藜麥WRKY基因的進化與多脅迫條件下的轉(zhuǎn)錄應答

侯麗媛，賈舉慶，姜曉東，王育川，趙菁，陳禺懷，黃勝雄，吳慎杰*，董艷輝*

（1.山西農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，山西 太原 030031；2.山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西 晉中 030801；3.華中師范大學數(shù)學與統(tǒng)計學院，湖北 武漢 430079；4.合肥工業(yè)大學食品與生物工程學院，安徽 合肥 230009）

藜麥（Chenopodium quinoa），莧科藜亞科藜屬，為異源四倍體真雙子葉植物。全基因組測序表明藜麥起源于擁有A基因組的蒼白莖藜（Chenopodium pallidicaule）和B基因組的瑞典藜（Chenopodium suecicum），由這兩個祖先二倍體雜交而來［1］。藜麥在安第斯山脈區(qū)域的玻利維亞、秘魯、厄瓜多爾等國家有5000～7000年的種植歷史［1］，富含膳食纖維、礦物質(zhì)、各種維生素和人體必需的氨基酸，特別是賴氨酸和蛋氨酸［2-4］，被稱為“母親糧食”，更被聯(lián)合國糧食及農(nóng)業(yè)組織（Food and Agriculture Organization of the United Nations，F(xiàn)AO）評選為21世紀與食品安全相關(guān)的最有前景的作物之一，抗寒抗旱，有著比其他糧食作物更強地適應惡劣氣候和貧瘠土壤的能力［5］。

WRKY是植物轉(zhuǎn)錄因子中成員數(shù)目龐大的家族之一，特征在于其DNA結(jié)合域：WRKY結(jié)構(gòu)域［6-8］。WRKY結(jié)構(gòu)域包括一個非常保守的七肽WRKYGQK和位于其C端的C2H2或C2HC類型的鋅指結(jié)構(gòu)。基于WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)類型，WRKY家族成員可以被劃分為3組［6-9］：Ⅰ組成員含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域，Ⅱ和Ⅲ組成員分別只有1個WRKY結(jié)構(gòu)域。Ⅰ組與Ⅱ組成員都具有C2H2類型的鋅指結(jié)構(gòu)；而Ⅲ組成員的鋅指結(jié)構(gòu)為C2HC。基于WRKY結(jié)構(gòu)域中氨基酸保守位點的不同，Ⅱ組成員進一步劃分為5個亞組：Ⅱ-a、Ⅱ-b、Ⅱ-c、Ⅱ-d和Ⅱ-e［9］。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子廣泛參與了植物對各種生物和非生物脅迫的應答反應，是一種重要的抗逆調(diào)節(jié)基因［10-12］。鑒于其重要性，目前該基因在抗逆方面的功能研究在糧食油料作物和蔬菜水果類園藝植物中被廣泛開展。基于干旱轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從玉米（Zea mays）中鑒定得到一個受干旱誘導表達的WRKY基因，ZmWRKY106［13］。ZmWRKY106的表達水平受干旱、高溫和外源脫落酸（abscisic acid，ABA）的誘導。異源過表達該基因的擬南芥（Arabidopsis thaliana）植株表現(xiàn)出對干旱和高溫脅迫的耐受性增強［13］。大豆（Glycine max）的GmWRKY12在正常條件下，其表達維持在低水平；干旱和鹽脅迫條件下，顯著地被誘導高表達。干旱和鹽脅迫下，GmWRKY12轉(zhuǎn)基因大豆植株表現(xiàn)出耐受性增強；同時轉(zhuǎn)基因大豆中脯氨酸（proline，Pro）含量大幅增加［14］。過表達番茄（Lycopersicon esculentum）SlWRKY8的轉(zhuǎn)基因番茄植株顯示出對丁香假單胞桿菌番茄治病變種（Pseudomonas syringaepv.tomato，Pst）Pst.DC3000的抗性顯著增強?？共』騍lPR1a1和SlPR7在轉(zhuǎn)基因植株中的表達水平顯著上調(diào)。同時，轉(zhuǎn)基因番茄植株表現(xiàn)出對干旱和鹽的耐受性［15］。小麥（Triticum aestivum）的TaWRKY46在聚乙二醇（polythylene glycol，PEG）處理下上調(diào)表達［16］。過表達TaWRKY46的擬南芥植株在含有甘露醇的1/2 MS培養(yǎng)基上具有更快的萌發(fā)速度和更長的根長，表現(xiàn)出更強的耐滲透脅迫能力［16］。

藜麥基因組測序研究完成時間較晚［1］，WRKY基因的功能研究相對很少。高溫脅迫條件下，部分藜麥WRKY基因表現(xiàn)出顯著差異的表達水平［17］。部分藜麥WRKY基因被推測可能是cqu-miR156b的靶基因，通過小分子RNA的調(diào)控，參與了植物的發(fā)育和抗逆調(diào)控［18］。本研究利用生物信息學方法，在全基因組水平對藜麥WRKY基因家族進行系統(tǒng)地研究和分析，包括家族成員分類、WRKY結(jié)構(gòu)域的氨基酸保守位點比較、系統(tǒng)進化樹構(gòu)建、不同脅迫條件下WRKY基因表達模式解析，以及WRKY家族成員數(shù)目擴增的動力分析。本研究結(jié)果可為藜麥進一步的遺傳改良提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 藜麥和祖先二倍體WRKY基因的挖掘

從藜麥基因組數(shù)據(jù)庫（www.cbrc.kaust.edu.sa/chenopodiumdb）下載藜麥、藜麥祖先二倍體蒼白莖藜和瑞典藜的基因組和全部編碼蛋白序列。利用HMMER 3.0軟件［19］，基于從Pfam數(shù)據(jù)庫［20］（pfam.xfam.org）下載的WRKY結(jié)構(gòu)域文件（編號：PF03106），對藜麥基因組編碼的蛋白序列進行WRKY蛋白序列的比對。比對得到的WRKY蛋白序列中的WRKY結(jié)構(gòu)域，在InterPro數(shù)據(jù)庫［21］（www.ebi.ac.uk/interpro）中進行WRKY結(jié)構(gòu)域的確認，確認后的序列即為準確的藜麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子。

1.2 藜麥WRKY蛋白序列的保守域組成鑒定

參考已發(fā)表物種的WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究數(shù)據(jù)和InterPro數(shù)據(jù)庫［21］WRKY結(jié)構(gòu)域的確認結(jié)果，對WRKY結(jié)構(gòu)域，結(jié)構(gòu)域大小和邊界進行確定。同時，利用InterPro和SMART（smart.embl-heidelberg.de）數(shù)據(jù)庫，對WRKY結(jié)構(gòu)域以外的其他蛋白保守域進行鑒定。

1.3 藜麥WRKY基因的系統(tǒng)進化樹構(gòu)建

利用MAFFT程序［22］對藜麥WRKY成員的WRKY結(jié)構(gòu)域的蛋白序列進行多序列比對，默認參數(shù)。基于比對結(jié)果，通過IQ-TREE 1.6.12程序［23］構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，最適合建樹模型由內(nèi)置的ModelFinder［24］檢測設定，自展值設置為1000。

1.4 藜麥WRKY基因的擴增動力分析

從葡萄（Vitis vinifera）基因組數(shù)據(jù)庫（www.genoscope.cns.fr/externe/GenomeBrowser/Vitis/）下載葡萄的基因組和全部編碼蛋白序列。利用本地BLASTP程序構(gòu)建了藜麥基因組編碼所有蛋白的本地數(shù)據(jù)庫，分別與葡萄（V.vinifera）、祖先二倍體蒼白莖藜（C.pallidicaule）和瑞典藜（C.suecicum）進行全基因組范圍的蛋白序列比對，E值≤1E-05。利用JCVI程序［25］，提取物種間的同源基因組模塊。將位于同源基因組模塊的WRKY基因利用Circos軟件［26］進行可視化，并分析藜麥WRKY基因的擴增動力。

1.5 藜麥WRKY基因在不同組織和脅迫條件下的表達譜

從NCBI的Bioproject下載藜麥轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)：1）葉、莖和花簇的轉(zhuǎn)錄組（編號：PRJNA394651）；2）干旱、高溫、鹽和低磷脅迫條件下藜麥幼苗的轉(zhuǎn)錄組（編號：PRJNA306026）；3）花生（Arachis hypogaea）褪綠扇形斑病毒（groundnut chlorotic fan-spot virus，GCFSV）侵染藜麥幼苗的轉(zhuǎn)錄組（編號：PRJNA349075）。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用R包Pheatmap，對藜麥WRKY基因在不同組織葉、莖、花簇中的表達情況，以及干旱、高溫、鹽、低磷脅迫和GCFSV侵染下轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)表達變化進行分析，采用R包Pheatmap軟件，以Euclidean距離衡量標準和Median聚類方法作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 藜麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族成員

通過系統(tǒng)的生物信息學分析，藜麥WRKY家族成員數(shù)目最終確定為90個（表1）。依據(jù)WRKY基因在藜麥染色體上的相對位置，依次對藜麥WRKY家族成員進行編號。詳細的藜麥WRKY家族成員信息見表1，包括數(shù)據(jù)庫編號、染色體定位、蛋白序列長度、WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)目和成員分組。藜麥WRKY家族成員蛋白序列的平均長度為367 aa，其中蛋白序列最長和最短的成員分別為CqWRKY38（1178 aa）和CqWRKY07（84 aa）。

表1 藜麥WRKY家族成員Table 1 The WRKY family members in C.quinoa

續(xù)表Continued Table

藜麥基因組每條染色體上都存在WRKY基因，定位信息顯示基因主要分布在染色體的兩端。藜麥WRKY基因染色體定位呈現(xiàn)出染色體特異的分布；其中1號染色體上分布多達12個WRKY基因；而3、17、11、18號染色體上分別只有3、3、2、2個WRKY基因（圖1）。

圖1 藜麥WRKY基因的染色體定位Fig.1 The chromosomal location of C.quinoa WRKY genes

2.2 藜麥WRKY家族成員的分組

基于WRKY保守域的數(shù)目和鋅指結(jié)構(gòu)類型，將90個藜麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子劃分為3個大類群：其中18個含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域，且鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2的成員被劃分為Ⅰ組；12個含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，且鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2HC的成員劃分為Ⅲ組；Ⅱ組含有46個WRKY轉(zhuǎn)錄因子，含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，且鋅指結(jié)構(gòu)為C2H2類型。此外，還有14個WRKY轉(zhuǎn)錄因子因WRKYGQK短肽的缺失，以及鋅指結(jié)構(gòu)變異較大而未劃分到任何分組（表1）。

進一步提取了Ⅱ組46個成員的WRKY結(jié)構(gòu)域的蛋白序列?；诙嘈蛄斜葘Y(jié)果中氨基酸保守位點的差異（圖2），Ⅱ組成員進一步被劃分為5個亞組：Ⅱ-a（9個），Ⅱ-b（4個），Ⅱ-c（13個），Ⅱ-d（10個）和Ⅱ-e（10個）（表1和圖2）。分別在藜麥WRKY轉(zhuǎn)錄因 子Ⅱ-c組CqWRKY05和CqWRKY23，Ⅱ-e組CqWRKY67和CqWRKY79的蛋白序列中，發(fā)現(xiàn)了變異的WRKYGQK短肽（圖2）。WRKYGQK的變異短肽為WRKYGKK（CqWRKY05、CqWRKY23）和WRKYGEK（CqWRKY67、CqWRKY79）。CqWRKY19蛋白序列中發(fā)生了WRKYGQK短肽的缺失。此外，CqWRKY45（Ⅱ-a）、CqWRKY12（Ⅱ-c）、CqWRKY42（Ⅱ-c）、CqWRKY51（Ⅱ-c）、CqWRKY65（Ⅱ-d）其鋅指結(jié)構(gòu)存在組氨酸位點的缺失（圖2）。

圖2 藜麥Ⅱ組WRKY成員的WRKY結(jié)構(gòu)域蛋白序列比對Fig.2 The alignment of WRKY domain peptide sequences in groupⅡC.quinoa WRKYs

2.3 藜麥WRKY基因的系統(tǒng)進化樹

本研究提取了能夠分組的76個藜麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子中的84個完整的WRKY結(jié)構(gòu)域蛋白序列進行比對分析，繼而構(gòu)建了藜麥WRKY基因的系統(tǒng)進化樹（圖3）。Ⅰ組成員同一蛋白序列中的兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，依據(jù)其在序列中的相對位置，分別命名為N端和C端結(jié)構(gòu)域（圖3）。

圖3 藜麥WRKY基因的系統(tǒng)進化樹Fig.3 The phylogentic tree of WRKY genes in C.quinoa

進化樹中聚類的大分支非常明顯，來自不同組別的藜麥WRKY基因都聚成了組別特異的分支（圖3），包括分支Ⅰ-N（Ⅰ組N端的WRKY結(jié)構(gòu)域）、分支Ⅰ-C（Ⅰ組C端的WRKY結(jié)構(gòu)域）、分支Ⅲ（Ⅲ組成員），這3個分支都屬于單系群。Ⅱ組的成員主要呈現(xiàn)出兩個分支聚類，一個分支包括了Ⅱ-a、Ⅱ-b和Ⅱ-c組的成員，另外的則由Ⅱ-d和Ⅱ-e構(gòu)成。整個進化樹中，來自不同組別的分支進一步聚成5個主要的分支，包括group 1（Ⅱ-d和Ⅱ-e）、group 2（Ⅰ-C）、group 3（Ⅱ-a、Ⅱ-b和Ⅱ-c）、group 4（Ⅰ-N）和group 5（Ⅲ）。進化樹中，藜麥WRKY成員的聚類結(jié)果與之前基于結(jié)構(gòu)域特征的分組完全一樣，進一步支持了本研究的準確性。

2.4 藜麥WRKY轉(zhuǎn)錄因子蛋白序列的保守域組成

基于InterPro數(shù)據(jù)庫，對藜麥WRKY的蛋白序列的保守域組成進行分析。在17條WRKY蛋白序列中，發(fā)現(xiàn)了除WRKY結(jié)構(gòu)域以外的其他保守域的存在（圖4）。這17條WRKY蛋白序列主要分布在Ⅱ-d（10條）。另外7條序列分別分布在Ⅰ組（1條）、Ⅱ-a（2條）、Ⅱ-c（2條）和Ⅲ組（2條）。

圖4 藜麥WRKY蛋白序列中保守域的分布Fig.4 The distribution of conserved domains in C.quinoa WRKY protein sequences

保守域分析結(jié)果表明：分組間各自存在著特異的保守域組成，且同一分組中的WRKY成員擁有一致的保守域組成（圖4）。相似的氨基酸保守域組成暗示著可能存在相近的基因功能。Ⅲ組成員的保守域為WRKY、NBARC和LRR_8；Ⅱ-a成員的保守域為WRKY和UQ_con；Ⅰ組的CqWRKY69的保守域為WRKY、DUF4371和Dimer_Tnp_hAT。此外，Ⅱ-c和Ⅱ-d在進化關(guān)系上屬于相近的組，兩個組成員的保守域組成均為WRKY和Plant_zn_clust。

2.5 藜麥WRKY基因的擴增動力

藜麥為異源四倍體植物，來源于分別含有A基因組的蒼白莖藜和B基因組的瑞典藜兩個祖先二倍體的雜交［1］。如果兩個親本的所有遺傳物質(zhì)都被繼承，且祖先物種基因組中WRKY基因在后續(xù)進化中沒有丟失，那么祖先二倍體A基因組的蒼白莖藜和藜麥、B基因組的瑞典藜和藜麥之間的WRKY同源基因?qū)旧蠎鶠?對應2的同源關(guān)系：即蒼白莖藜和瑞典藜的1個WRKY基因分別在藜麥中能找到2個同源的WRKY基因（在本研究的后續(xù)表示中，將不同對應的同源關(guān)系用Vs符號表示）。

基于藜麥WRKY基因的鑒定方法，在祖先二倍體蒼白莖藜和瑞典藜的基因組序列中分別鑒定得到46和45個WRKY基因。運用本地BLASTP程序，對全基因組編碼蛋白序列進行兩兩比對，并用JCVI程序分別進行了藜麥基因組與兩個祖先二倍體蒼白莖藜和瑞典藜基因組之間同源基因組模塊和模塊上面同源WRKY基因的鑒定。結(jié)果顯示：蒼白莖藜和藜麥之間，瑞典藜和藜麥之間存在1 Vs 2同源關(guān)系的WRKY基因?qū)Ψ謩e有52和32對（圖5）。此外，兩個祖先二倍體蒼白莖藜、瑞典藜和藜麥的同源WRKY基因之間還存在著1 Vs 1同源關(guān)系的WRKY基因分別有10和13對（圖5），2 Vs 1同源關(guān)系的分別有5和7對（圖5）。這些復雜的WRKY同源基因?qū)M一步說明藜麥進化過程中存在著WRKY基因的丟失與擴增。

圖5 蒼白莖藜、瑞典藜和藜麥之間的WRKY基因的保留與丟失Fig.5 Reservation and loss of the WRKY genes between C.pallidicaule，C.suecicum and C.quinoa

本研究將蒼白莖藜和藜麥、瑞典藜和藜麥之間1 Vs 2同源關(guān)系的WRKY基因?qū)M行展示（圖6）。藜麥中嚴格意義上分別遺傳自蒼白莖藜和瑞典藜的1 Vs 2同源關(guān)系的WRKY基因?qū)τ?0對，這些來自祖先種的WRKY基因在藜麥雜交形成后得到了保留（圖6A）。此外，祖先二倍體和藜麥之間存在一些特殊的1 Vs 2同源關(guān)系的WRKY基因?qū)Γ还灿?4對（圖6B）。這些祖先二倍體的WRKY基因在藜麥中對應的2個同源WRKY基因只落在了A或B亞基因組。表明這些藜麥WRKY基因所在的基因組區(qū)域發(fā)生了染色體的重組。

圖6 蒼白莖藜、瑞典藜和藜麥之間的WRKY基因的保留與丟失Fig.6 Reservation and loss of the WRKY genes between C.pallidicaule，C.suecicum and C.quinoa

2.6 藜麥WRKY基因在多個脅迫條件下的表達譜

基于干旱、高溫、鹽和低磷脅迫，以及GCFSV侵染下藜麥幼苗的RNA-seq數(shù)據(jù)，解析了藜麥WRKY基因的表達譜（圖7）。在干旱、高溫、鹽和低磷等不同脅迫條件下，25個WRKY基因明顯地被誘導或抑制表達（圖中呈現(xiàn)的是在至少一個脅迫條件下的基因表達值≥5）（圖7A）。CqWRKY76和CqWRKY83在對照組和脅迫條件下，都顯現(xiàn)比較高的表達水平（最低基因表達值22.53）。鹽和低磷脅迫下，CqWRKY76表達水平大約只有對照組的50%；干旱條件下，CqWRKY83表達水平下降到對照組的50%，低磷脅迫下上升了1.6倍以上（74.01/46.20）（圖7A）。此外，同樣在對照組和脅迫條件下呈現(xiàn)出較高表達水平的CqWRKY26和CqWRKY40，分別在干旱和鹽脅迫、干旱和高溫脅迫條件下的表達水平與對照組相比下調(diào)近50%。CqWRKY72和CqWRKY84呈現(xiàn)出脅迫特異性的誘導表達，在高溫條件下，表達上調(diào)了2～3倍（圖7A）。此外，CqWRKY05、CqWRKY07、CqWRKY20、CqWRKY21、CqWRKY23和CqWRKY48在干旱和高溫條件的表達幾乎被完全抑制，呈現(xiàn)出極低的表達水平；CqWRKY21在低磷脅迫下表達卻被上調(diào)了2倍以上（圖7A）。

圖7 藜麥WRKY基因在干旱、高溫、低磷和鹽脅迫和GCFSV侵染下的基因表達譜Fig.7 The CqWRKY genes’expression profiles under the stresses of drought，heat，low P and salt and GCFSV infection

在GCFSV侵染藜麥幼苗條件下，42個WRKY基因表現(xiàn)出明顯地被誘導或抑制表達（基因表達值≥10）（圖7B）。在干旱、高溫、低磷和鹽脅迫中顯著上調(diào)或下調(diào)表達的基因中，CqWRKY05、CqWRKY20、CqWRKY21、CqWRKY23同樣在GCFSV侵染下呈現(xiàn)出強誘導上調(diào)表達趨勢（圖7B）。相較對照，CqWRKY20、CqWRKY21表達分別被上調(diào)了10和20倍。推測這2個WRKY基因可能屬于藜麥中的重要調(diào)控基因，廣泛參與了藜麥生物與非生物脅迫（干旱、高溫和低磷）下的調(diào)控應答。此外，CqWRKY36、CqWRKY42、CqWRKY47和CqWRKY78在GCFSV侵染下，也呈現(xiàn)出強誘導上調(diào)表達趨勢（圖7B）。

3 討論

藜麥在進化過程中發(fā)生過一次祖先二倍體種間雜交所帶來的全基因組倍增事件［1］，藜麥基因組保留了大量祖先種基因組的同源序列。兩個祖先二倍體蒼白莖藜和瑞典藜的基因組序列在藜麥基因組中分別存在著14.6%和46.5%的同源DNA序列［1］。此外，作為很早分化出來的植物，葡萄基因組中只存在著一次大多數(shù)真雙子葉植物所共有的全基因組倍增，γ倍增事件［27］。然而，葡萄基因組倍增后，其發(fā)生了大規(guī)模的片段丟失和重組。雖然都只經(jīng)歷了一次全基因組倍增，但與葡萄相比，藜麥的基因組進化更為保守。

為了比較WRKY基因在上述兩物種間的進化差異，在藜麥和葡萄基因組間進行了同源基因組模塊的鑒定，對定位其中的WRKY同源基因?qū)M行了統(tǒng)計。藜麥和葡萄基因組中分別有68和41個WRKY基因可以定位在兩物種之間的同源基因組模塊中。將上述同源模塊中的WRKY同源基因?qū)M行統(tǒng)計，發(fā)現(xiàn)葡萄和藜麥WRKY基因之間存在著1 Vs 1、1 Vs 2、2 Vs 1和多Vs多同源關(guān)系的WRKY基因?qū)Ψ謩e有5、44、2和30對（圖8）。以上數(shù)據(jù)表明：基因組倍增以后，藜麥基因組保留了相當數(shù)目的WRKY同源基因。相反，在葡萄基因組中，大量倍增基因被丟失。

圖8 以葡萄為參照的藜麥WRKY基因的倍增Fig.8 Conservation of the WRKY genes in C.quinoa based on the comparisons to those in V.vinifera

干旱、高溫、鹽、低磷脅迫及GCFSV侵染藜麥幼苗的RNA-seq數(shù)據(jù)揭示了受到這些脅迫誘導而顯著上、下調(diào)表達的WRKY基因（圖7）。此外，對藜麥WRKY基因在葉片、花和莖的表達也進行了分析。44個WRKY基因在上述組織中存在一定的表達水平（至少一個組織中表達值≥10）（圖9）。13個WRKY基因，包括CqWRKY26、CqWRKY39、CqWRKY40、CqWRKY41、CqWRKY64、CqWRKY66、CqWRKY72、CqWRKY76、CqWRKY80、CqWRKY82、CqWRKY83、CqWRKY84和CqWRKY86在這3個組織中恒定地高水平表達（表達值＞40）（圖9）。這些組成型高表達成員中的6個WRKY基因，包括CqWRKY26、CqWRKY40、CqWRKY72、CqWRKY76、CqWRKY83和CqWRKY84，在干旱、高溫、鹽、低磷脅迫或GCFSV侵染下顯著誘導或抑制表達（圖7）。CqWRKY72在擬南芥中的同源基因AtWRKY40被證明是ABA信號途徑［28］（調(diào)控種子萌發(fā)、根長和幼苗的發(fā)育）和包括白粉病侵染［29］、高鹽［30］、滲透脅迫［30］、強光脅迫［31］等逆境應答的轉(zhuǎn)錄抑制因子基因。

圖9 藜麥WRKY基因在花簇、葉和莖中的表達譜Fig.9 The expression profiles of CqWRKY genes in inflorescence，leaf and stem

此外，部分WRKY基因呈現(xiàn)出組織特異性的表達。CqWRKY07、CqWRKY48、CqWRKY56、CqWRKY68、CqWRKY87在花和葉片中表達水平極低，在莖中高表達（圖9）；CqWRKY01和CqWRKY13在葉片中相對高表達（圖9）；CqWRKY43和CqWRKY59在花中相對高表達（圖9）。同時，在莖中高表達的CqWRKY07和CqWRKY48的表達水平受到干旱和高溫的抑制（圖7A），以及GCFSV侵染誘導其顯著上調(diào)（圖7B）。CqWRKY48在擬南芥中的同源基因AtWRKY13的突變體促進了開花［32］，卻影響了莖稈的正常發(fā)育［33］，其突變體中大量木質(zhì)素合成相關(guān)基因的表達被抑制。此外，AtWRKY13可以通過正調(diào)控PDR8［34］和D-CYSTEINE DESULFHYDRASE［35］編碼基因的表達，提高擬南芥對鎘的耐受性。上述藜麥WRKY基因在藜麥的逆境應答和生長發(fā)育的過程中，推測屬于關(guān)鍵的調(diào)節(jié)基因。

4 結(jié)論

基于系統(tǒng)的生物信息學方法，在藜麥基因組中共鑒定得到90個WRKY基因；劃分為3組：Ⅰ組（18個）、Ⅱ組（46個）和Ⅲ組（12個），其中Ⅱ組成員進一步被劃分為5個亞組：Ⅱ-a（9個），Ⅱ-b（4個），Ⅱ-c（13個），Ⅱ-d（10個）和Ⅱ-e（10個）。藜麥WRKY基因進化樹中家族成員的聚類結(jié)果和分組完全一致，進一步支持了成員分組的可靠性。藜麥和祖先二倍體蒼白莖藜、瑞典藜的同源基因組模塊分析表明，藜麥WRKY基因數(shù)目增加主要源于全基因組的倍增。干旱、高溫、鹽、低磷脅迫和GCFSV侵染下，大量WRKY基因的表達水平被顯著誘導或抑制，這些WRKY基因很可能參與了藜麥逆境應答的調(diào)控。