腎虛關(guān)系密切，朱侶等［16］認(rèn)為蛋白是人體的精微物質(zhì)，DKD 蛋白尿與腎失于封藏關(guān)系密切。王東等［7］認(rèn)為腎虛貫穿本病的始終，腎虛精關(guān)不固是蛋白尿的重要成因，應(yīng)將固腎澀精之藥應(yīng)用于本病的始終。“風(fēng)”是DKD病機(jī)的重要部分。早在《素問》就已有因風(fēng)邪導(dǎo)致腎病的論述?！端貑枴に疅嵫ㄕ摗份d“勇而勞甚，則腎汗出，腎汗出逢于風(fēng)，內(nèi)不得入于臟腑，外不得越于皮膚，客于玄府，行于皮里，傳為腑腫，本之于腎，名曰風(fēng)水”，論述了外風(fēng)致腎病發(fā)生的機(jī)理，《素問·奇病論》載“帝曰：有病龐然如有水狀，切其脈大緊，身無痛者，形不瘦，不能食，食少，名為何病？歧伯曰：病生在腎，名為腎風(fēng)”?！端貑枴わL(fēng)論》載“腎風(fēng)之狀，多汗惡風(fēng)，面龐然浮腫，脊痛，不能正立，其色火臺(tái)，隱曲不利，診在肌上，其色黑”，論述了腎風(fēng)以浮腫為主的諸多臨床表現(xiàn)?！督饏T要略·水氣病脈證并治第十四》載“脈浮而洪，浮則為風(fēng)，洪則為氣……風(fēng)氣相擊，身體洪腫，汗出乃愈。惡風(fēng)則虛，此為風(fēng)水”。當(dāng)代醫(yī)家總結(jié)了風(fēng)邪傷腎的辨證要點(diǎn)有面腫、外感肺經(jīng)癥狀、尿沫多、伴風(fēng)濕癥狀及發(fā)于冬春等［17］。黃學(xué)民等［18］觀察發(fā)現(xiàn)DKD 常見皮膚瘦癢、疼痛走竄、頭暈?zāi)垦！⑼饶_抽筋等風(fēng)毒和內(nèi)風(fēng)的表現(xiàn)。風(fēng)為陽邪，其性開泄，其性質(zhì)與腎主封藏相反，風(fēng)邪擾腎，使得腎臟封藏功能受損，蛋白尿是“風(fēng)”的重要指征［8］。國醫(yī)大師郭子光教授［19］亦提出“肺虛不能制下，腎虛不能封藏，風(fēng)邪內(nèi)擾于腎，則每見蛋白尿”。一項(xiàng)臨床回顧性研究［20］通過Pearson 相關(guān)性分析也證實(shí)了DKD 風(fēng)邪證要素積分與24 h 尿蛋白量呈正相關(guān)。

“益智仁-防風(fēng)”是補(bǔ)腎祛風(fēng)法的代表藥對(duì)。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)［21，22］，益智仁的有效成分主要包括甾醇類、二苯庚烷類、黃酮類、酚類、醚類化合物及脂肪酸類等，具有抗氧化、抗過敏、神經(jīng)保護(hù)、抗炎等藥理作用；防風(fēng)的有效成分主要包括色酮類成分、香都素類成分、酸性多糖、揮發(fā)油等，具有解熱、抗炎、陣痛、抗過敏等藥理作用。由上述可知基于補(bǔ)腎祛風(fēng)法的“益智仁-防風(fēng)”藥對(duì)在DKD 的治療中行之有效，但仍然存在藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確、作用機(jī)制不清楚，難以從整體到分子水平進(jìn)行全面系統(tǒng)地研究，故而通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)其治療DKD 的有效成分、作用靶點(diǎn)、通路等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

本次通過中藥數(shù)據(jù)平臺(tái)篩選“益智仁-防風(fēng)”藥對(duì)的有效成分共有324 個(gè)靶蛋白。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析從潛在活性成分與靶點(diǎn)相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)圖中可知“益智仁-防風(fēng)”藥對(duì)與DKD 關(guān)鍵靶基因有48個(gè)。通過對(duì)益智仁成分的研究，Li 等［23］發(fā)現(xiàn)益智仁提取物可以有效抑制大鼠尿量，同時(shí)大劑量的提取物可以增加K+排泄，Xie 等［24］通過對(duì)益智仁提取物的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)其可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群組成來降低小鼠血糖水平和腎臟病理損傷。陳益耀等［25］發(fā)現(xiàn)益智仁提取物中的原兒茶酸和白楊素可以通過抗氧化應(yīng)激減少細(xì)胞內(nèi)脂肪，對(duì)細(xì)胞具有保護(hù)作用。此外，也有不少學(xué)者對(duì)防風(fēng)成分的作用進(jìn)行研究。李麗等［26］已經(jīng)證實(shí)防風(fēng)色原酮類物質(zhì)具有抗氧化作用。張澤慶等［27］證實(shí)防風(fēng)多糖有較強(qiáng)的抗氧化活性，其中以酸性防風(fēng)多糖效果最佳。鐘才寧等［28］對(duì)防風(fēng)揮發(fā)油進(jìn)行提取并發(fā)現(xiàn)防風(fēng)揮發(fā)油成分有一定的自由基清除能力和抗氧化作用。此外，李文等［29］的研究結(jié)果顯示防風(fēng)具有抗凝血、降低血漿濃度的作用。

通過基因富集預(yù)測(cè)，“益智仁-防風(fēng)”藥對(duì)主要可能通過NF-kappaB 、classical MAP kinase、JNK and p38 MAP kinase、ERK5 等 通 路 發(fā) 揮 對(duì)DKD 的 作用。在大黃素調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞極化的實(shí)驗(yàn)中，NFkappaB 通路能夠被脂多糖誘導(dǎo)，在炎癥級(jí)聯(lián)瀑布反應(yīng)中起關(guān)鍵作用［30］。JNK 通路在細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)化、分化、凋亡等多種生理病理過程發(fā)揮著重要作用［31］。有學(xué)者利用姜黃素的類似物C66 高選擇性地對(duì)JNK 通路進(jìn)行抑制，從而在體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)中對(duì)DKD 起到良好的治療作用［32］。陳玉鳳［33］等在1 型糖尿病大鼠心肌作用機(jī)制研究中發(fā)現(xiàn)JNK 通路能夠阻礙高糖誘導(dǎo)的NLRP3 蛋白表達(dá)。本團(tuán)隊(duì)在早期研究中也已經(jīng)證實(shí)益智仁能夠通過抑制NLRP3炎 性 途 徑 對(duì)DKD 疾 病 起 到 作 用［10］。p38 MAP kinase 通路被證實(shí)對(duì)壓力、缺氧、炎癥等刺激敏感，能夠參與到炎癥、細(xì)胞分化、凋亡等多個(gè)過程［34］。另外，也有學(xué)者通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)p38 MAP kinase 通路在炎癥反應(yīng)中起著重要的介導(dǎo)作用，在抑制p38 MAP kinase 通路后，可以通過減輕炎癥反應(yīng)從而減少尿蛋白以緩解DKD 進(jìn)程［35，36］。劉雯霞［37］的研究結(jié)果顯示在高糖高脂條件，抑制ERK5 通路能夠緩解高糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和纖維化。袁媛［38］通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)抑制ERK5 通路后，與空白組相比血栓形成時(shí)間推遲，證實(shí)了ERK5 通路對(duì)體內(nèi)血小板凝聚發(fā)揮重要作用。

通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究發(fā)現(xiàn)，基于補(bǔ)腎祛風(fēng)法的“益智仁-防風(fēng)”藥對(duì)通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路實(shí)現(xiàn)對(duì)DKD 的治療，這與中醫(yī)整體觀念、藥物配伍增效觀念相同。當(dāng)下，對(duì)“益智仁-防風(fēng)”藥對(duì)的研究多從單成分、單機(jī)制出發(fā)，而對(duì)其有效成分、作用通路、機(jī)制等尚未進(jìn)行充分研究。本研究旨在通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)，為基于補(bǔ)腎祛風(fēng)法中的“益智仁-防風(fēng)”藥對(duì)在DKD 的治療提供更多研究方案，并以此證實(shí)益智仁-防風(fēng)治療DKD 的部分機(jī)理，為后期“益智仁-防風(fēng)”藥對(duì)治療DKD 研究提供新的思路和方法。

作者貢獻(xiàn)度說明：

芮凱：完成了文中網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)部分的分析與撰寫；王獻(xiàn)：完成了討論中相關(guān)綜述內(nèi)容的撰寫；趙靖宇完成了本文英文摘要的撰寫；馬天鵬、蔣歡：完成了本文引言部分有關(guān)DKD流行病學(xué)的資料查找及撰寫；謝毅強(qiáng)、楊旭：作為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人完成對(duì)本篇論文的指導(dǎo)與審校；李凱：作為項(xiàng)目負(fù)責(zé)人完成了中醫(yī)理論探討部分的撰寫及對(duì)該篇論文的審校。