酪蛋白激酶-2相互作用蛋白-1介導(dǎo)的自噬通路與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系探討

劉康，周航，惠明大，黃海，何才劍，房謀昊，陳天鵬，史曉林

（1．浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州 310005；2．浙江中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 杭州 310053；3．諸暨市中心醫(yī)院，浙江 諸暨 311899）

骨質(zhì)疏松癥被認(rèn)為是一種典型的增齡性疾病，其原因是骨重建受損，并伴有成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞數(shù)量和活性的失衡。酪蛋白激酶-2相互作用蛋白-1（casein kinase 2 interacting protein-1，CKIP-1）不僅是細(xì)胞存活、凋亡、細(xì)胞骨架形成和細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)因子，還是骨形成的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，導(dǎo)致破骨細(xì)胞過(guò)度活化和骨丟失。CKIP-1的靶向藥物可以促進(jìn)骨形成，預(yù)防骨質(zhì)疏松癥。CKIP-1主要通過(guò)介導(dǎo)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）及Wnt兩大信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮對(duì)骨形成的抑制作用。自噬作為一種細(xì)胞生存途徑，在維持骨穩(wěn)態(tài)方面起著至關(guān)重要的作用，而這一途徑的變化在一定程度上與骨質(zhì)疏松的發(fā)生有關(guān)。與年齡相關(guān)的雌激素缺乏被廣泛認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要原因，而與衰老相關(guān)的骨組織中氧化應(yīng)激的增加也被認(rèn)為是骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的主要致病因素之一。研究發(fā)現(xiàn)，CKIP-1能夠介導(dǎo)自噬相關(guān)通路來(lái)影響骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展。靶向調(diào)節(jié)CKIP-1介導(dǎo)的自噬通路是一種潛在的治療骨質(zhì)疏松癥的策略。但目前關(guān)于CKIP-1介導(dǎo)的自噬通路的相關(guān)研究主要集中在腫瘤領(lǐng)域，在骨代謝相關(guān)領(lǐng)域的研究較少。本文就CKIP-1介導(dǎo)的自噬通路與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系進(jìn)行了探討，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 自噬的概念及發(fā)生機(jī)制

自噬主要負(fù)責(zé)不必要的細(xì)胞器官和過(guò)量營(yíng)養(yǎng)的循環(huán)，以及代謝廢物和細(xì)胞內(nèi)病原體的消除。哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的自噬可分為3種主要方式：大自噬、微自噬和伴侶蛋白介導(dǎo)的自噬。目前學(xué)界對(duì)于大自噬（通常所說(shuō)的自噬）的研究最為深入。在大自噬中，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的捕獲和傳遞以自噬小體的形成為標(biāo)志。在與溶酶體結(jié)合后，自噬小體和其所包裹的物質(zhì)被消化，消化所得產(chǎn)物可被機(jī)體進(jìn)一步重新利用。自噬在生理過(guò)程和許多代謝失調(diào)相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。自噬被認(rèn)為是一種細(xì)胞保護(hù)機(jī)制，能降解異常細(xì)胞、細(xì)胞器等，但當(dāng)自噬過(guò)度會(huì)引起疾病的發(fā)生。

包括胰島素、葡萄糖以及許多生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子在內(nèi)的多種分子都可以啟動(dòng)磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol-3 kinase，PI3K）／蛋白激酶 B／mTOR自噬信號(hào)傳導(dǎo)。在這些分子的作用下，酪氨酸激酶受體、類Ras蛋白或G蛋白偶聯(lián)受體等蛋白被激活，隨后激活自噬信號(hào)級(jí)聯(lián)的觸發(fā)者PI3K?；罨腜I3K可將磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2）轉(zhuǎn)化為磷脂酰肌醇 -3，4，5-三磷酸（phosphatidylinositol-3，4，5-triphosphate，PIP3），進(jìn)而激活下游效應(yīng)因子保證信號(hào)的順利傳遞。蛋白激酶 B又稱 Akt，是 PI3K／Akt／mTOR信號(hào)通路中的重要信使。在典型的PI3K／Akt途徑中，磷酸肌醇依賴性激酶-1（phosphoinositide-dependent kinase-1，PDK1）和 Akt通過(guò) Pleckstrin同源結(jié)構(gòu)域被募集到細(xì)胞膜內(nèi)表面，其中PDK1在Thr308處啟動(dòng)Akt磷酸化。Akt激活的另一個(gè)途徑是由mTOR復(fù)合物（mammalian target of rapamycin complex，mTORC2）2介導(dǎo)的，它與 Akt的調(diào)節(jié)疏水結(jié)構(gòu)域相互作用，使其在 Ser473處磷酸化。Akt的一個(gè)關(guān)鍵下游分支是mTORC1。磷酸化的Akt可以磷酸化位于Ser2448的mTOR，從而激活mTORC1，也可以磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合體2（tuberous sclerosis complex 2，TSC2）間接激活 mTORC1。Akt使 TSC2失活可以抑制TSC1／TSC2復(fù)合體的功能，使下游的腦內(nèi) Ras同系物（Ras homolog enriched inbrain，RHEB）-GTP轉(zhuǎn)化為 RHEB-GDP，而 RHEB-GTD可導(dǎo)致mTORC1的激活。mTORC1激活后影響其效應(yīng)物，其中UNC-51樣激酶1（unc-51-like kinase 1，ULK1）與自噬的啟動(dòng)相關(guān)，mTORC1可以直接磷酸化或抑制ULK1而達(dá)到對(duì)自噬的抑制。雷帕霉素可導(dǎo)致ULK1去磷酸化，從而使由ULK1、自噬相關(guān)基因（autophagy-related genes，ATG）13、ATG101和200 kDa的家族相互作用蛋白（family interacting protein of 200 kDa，F(xiàn)IP200）組成的 ULK1復(fù)合體從mTORC1復(fù)合體解離。ULK1是已知的自噬相關(guān)蛋白中唯一的絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶，作為自噬小泡的重要組成成分，與ATG13、ATG101和FIP200形成ULK1復(fù)合物而誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。見(jiàn)圖1。

圖1 自噬發(fā)生機(jī)制示意圖

2 自噬與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系

研究發(fā)現(xiàn)，自噬積極參與對(duì)骨代謝的調(diào)控。自噬對(duì)于保持正常成骨細(xì)胞的功能是必不可少的，抑制成骨細(xì)胞的自噬將導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。研究證實(shí)，抑制破骨細(xì)胞的自噬在一定程度上能夠抑制骨量減少。米健國(guó)等認(rèn)為，去卵巢能夠建立絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥大鼠模型的原因之一是大鼠血清中丙二醛、活性氧含量增加，過(guò)量的活性氧可以抑制PI3K／Akt／mTOR信號(hào)通路，激活自噬，而提高自噬水平容易誘發(fā)成骨細(xì)胞凋亡，進(jìn)而加速骨量丟失，加快絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的進(jìn)程。招文華等等研究發(fā)現(xiàn)，在激素環(huán)境下，前成骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化顯著被抑制，mTORC1被下調(diào)，自噬激活且Wnt／βcatenin信號(hào)通路被抑制，而應(yīng)用mTORC1激活劑則能逆轉(zhuǎn)該過(guò)程，表明 mTORC1能抑制自噬并調(diào)控Wnt／β-catenin信號(hào)通路介導(dǎo)激素環(huán)境下的前成骨細(xì)胞MC3T3-E1成骨分化。李希寧等研究發(fā)現(xiàn)，通過(guò)抑制mTOR磷酸化激活自噬，促進(jìn)骨形成的同時(shí)抑制骨吸收，從而緩解氟骨癥大鼠早期骨質(zhì)疏松。

3 CKIP-1介導(dǎo)的自噬通路與骨質(zhì)疏松癥的關(guān)系

CKIP-1在細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞生長(zhǎng)發(fā)育等方面具有多種生物學(xué)功能。而這些功能主要依賴于細(xì)胞的位置、類型和調(diào)節(jié)信號(hào)。CKIP-1參與骨形成、腫瘤發(fā)生和免疫調(diào)節(jié)等生物學(xué)過(guò)程，解除CKIP-1的調(diào)控會(huì)導(dǎo)致骨質(zhì)疏松癥、腫瘤和動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生。CKIP-1作為骨形成的負(fù)調(diào)控因子參與骨形成、成骨細(xì)胞分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程，與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生密切相關(guān)。Zhang等評(píng)估了骨組織靶向遞送系統(tǒng)“（AspSerSer）-6脂質(zhì)體”傳遞的CKIP-1 siRNA的有效性，并檢測(cè)了骨形態(tài)計(jì)量學(xué)參數(shù)、骨量和骨結(jié)構(gòu)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)，該系統(tǒng)傳遞的CKIP-1 siRNA可以在不影響骨吸收的前提下提高骨形成的能力，表明CKIP-1在逆轉(zhuǎn)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松骨丟失方面發(fā)揮了重要作用。Liu等研究發(fā)現(xiàn)，CKIP-1在骨折患者和衰老嚙齒類動(dòng)物的骨標(biāo)本中的表達(dá)隨年齡的增加而增加，這與相關(guān)信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)及骨形成隨年齡的減少有關(guān)；還發(fā)現(xiàn)CKIP-1 siRNA可以靶向進(jìn)入成骨細(xì)胞，抑制CKIP-1基因表達(dá)，從而促進(jìn)衰老嚙齒類動(dòng)物的骨形成。CKIP-1通過(guò)增加Smad泛素化調(diào)節(jié)因子 -1（Smad ubiquitination regulatory factor-1，SMurf1）與其底物之間的親和力，增強(qiáng)SMurf1的泛素連接酶活性，促進(jìn)了Smad1／5的降解，負(fù)向調(diào)節(jié)BMP信號(hào)通路而影響骨形成。此外，CKIP-1也能通過(guò)Wnt信號(hào)受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5來(lái)影響成骨分化。

CKIP-1在體內(nèi)和體外均導(dǎo)致細(xì)胞生長(zhǎng)受阻，是一種新的具有抑制功能的Akt相互作用蛋白。CKIP-1的亮氨酸拉鏈（leucine zipper，LZ）基序在 Akt激酶活性抑制中起重要作用。CKIP-1可直接與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，并降低Akt激酶的活性；通過(guò)其氨基末端與每個(gè)Akt異構(gòu)體（Akt1、Akt2和Akt3）形成復(fù)合物；通過(guò)其羥基末端的LZ基序二聚化發(fā)現(xiàn)與Akt失活有關(guān)，因?yàn)長(zhǎng)Z基序的缺失消除了Akt抑制功能。盡管LZ基序的缺失使其仍然可以與Akt結(jié)合，但通過(guò)隔離內(nèi)源CKIP-1與Akt結(jié)合的能力來(lái)誘導(dǎo)Akt磷酸化和活化。穩(wěn)定的CKIP-1表達(dá)可導(dǎo)致Akt失活和體外細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。在成骨細(xì)胞中，CKIP-1能抑制Akt的磷酸化，上調(diào)p-Akt／Akt的比值，而磷酸化的Akt是自噬信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程中的重要一環(huán)，磷酸化使Akt激活從而能夠轉(zhuǎn)入其他細(xì)胞隔間與其下游的相關(guān)因子發(fā)生作用，最終導(dǎo)致自噬的激活（圖2）。自噬激活后抑制成骨細(xì)胞分化及生長(zhǎng)，導(dǎo)致成骨細(xì)胞礦化減少，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。

圖2 成骨細(xì)胞中CKIP-1介導(dǎo)的自噬通路分子機(jī)制示意圖

Zhang等研究發(fā)現(xiàn)，CKIP-1通過(guò)與 TRAF6相互作用并抑制Akt激活，CKIP-1缺乏會(huì)導(dǎo)致Akt的長(zhǎng)時(shí)間激活，并且CKIP-1缺陷小鼠自發(fā)地出現(xiàn)巨噬細(xì)胞所介導(dǎo)的脾腫大和骨髓增殖。Yuan等研究發(fā)現(xiàn)，自噬在成骨細(xì)胞分化過(guò)程中被激活，是因?yàn)镃KIP-1通過(guò)Akt／mTOR信號(hào)通路參與骨細(xì)胞自噬，CKIP-1與Akt結(jié)合而導(dǎo)致該通路受到抑制，從而激活了自噬通路；在使用強(qiáng)骨飲干預(yù)后重新激活了被抑制的Akt／mTOR通路，而CKIP-1充當(dāng)強(qiáng)骨飲和Akt／mTOR信號(hào)之間的中介。在體外大鼠成骨、破骨細(xì)胞中，CKIP-1可提高成骨、破骨細(xì)胞中自噬水平，這也充分證明了CKIP-1介導(dǎo)的自噬通路在骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生中起著重要作用。

4 小 結(jié)

自噬活動(dòng)與骨代謝之間具有明顯的關(guān)系，自噬的激活會(huì)導(dǎo)致骨代謝的紊亂，而骨代謝的紊亂會(huì)直接導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。目前，已有研究采用調(diào)節(jié)自噬的方式來(lái)治療因衰老、雌激素缺乏或使用糖皮質(zhì)激素而引起的骨質(zhì)疏松癥，并取得了良好的療效。CKIP-1主要通過(guò)與Akt結(jié)合，抑制Akt磷酸化使其失活，并使PI3K／Akt／mTOR信號(hào)傳導(dǎo)受阻來(lái)激活自噬，進(jìn)而抑制骨分化及生長(zhǎng)，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松的發(fā)生。雖然目前學(xué)界對(duì)CKIP-1介導(dǎo)的自噬通路與骨質(zhì)疏松癥關(guān)系的認(rèn)識(shí)已經(jīng)取得了一定的進(jìn)展，但還不能完全解釋清楚自噬對(duì)骨質(zhì)疏松癥的調(diào)控機(jī)制。相信隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展及學(xué)界對(duì)自噬研究的不斷深入，上述問(wèn)題一定能被解釋清楚，從而能更好地利用與自噬有關(guān)的調(diào)控體系來(lái)防治骨質(zhì)疏松癥。