乳酸菌附屬發(fā)酵劑的篩選及其對(duì)干酪漿蛋白水解的影響

李春燕，熊智強(qiáng)，王光強(qiáng)，宋馨，楊昳津，張匯，艾連中，夏永軍

(上海理工大學(xué) 健康科學(xué)與工程學(xué)院，上海食品微生物工程研究中心，上海，200093)

天然干酪的成熟即通過微生物和酶的作用，使干酪中原有的大分子物質(zhì)逐步分解并產(chǎn)生豐富的風(fēng)味化合物及前體物質(zhì)，賦予干酪以色澤、質(zhì)地和風(fēng)味[1]。然而，干酪成熟是一個(gè)較長(zhǎng)的過程，恒溫恒濕的后熟條件需要大量成本投入，此外，由于標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，巴氏殺菌后的原料乳制得的干酪缺乏傳統(tǒng)干酪的香味，這可能是和非發(fā)酵劑乳酸菌(non-starter lactic acid bacteria，NSLAB)數(shù)量的減少和重要酶的失活有關(guān)[2]。在加工過程中添加NSLAB作為附屬發(fā)酵劑來豐富干酪的風(fēng)味并加速成熟是目前較為常見且有效的方法。

NSLAB主要是通過提升相關(guān)酶的含量來加速蛋白質(zhì)和脂肪的代謝，促進(jìn)小分子肽、游離脂肪酸(free fatty acid，F(xiàn)FA)和游離氨基酸(free amino acid，F(xiàn)AA)的生成，以提升干酪風(fēng)味、縮短成熟時(shí)間[3]。此外，對(duì)功能食品日益增長(zhǎng)的需求推動(dòng)了益生菌干酪的開發(fā)。研究表明，乳酸菌作為附屬發(fā)酵劑應(yīng)用于干酪加工中，不僅可以增強(qiáng)干酪的風(fēng)味，而且還具有抗氧化、抗高血壓等活性功能[4]。

NSLAB菌株的特異性、發(fā)酵劑和NSLAB之間菌群的相互作用都會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品特性的差異[5]。此外，NSLAB作為附屬發(fā)酵劑在加速干酪成熟過程中，能夠在釋放功能性活性肽的同時(shí)，減少苦味肽的生成，從而改善干酪的口感與風(fēng)味。本研究通過對(duì)24株LAB菌株進(jìn)行特性研究、篩選，然后利用干酪漿模型快速評(píng)價(jià)NSLAB對(duì)干酪蛋白的水解特性，以考量NSLAB在干酪環(huán)境中作為附屬發(fā)酵劑的實(shí)際可行性，為改善天然干酪成熟特性的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料

24株LAB，由本實(shí)驗(yàn)室前期分離；生牛乳，光明乳業(yè)股份有限公司；CHOOZIT MA 14 LYO發(fā)酵劑(乳酸乳球菌乳酸亞種，乳酸乳球菌乳脂亞種)、Marzyme 150 MG凝乳酶，丹尼斯克(中國(guó))有限公司；L-亮氨酸對(duì)硝基苯胺，探索平臺(tái)；其余試劑均為分析純。

1.1.2 儀器

KBF240型培養(yǎng)箱，德國(guó)Binder公司；Bag Mixer?400均質(zhì)機(jī)，法國(guó)interscience公司；PB-10型pH計(jì)，瑞士梅特勒-托利多公司；Foss 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀，瑞典FOSS分析儀器有限公司；多功能酶標(biāo)儀，美谷分子儀器限公司；Waters e2695高效液相色譜儀，美國(guó)Waters公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株和培養(yǎng)條件

本研究中使用的24株LAB的菌株信息如表1所示。將菌株在MRS培養(yǎng)基中37 ℃連續(xù)傳代2次。

表1 本研究中所用乳酸菌的種類、菌株編號(hào)及來源Table 1 Species, strain ID, and sources of LAB strains used in this study

1.2.2 附屬發(fā)酵劑的篩選

1.2.2.1 產(chǎn)酸能力

將24株LAB按照1%的接種量分別接種于10%質(zhì)量分?jǐn)?shù)的脫脂乳培養(yǎng)基中，在30 ℃下培養(yǎng)，分別測(cè)定培養(yǎng)0、6 和24 h后的培養(yǎng)基pH值[6]。

1.2.2.2 自溶度

參考SCATASSA等[7]的方法測(cè)定自溶度。

1.2.2.3 氨肽酶活力測(cè)定

(1)細(xì)菌無細(xì)胞提取液(cell-free extract，CFE)的制備。制備方法參考文獻(xiàn)[8]。

(2)酶活力測(cè)定。參考文獻(xiàn)[9]的方法。氨肽酶活力：在37 ℃條件下，在410 nm下、1 min使吸光度改變0.001個(gè)單位所需酶的數(shù)量為1 U。結(jié)果表示為U/mg蛋白質(zhì)。

1.2.2.4 蛋白水解活性

將菌株點(diǎn)接在含1%脫脂乳粉的PCA培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)48 h[10]。選擇有透明圈形成的陽(yáng)性菌株測(cè)定其蛋白水解度。

使用鄰苯二甲醛(o-phthalaldehyde，OPA)試劑法測(cè)定菌株的蛋白水解活性[11]。根據(jù)酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，以水解產(chǎn)生的相當(dāng)于酪氨酸的FAA的量表征蛋白水解度。

1.2.2.5 脂解活性

將菌株點(diǎn)接在含0.1%三丁酸甘油酯的MRS培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)72 h，觀察有無透明圈形成[1]。

1.2.2.6 耐鹽性和產(chǎn)胞外多糖情況

在含有2%、4%、6% 質(zhì)量分?jǐn)?shù)NaCl的液體MRS中分別接種24株LAB，37 ℃培養(yǎng)，分別測(cè)定培養(yǎng)液在0和24 h的OD600，以測(cè)試菌株的耐鹽性[12]。

用10%的蔗糖代替MRS中的葡萄糖，使用接種環(huán)法測(cè)試菌株產(chǎn)EPS情況[13]。

1.2.2.7 在低溫條件下的生長(zhǎng)情況

將菌株接種于液體MRS中，分別在4、10、15 ℃ 3個(gè)溫度條件下培養(yǎng)24 h，通過測(cè)定OD600值判斷24株LAB的生長(zhǎng)狀況[14]。

1.2.3 干酪凝乳及干酪漿模型的制備

(1)干酪凝乳的制作流程。參考袁然等[15]的方法。

(2)干酪漿模型的制作。將上述干酪凝塊與50 g/L的無菌NaCl溶液按照2∶1的質(zhì)量比裝入無菌均質(zhì)袋中，制成對(duì)照樣；實(shí)驗(yàn)樣分別加入4種NSLAB菌株的菌懸液(終濃度106CFU/mL)[16]。使用均質(zhì)機(jī)勻漿后，置于30 ℃培養(yǎng)箱中后熟。分別在第0、3、6、9、12天對(duì)各組干酪漿進(jìn)行取樣分析。

1.2.4 不同NSLAB菌株對(duì)干酪漿模型的影響

1.2.4.1 干酪漿組分和pH測(cè)定

水分：參考GB 5009.3—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》；脂肪：參考GB5009.6—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》；蛋白質(zhì)：參考GB5009.6—2016 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》，使用Foss 8400全自動(dòng)凱氏定氮儀測(cè)定；pH：將干酪漿與無菌水按1∶2質(zhì)量比混勻，用pH計(jì)測(cè)定pH值。

1.2.4.2 干酪漿模型成熟期間微生物變化情況

在LM17培養(yǎng)基上(30 ℃有氧條件下培養(yǎng)48 h)計(jì)數(shù)發(fā)酵劑乳球菌數(shù)；在ROGOSA培養(yǎng)基上(37 ℃厭氧條件下培養(yǎng)48 h)計(jì)數(shù)總NSLAB數(shù)[17]。

1.2.4.3 蛋白水解情況

(1)pH 4.6-SN。取2.5 g干酪漿，加入22.5 mL 0.9%的NaCl溶液中，調(diào)節(jié)pH值至4.6，在25 ℃水浴1 h后離心，取上清液進(jìn)行凱氏定氮[18]。

(2)12% TCA-SN。取pH 4.6-SN溶液和24% 三氯乙酸(trichloroacetic acid，TCA)溶液各4 mL，混勻后25 ℃水浴1 h，離心、取上清液進(jìn)行凱氏定氮[19]。

(3)干酪漿模型成熟過程中水溶性多肽的RP-HPLC。取pH 4.6-SN上機(jī)分析，RP-HPLC采用梯度洗脫模式，具體條件參照賈宏信等[20]的研究。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 17.0、Origin 2019對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，數(shù)據(jù)用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(n=3)的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 附屬發(fā)酵劑的篩選結(jié)果

2.1.1 菌株產(chǎn)酸能力與自溶度評(píng)價(jià)

在干酪加工中，NSLAB的酸化能力不宜過高，以避免干酪過度酸化。24株LAB的酸化結(jié)果如圖1-a所示，根據(jù)附屬發(fā)酵劑的酸化標(biāo)準(zhǔn)[21]，除了菌株AR93和AR184在6 h后的ΔpH≥0.4，其余菌株的酸化能力均較低；24 h后酸化結(jié)果表明，13株菌株在24 h內(nèi)ΔpH均<1，符合NSLAB篩選條件。

NSLAB菌體裂解并隨后釋放胞內(nèi)酶能力是干酪成熟過程中一個(gè)理想的特性。胞內(nèi)蛋白酶、脂肪酶等可以促進(jìn)干酪中小分子物質(zhì)的生成。如SEIXAS等[12]從手工Serrano干酪中分離出的LeuconostocmesenteroidesUEL28菌株自溶度為11.8%。結(jié)果顯示(圖1-b)，42%的菌株具有良好的自溶度(自溶度>25%)，其中，AR809的自溶能力最強(qiáng)，達(dá)到52%。根據(jù)AYAD等[21]所述標(biāo)準(zhǔn)，除了自溶度<15%的AR243和AR513，其余22株LAB的自溶度均符合篩選條件。

a-酸化能力；b-自溶度圖1 24株LAB的酸化能力和自溶度Fig.1 Acidification and autolysis activities of 24 LAB strains注：a中不同小寫字母表示菌株發(fā)酵6 h后的pH值存在顯著差異， 不同大寫字母表示菌株發(fā)酵24 h后的pH值存在顯著差異 (P<0.05);b中不同小寫字母表示結(jié)果存在顯著差異(下同)

2.1.2 氨肽酶與蛋白水解能力評(píng)價(jià)

氨肽酶能夠順式水解肽鏈氨基末端的疏水性氨基酸[22]。在附屬發(fā)酵劑菌株的篩選研究中，所選菌株的氨肽酶活力在0.1～143 U/mg不等。如GONZLEZ等[8]從傳統(tǒng)西班牙干酪中篩選出的LactobacillusplantarumGE2077酶活力為18 U/mg，酶活力值最高的L.paracaseiGE2036的酶活力為143 U/mg。

本研究中，24株LAB的亮氨酸氨肽酶活性范圍為6.5～55.7 U/mg(圖2-a)，其中AR171、AR184、AR287、AR469、AR497、AR611、AR612、AR809的氨肽酶活力較高，具有作為NSLAB的潛力。

蛋白水解活性是NSLAB作為附屬發(fā)酵劑的一項(xiàng)重要特性，適度的蛋白水解可以加速小分子物質(zhì)的生成。結(jié)果表明，24株LAB菌落周圍均有透明圈的形成，選擇陽(yáng)性菌株進(jìn)一步測(cè)定其蛋白水解度。酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y=0.0039x+0.0247，R2=0.998 6。如圖2-b所示，菌株的蛋白水解活性在70.59～209.18 mg/L，菌株AR496蛋白水解活力最高，且不同菌株之間的蛋白水解活性存在顯著差異(P<0.05)。在NIETO-ARRIBAS等[6]的研究中，3株LAB候選菌株的蛋白水解活性在90～135 mg/L上下，表明本研究中菌株的蛋白水解活性具備作為NSLAB的應(yīng)用潛力。

a-氨肽酶活性；b-蛋白水解活性圖2 24株LAB的氨肽酶活性和蛋白水解活性Fig.2 Aminopeptidase and proteolytic activities of 24 LAB strains

2.1.3 脂解活性

在脂肪酶的作用下，甘油三酯可以被水解為單、雙甘油三酯，以及FFA和甘油[23]。結(jié)果顯示(表2)，10個(gè)LAB菌株具有脂解活性，其中AR809的透明圈比值最大，在干酪生產(chǎn)中有良好應(yīng)用潛力。

2.1.4 耐鹽性和產(chǎn)EPS情況

在成熟過程中，干酪高鹽的環(huán)境要求NSLAB對(duì)鹽有一定的耐受性。結(jié)果表明(表2)，所有菌株均可以在2%～4%的鹽含量下存活，可作為干酪生產(chǎn)中的附屬發(fā)酵劑。

乳酸菌在生長(zhǎng)過程中分泌的EPS，可以改善干酪的質(zhì)地[10]。結(jié)果顯示，有8株LAB可以產(chǎn)生EPS。

2.1.5 低溫條件下的生長(zhǎng)情況

如表2所示，50%的LAB可在4 ℃下存活，但是生長(zhǎng)情況不佳。隨著溫度的提升，所有菌株在10和15 ℃條件下的OD600值均增加，表明菌株可在此溫度下生長(zhǎng)。在干酪成熟過程中，環(huán)境溫度普遍在10 ℃上下，這表明所選24株LAB均符合NSLAB菌株的篩選標(biāo)準(zhǔn)。

表2 LAB菌株的耐鹽能力、低溫條件下生長(zhǎng)情況、 產(chǎn)胞外多糖和脂解能力Table 2 Salt tolerance, cold resistance, EPS and lipolytic activities of LAB

綜合上述篩選指標(biāo)，選擇了4株具有良好應(yīng)用潛力的菌株：AR497、AR611、AR612、AR809。上述菌株具有低產(chǎn)酸能力、高自溶度和氨肽酶活力、具有適度蛋白水解活性、能夠適應(yīng)干酪后熟過程中的高鹽低溫環(huán)境。將4株菌添加到干酪漿模型中，快速考量各菌株對(duì)干酪成熟特性的實(shí)際影響。

2.2 四種乳桿菌對(duì)干酪漿模型的影響

2.2.1 干酪漿組分和pH結(jié)果分析

取成熟12 d的干酪漿進(jìn)行成分分析，結(jié)果表明(表3)，分別添加4種附屬發(fā)酵劑的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照相比，其脂肪、蛋白質(zhì)和水分含量均無明顯差別(P>0.05)，即附屬發(fā)酵劑的添加不會(huì)改變干酪的總成分。

表3 干酪漿組成分析 單位：%

由圖3所示，在成熟過程中，干酪漿pH呈先下降、后略升高，最后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。在成熟過程中，4個(gè)實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的pH變化未見顯著差異(P>0.05)，表明4株NSLAB菌株的加入對(duì)模型體系的pH無負(fù)面影響。

圖3 干酪漿模型成熟期內(nèi)的pH變化Fig.3 Changes in pH of cheese slurry model during ripening

2.2.2 干酪漿模型成熟過程中的微生物變化情況

如圖4-a所示，在對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中，發(fā)酵劑乳酸菌濃度變化趨勢(shì)基本相同，在第12天時(shí)基本都維持在106CFU/g干酪漿，這些結(jié)果表明，NSLAB的加入對(duì)發(fā)酵劑的存活無明顯影響。

a-乳酸乳球菌菌落數(shù)；b-附屬發(fā)酵劑菌落數(shù)圖4 干酪漿模型成熟過程中發(fā)酵劑乳球菌和 附屬發(fā)酵劑的變化情況Fig.4 Changes of Lactococcus starters and adjunct cultures of cheese slurry model during ripening

如圖4-b所示，對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組中附屬發(fā)酵劑NSLAB的初始濃度約為106CFU/g干酪漿，在0～3 d內(nèi)增加到107～108CFU/g；隨后可能由于菌體發(fā)生了自溶，菌落濃度略有下降；在12 d的成熟時(shí)間內(nèi)總體趨于穩(wěn)定且菌落數(shù)保持在較高水平。在對(duì)照組中，NSLAB的數(shù)量從第0天時(shí)未檢出，增加到成熟第12天時(shí)的104CFU/g。由于制作和取樣過程均在無菌操作臺(tái)上完成，盡可能避免外界污染，因此，這種結(jié)果可能是由于不定形NSLAB的形成造成[17]。

2.2.3 蛋白水解

(1)pH 4.6-SN、12% TCA-SN。pH 4.6-SN可代表初級(jí)蛋白水解。如圖5-a所示，隨著后熟過程進(jìn)行，5組模型組的pH 4.6-SN含量都在不斷增加，在成熟第6天時(shí)，4組實(shí)驗(yàn)組的pH 4.6-SN含量均高于對(duì)照組。第12天的方差分析表明，AR809和AR611兩組的pH 4.6-SN含量與對(duì)照相比具有顯著性差異(P<0.05)。

12% TCA-SN可作為二次蛋白水解程度的指標(biāo)。由圖5-b可看出，試驗(yàn)組的12% TCA-SN含量均高于對(duì)照組，且AR809組含量最高。這可能由于AR809自溶釋放出更多胞內(nèi)氨肽酶等，促進(jìn)了小分子物質(zhì)的生成。不同菌株對(duì)干酪漿二次蛋白水解的影響各不相同，這可能是由于它們?cè)诟衫一|(zhì)中實(shí)際酶活性的差異性所致。

a-pH 4.6-SN含量；b-12% TCA-SN含量圖5 干酪漿模型成熟過程中蛋白質(zhì)降解Fig.5 Degradation of protein during ripening cheese slurry model

(2)干酪漿模型成熟過程中水溶性多肽的RP-HPLC。以AR809和對(duì)照組的RP-HPLC結(jié)果為例(圖6)，在第0天時(shí)，干酪漿中的親水性肽(11.2～21.9 min洗脫)和疏水性肽(21.9～69 min洗脫)的峰區(qū)相似；隨著后熟的進(jìn)行，親水性多肽的種類和含量呈增加趨勢(shì)；第12天時(shí)，對(duì)照組和4個(gè)實(shí)驗(yàn)組的圖譜出現(xiàn)差異，其中含L.salivariusAR809的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照相比，峰數(shù)和峰面積更多，表明干酪中酪蛋白的二次水解受到NSLAB的影響。

a-第0天；b-第6天；c-第12天圖6 干酪漿模型成熟0、6、12 d后水溶性組分肽的RP-HPLCFig.6 RP-HPLC of water-soluble fraction cheese slurry model after 0, 6 or 12 d ripening

此外，前期的研究表明，AR809可以通過激活icaR基因和抑制icaA基因的表達(dá)來抑制金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)生物膜的形成，從而有效緩解S.aureus引起的咽炎[24]。將AR809作為干酪成熟過程中的附屬發(fā)酵劑，可能是將益生菌引入人體的一種實(shí)用途徑。

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)24株LAB的菌株特性進(jìn)行評(píng)估，篩選出4株具有應(yīng)用潛力的NSLAB菌株；然后以干酪漿為快速成熟模型，評(píng)估NSLAB在復(fù)雜的干酪環(huán)境中的促熟作用。結(jié)果表明，NSLAB的加入均可促進(jìn)酪蛋白的水解，但不同菌株具有不同的水解能力，L.salivariusAR809的促進(jìn)作用最為明顯。這可能是由于干酪中微生物的相互作用或AR809能夠更好地適應(yīng)干酪環(huán)境，促使AR809釋放更多與蛋白水解相關(guān)的酶，進(jìn)一步促進(jìn)水溶性肽等低分子物質(zhì)的產(chǎn)生。研究結(jié)果表明，AR809 具有作為附屬發(fā)酵劑應(yīng)用于干酪生產(chǎn)的潛力。此外，益生菌強(qiáng)化食品對(duì)人類健康有積極影響，AR809作為1株具有緩解咽炎功能特性的益生菌，對(duì)人體健康具有積極作用。

本實(shí)驗(yàn)所用的干酪漿模型，其組成和質(zhì)地與天然干酪相似，但具有較高的含水量和成熟溫度，因此可加快體系內(nèi)的生化反應(yīng)，從而可以對(duì)NSLAB的作用進(jìn)行快速評(píng)估。在接下來的研究中，還需進(jìn)一步研究L.salivariusAR809在干酪成熟過程中的實(shí)際促熟作用，并研究AR809對(duì)干酪益生功能特性的影響。