堿蓬根際和內(nèi)生細(xì)菌菌株對鹽堿脅迫下苜蓿生長的影響

苗陽陽，張艷蕊，宋標(biāo)，劉旭桐，張安琪，呂金澤，張浩，張小華，歐陽佳慧，李旺，曲善民

（黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院草業(yè)科學(xué)系，黑龍江省寒區(qū)飼料資源高效利用與營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，黑龍江 大慶 163319）

土地鹽堿化治理已成為全球農(nóng)業(yè)最重要的問題之一，鹽分會導(dǎo)致耕地面積、作物生產(chǎn)力和作物質(zhì)量大幅度下降［1］。近年來，隨著氣候變化和人類生產(chǎn)活動的影響，土壤鹽堿化程度進(jìn)一步加重。鹽堿化影響了全世界20%的耕地，嚴(yán)重威脅著農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)環(huán)境的建設(shè)［2-3］。大慶地處松嫩平原西部，黑龍江省西南部，其土壤主要為蘇打鹽堿化草甸土和沼澤化草甸土。近年來，由于油田開發(fā)和其他人為因素的影響，土壤鹽堿化逐漸加重［4］。堿蓬（Suaeda glauca）是藜科（Chenopodiaceae）堿蓬屬（Suaeda）植物，對鹽堿具有高度適應(yīng)性，能保護(hù)和改良土壤、消除裸露鹽堿荒灘，防止水土流失，對保持和重建鹽堿地生態(tài)有重要作用，被譽為鹽堿地改造的“先鋒植物”［5-6］。堿蓬作為真鹽生植物，體內(nèi)鹽含量相對較高，而絕大多數(shù)微生物生長在低鹽環(huán)境中，因此推測堿蓬內(nèi)生菌屬于極端微生物之一的嗜鹽微生物，其內(nèi)生細(xì)菌和根際細(xì)菌具有特殊的生理生化性質(zhì)，具有較高的研究價值［7］。

在當(dāng)前“綠水青山就是金山銀山”的生態(tài)理念下，資源節(jié)約和環(huán)境保護(hù)已成為我國發(fā)展的基本國策，綠色生態(tài)也成為現(xiàn)代農(nóng)業(yè)發(fā)展的內(nèi)在要求。鑒于此，人們一直在努力尋找新的生物治理途徑——在不投入巨資改變鹽堿地原有性狀的前提條件下，通過微生物與植物的相互作用來提高植物的耐鹽堿性，改善鹽堿土狀況，其有望成為利用鹽堿地的新措施。植物促生細(xì)菌（plant growth promoting bacteria，PGPB）包括植物根際促生細(xì)菌（plant rhizosphere growth promoting bacteria，PGPR）和定殖于植物體內(nèi)的內(nèi)生細(xì)菌，可促進(jìn)植物生長及其對礦物質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用，是一類可抑制有害生物的有益菌株［8-9］，可有效減輕植物的鹽堿脅迫損傷。合理施用PGPB可促進(jìn)植物生長，提高作物產(chǎn)量及通過誘導(dǎo)植物產(chǎn)生系統(tǒng)抗性來抵御生物和非生物脅迫［10］。由于鹽堿地土壤含鹽量和pH都較高，酸性和中性土壤中篩選得到的PGPB在鹽堿環(huán)境中很難存活定殖，在酸性、中性土壤中有很好促生效果的菌株在鹽堿土中很難發(fā)揮促生作用，所以普通促生細(xì)菌在鹽堿地應(yīng)用困難。近年來耐鹽堿促生細(xì)菌促進(jìn)鹽堿脅迫下植物生長的研究備受關(guān)注，研究發(fā)現(xiàn)接種含ACC脫氨酶（1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸脫氨酶）活性的根際促生菌可緩解鹽堿脅迫，減緩植物體內(nèi)乙烯積累，增加作物產(chǎn)量［11-12］。向君亮等［13］發(fā)現(xiàn)在鹽堿脅迫條件下，將從大慶草原鹽堿土中分離出的耐鹽堿堀越氏芽孢桿菌（Bacillus horikoshii）S11浸種苜蓿（Medicago sativa）后，能顯著促進(jìn)苜蓿種子的萌發(fā)及幼苗的生長。劉佳莉［14］從鹽堿土植物根際篩選的促生細(xì)菌可以增加鹽堿地大田中紫花苜蓿的生物量，提高紫花苜蓿的品質(zhì)。

紫花苜蓿素有“牧草之王”的美譽，具有一定的耐鹽堿能力，適當(dāng)?shù)柠}堿脅迫不會對苜蓿的產(chǎn)量和營養(yǎng)品質(zhì)造成影響，而中、重度鹽堿會抑制苜蓿生長［15］。隨著草原以及耕地土壤鹽堿化程度的加劇，可種植苜蓿的土地面積也逐漸減少［16］。因此提高苜蓿的耐鹽堿能力對我國畜牧業(yè)發(fā)展和鹽堿地改良具有重要意義。本試驗應(yīng)用前期篩選的堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌澆灌紫花苜蓿幼苗根部，并根據(jù)松嫩平原鹽堿地鹽堿成分情況，以中性鹽（NaCl、Na2SO4）和堿性鹽（NaHCO3、Na2CO3）按NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3=9∶1∶1∶9混合，并設(shè)置0、100、150、200 mmol·L-1鹽堿濃度脅迫苜蓿幼苗，研究堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿幼苗生長及生理的影響，為提高苜蓿耐鹽堿性，改善鹽堿脅迫對苜蓿生長及生理影響提供依據(jù)，為研制和開發(fā)鹽堿土壤生物制劑奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 堿蓬采樣區(qū)概況 鹽堿樣地位于黑龍江省大慶市采油三廠第五礦區(qū)周圍草地，地理位置為46°41′-46°42′N，124°59′-124°60′E，試驗于2019年6月采樣。該地屬于大陸性半干旱溫帶草原氣候，降水量最大時期為7月。土壤為鹽堿土，pH為8.7～9.3，主要優(yōu)勢植物有堿蓬、鵝觀草（Roegneria kamoji）、羊草（Leymus chinensis）、大籽蒿（Artemisia sieversiana）等。

1.1.2 供試菌株 分別為前期從上述鹽堿地采樣區(qū)采集的堿蓬根內(nèi)、根際土壤及莖內(nèi)分離的JG1、JT4和JJ5（表1），經(jīng)鑒定后保存在黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)草業(yè)科學(xué)實驗室。

表1 堿蓬根際細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌菌株Table 1 Rhizobacteria and endophytic bacteria of S.glauca

1.1.3 供試種子 紫花苜蓿種子龍牧801（M.sativaLongmu No.801）由黑龍江省畜牧研究所提供，保存于黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)草業(yè)科學(xué)實驗室。

1.1.4 培養(yǎng)基 LB液體培養(yǎng)基［17］。

1.2 方法

1.2.1 菌懸液制備 將分離自堿蓬根際土壤及不同組織的細(xì)菌菌株JG1、JT4和JJ5接種于LB液體培養(yǎng)基，于28℃、180 r·min-1搖床培養(yǎng)，待菌體濃度達(dá)到106cfu·mL-1時終止培養(yǎng)。

1.2.2 苜蓿幼苗培養(yǎng)及處理 細(xì)沙洗凈150℃高溫持續(xù)烘干5 h后，121℃滅菌26 min，連續(xù)滅菌5次，待冷卻后裝入75%乙醇消毒且杯底扎有網(wǎng)眼的塑料杯（直徑5.0 cm，高11.5 cm），將其放入水培盒中（長24 cm，寬15 cm，高5 cm，350 g·杯-1）。選取顆粒飽滿且大小一致的苜蓿種子消毒（75%浸泡30 s，用無菌水每次1 min清洗4～5次）后于人工氣候培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行催芽后移栽至塑料杯中。每處理水培盒內(nèi)加200 mL Hoagland有氮營養(yǎng)液，使其從杯底由下至上浸濕［18］，幼苗生長過程中用無菌蒸餾水補充水分。

待苜蓿幼苗長出真葉后，每杯定苗15株，幼苗根部澆灌堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌菌懸液，25 mL·杯-1，澆灌7 d后將NaCl、Na2SO4、NaHCO3、Na2CO3按照9∶1∶1∶9鹽堿比例混合，鹽堿溶液濃度為0、100、150、200 mmol·L-1，25 mL·杯-1澆灌苜蓿幼苗根部。每15 d澆灌200 mL Hoagland無氮營養(yǎng)液，自然光照45 d收獲幼苗測定相關(guān)指標(biāo)。

1.3 測定指標(biāo)

1.3.1 鹽堿脅迫下苜蓿生長指標(biāo)和生物量的測定 隨機選5株紫花苜蓿用直尺測量絕對高度和分枝數(shù)。分別測量地上和根部鮮重［19-20］。各指標(biāo)重復(fù)測定3次。

1.3.2 鹽堿脅迫下苜蓿根系耐鹽堿性生理指標(biāo)的測定 采用愈創(chuàng)木酚法測定過氧化物酶（peroxidase，POD）活性；采用氮藍(lán)四唑（nitroblue tetrazolium，NBT）顯色法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性；采用硫代巴比妥酸（thiobarbituric acid，TBA）法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量；采用酸性茚三酮比色法測定脯氨酸含量，以上試驗方法參考《植物生理學(xué)實驗指導(dǎo)》［21］。

1.3.3 鹽堿脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量的測定 采用SPAD-502Plus葉綠素儀（KONICA MINOLTA，INC公司）測定葉片葉綠素含量。

1.3.4 綜合耐鹽堿性評價指標(biāo) 采用隸屬函數(shù)綜合評價法，對與抗性呈正相關(guān)參數(shù)的株高、分枝數(shù)、地上和根鮮重、脯氨酸、POD、SOD、葉綠素采用公式：Fi=（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）計算；對與抗性呈負(fù)相關(guān)參數(shù)的MDA，采用公式：Fi=1-（Xi-Xmin）/（Xmax-Xmin）計算。式中：Xi為i個指標(biāo)值；Xmin為i指標(biāo)的最小值；Xmax為i指標(biāo)的最大值。然后分別對細(xì)菌菌株處理的紫花苜蓿耐鹽堿隸屬函數(shù)值進(jìn)行累加，求平均值后得到該處理的隸屬度值，隸屬度值越大，該細(xì)菌菌株對鹽堿脅迫下紫花苜蓿促生效果越好。

為篩選促生細(xì)菌對紫花苜蓿耐鹽堿性的主要對比指標(biāo)，對鹽堿脅迫下紫花苜蓿各單項指標(biāo)的耐鹽系數(shù)ω分別進(jìn)行主成分分析，其計算公式如下：ω=不同鹽堿脅迫處理濃度下的單項指標(biāo)平均測定值/對照組測定值。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2020進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和作圖。采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析（P＜0.05），試驗數(shù)據(jù)以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示，采用Duncan’s法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿生長和生物量的影響

2.1.1 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿株高的影響 如圖1所示，鹽堿濃度為0 mmol·L-1時 ，經(jīng)JT4處 理 后 苜 蓿 株 高 顯 著 高 于CK（P＜0.05），提高26.83%；100 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿株高均升高，但與CK均無顯著差異（P＞0.05）；150 mmol·L-1時，經(jīng)JG1和JT4處理后苜蓿株高顯著高于CK（P＜0.05），分別提高122.64%和69.81%；200 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后苜蓿株高顯著高于CK（P＜0.05），分別提高130.30%、196.97%和139.39%。

圖1 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿株高的影響Fig.1 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on plant height of alfalfa under salt-alkaline stress

2.1.2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿分枝數(shù)的影響 如圖2所示，鹽堿濃度為0 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后苜蓿分枝數(shù)均高于CK，其中經(jīng)JT4處理后分枝數(shù)顯著高于CK（P＜0.05），提高50.00%；100和150 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿分枝數(shù)均高于CK，但無顯著差異（P＞0.05）；200 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后苜蓿分枝數(shù)顯著高于CK（P＜0.05），分別提高100.00%、50.00%和100.00%。

圖2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿分枝數(shù)的影響Fig.2 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on branches number of alfalfa under salt-alkaline stress

2.1.3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿鮮重的影響 不同鹽堿濃度脅迫下，隨鹽堿濃度的升高苜蓿地上鮮重呈下降趨勢，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿的地上鮮重均提高（表2）。在鹽堿濃度為0 mmol·L-1時，經(jīng)JT4處理后苜蓿地上鮮重顯著高 于CK（P＜0.05），提 高317.64%；100 mmol·L-1時，經(jīng)JJ5處理后苜蓿地上鮮重顯著高于CK（P＜0.05），提高149.93%；150 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后，苜蓿地上鮮重均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高156.38%、86.11%和57.25%；200 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后苜蓿地上鮮重均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高315.04%、136.58%和248.81%。

表2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿地上鮮重的影響Table 2 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on the aboveground fresh weight of alfalfa under salt-alkaline stress（g·5 plant-1）

隨鹽堿濃度的升高苜蓿根鮮重呈先上升后下降趨勢，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿根鮮重均提高（表3）。在鹽堿濃度為0 mmol·L-1時，經(jīng)JT4處理后根鮮重顯著高于CK（P＜0.05），提高486.09%；100 mmol·L-1時，經(jīng)JG1和JJ5處理后，根鮮重顯著高于CK（P＜0.05），分別提高109.84%和263.66%；150 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4、JJ5處理后苜蓿根鮮重均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高182.97%、251.29%和1070.63%；200 mmol·L-1時，經(jīng)JG1和JJ5處理后根鮮重顯著高于CK（P＜0.05），分別提高914.80%和778.75%。

表3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿根鮮重的影響Table 3 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on root fresh weight of alfalfa under salt-alkaline stress（g·5 plant-1）

2.2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿根系生理指標(biāo)的影響

2.2.1 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿過氧化物酶（POD）活性的影響 隨鹽堿濃度的升高苜蓿POD活性呈先上升后下降趨勢，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿的POD活性均提高（圖3）。在鹽堿濃度為0 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿POD活性均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高58.91%、93.46%和58.57%；100 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿POD活性均高于CK，但無 顯 著 差 異（P＞0.05）；150 mmol·L-1時 ，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后，苜蓿POD活性均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高51.21%、65.38%和71.15%；200 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后，苜蓿POD活性均顯著高于CK（P＜0.05），分別提高213.57%、162.51%和250.21%。

圖3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿POD活性的影響Fig.3 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on POD activity of alfalfa under salt-alkaline stress

2.2.2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿超氧化物歧化酶（SOD）活性的影響 如圖4所示，鹽堿 濃 度 為0 mmol·L-1時 ，經(jīng)JT4和JJ5處 理 后 苜 蓿SOD活 性 顯 著 高 于CK（P＜0.05），分 別 提 高57.34%和70.36%；100 mmol·L-1時，經(jīng)JT4處理后苜蓿SOD活性顯著高于CK（P＜0.05），提高70.33%；150 mmol·L-1時，JG1、JT4和JJ5均能顯著提高苜蓿SOD活性（P＜0.05），分別提高40.90%、132.75%和0.14%；200 mmol·L-1時 ，JG1和JT4處 理 后 苜 蓿SOD活 性 顯 著高于CK（P＜0.05），分別提高54.40%和110.69%。

圖4 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿SOD活性的影響Fig.4 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on SOD activity of alfalfa under salt-alkaline stress

2.2.3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿丙二醛（MDA）含量的影響 如圖5所示，在鹽堿 濃 度 為0和100 mmol·L-1時 ，除 鹽 堿 濃 度 為0 mmol·L-1時接種JG1后苜蓿MDA含量顯著低于CK（17.35%）（P＜0.05）外，其余處理的MDA含量均顯著高于CK（P＜0.05）。150 mmol·L-1時，JT4處理后苜蓿MDA含量顯著低于CK（11.28%）（P＜0.05）。200 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿MDA含量與CK均無顯著差異（P＞0.05）。

圖5 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿MDA含量的影響Fig.5 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on MDA content of alfalfa under salt-alkaline stress

2.2.4 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿脯氨酸含量的影響 如圖6所示，在鹽堿脅迫下隨著濃度的升高苜蓿脯氨酸含量呈先升高后下降趨勢，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿的脯氨酸含量均提高。鹽堿濃度為0 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后脯氨酸含量顯著高于CK（P＜0.05），分別提高了516.12%、686.86%和443.67%；100 mmol·L-1時，經(jīng)JG1處理后脯氨酸含量顯著高于CK（P＜0.05），提高了253.14%；150 mmol·L-1時，經(jīng)JJ5處理后苜蓿脯氨酸含量顯著高于CK（P＜0.05），提高了525.61%；200 mmol·L-1時，經(jīng)JT4處理后苜蓿脯氨酸含量顯著高于CK（P＜0.05），提高了528.38%。

圖6 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿脯氨酸含量的影響Fig.6 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on proline content of alfalfa under salt-alkaline stress

2.2.5 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量的影響 如圖7所示，鹽堿濃度為0 mmol·L-1時，JG1和JT4處理后苜蓿葉片葉綠素含量顯著高于CK（P＜0.05），其含量分別提高45.24%和51.59%；100 mmol·L-1時，經(jīng)JG1、JT4和JJ5處理后苜蓿葉片葉綠素含量均顯著高于CK（P＜0.05）；150 mmol·L-1時，JT4和JJ5處理后苜蓿 葉片葉綠素含量顯著高于CK（P＜0.05），其含量分別提高51.64%和48.14%；200 mmol·L-1時 ，經(jīng)JJ5處 理 后苜蓿葉片葉綠素含量顯著高于CK（P＜0.05），含量提高67.68%。

圖7 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿葉片葉綠素含量的影響Fig.7 Effects of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on leaf chlorophyll content of alfalfa under salt-alkaline stress

2.3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿生長影響的隸屬函數(shù)分析

如表4所示，通過隸屬函數(shù)法進(jìn)行耐鹽堿性綜合評價，0 mmol·L-1鹽堿脅迫下隸屬函數(shù)值排序及耐鹽堿性從大到小依次為：JT4＞JG1＞CK＞JJ5，在不同鹽堿脅迫下，隸屬函數(shù)值排序及耐鹽堿性從大到小均為：JT4＞JG1＞JJ5＞CK。表明經(jīng)堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌處理后均能提高苜蓿的耐鹽堿能力。

表4 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿耐鹽堿指標(biāo)隸屬函數(shù)分析Table 4 Comprehensive analysis of membership function values of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on alfalfa salt-alkaline tolerance indexes under salt-alkaline stress

2.4 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿生長影響的主成分分析

由表5可知，堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對0 mmol·L-1濃度下苜蓿耐鹽堿性指標(biāo)主成分分析共獲得3個主成分，第Ⅰ主成分中指標(biāo)所對應(yīng)的特征向量中株高、分枝數(shù)、地上鮮重、地下鮮重數(shù)值較大，主要反映出鹽堿脅迫下促生細(xì)菌對苜蓿的生長具有促進(jìn)作用。第Ⅱ主成分指標(biāo)所對應(yīng)的特征向量中MDA數(shù)值較大，為0.82，主要反映出鹽堿脅迫下堿蓬根際和內(nèi)生細(xì)菌可減弱鹽堿脅迫下苜蓿細(xì)胞的損傷。第Ⅲ主成分中指標(biāo)所對應(yīng)的特征向量中葉綠素數(shù)值較大，主要反映出鹽堿脅迫下堿蓬根際和內(nèi)生細(xì)菌具有促進(jìn)生長的作用。

表5 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿耐鹽堿性指標(biāo)主成分分析Table 5 Principal component analysis of salt-alkaline tolerance index of S.glauca rhizosphere growth-promoting bacteria and endophytic bacteria on alfalfa under salt-alkaline stress

堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿耐鹽堿性指標(biāo)主成分分析中，第Ⅰ主成分中株高、分枝數(shù)、地上鮮重、地下鮮重數(shù)值較大，主要反映出鹽堿脅迫下促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對苜蓿的生長具有促進(jìn)作用。第Ⅱ主成分中，當(dāng)鹽堿濃度為100 mmol·L-1時，POD數(shù)值較大，鹽堿濃度為150 mmol·L-1時，SOD數(shù)值較大，200 mmol·L-1時，MDA數(shù)值較大。主要反映出鹽堿脅迫下堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌可提高滲透調(diào)節(jié)能力，減弱鹽堿脅迫下苜蓿細(xì)胞的損傷。第Ⅲ主成分中指標(biāo)所對應(yīng)的特征向量中脯氨酸數(shù)值較大，主要反映出鹽堿脅迫下堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌可提高苜蓿滲透調(diào)節(jié)能力，提高其耐鹽堿脅迫能力。

3 討論

3.1 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿生產(chǎn)特性的影響

逆境對植物個體形態(tài)發(fā)育具有顯著影響，主要表現(xiàn)在植物組織和器官生長方面。生長抑制是植物對逆境脅迫最直接的表現(xiàn)，也是評價植物耐性最直觀的指標(biāo)。本研究表明，接種3株促生細(xì)菌菌株后均促進(jìn)苜蓿的生長，當(dāng)鹽堿濃度增加時，促生細(xì)菌表現(xiàn)出的促生效果更好。與向君亮等［13］的研究結(jié)果類似，非鹽堿脅迫條件下接種耐鹽堿菌株S11后，苜蓿種子的發(fā)芽率、發(fā)芽勢、株高、根長和葉綠素含量與對照相比并沒有顯著差異，但鹽堿脅迫條件下，接種S11處理后促進(jìn)了種子萌發(fā)和幼苗生長。本研究也發(fā)現(xiàn)在無鹽堿脅迫時，僅JT4對苜蓿株高、分枝數(shù)、鮮重有顯著促進(jìn)作用，說明菌株在正常生長環(huán)境下對苜蓿的促生長作用不明顯，可能是因為3株菌株分離自鹽堿環(huán)境，而正常處理時的環(huán)境不適宜菌株的生長，沒有在幼苗根部定殖，從而未發(fā)揮促生長作用。當(dāng)鹽堿濃度逐漸升高至200 mmol·L-1時，3株促生細(xì)菌對苜蓿的株高、分枝數(shù)和地上鮮重均有顯著促進(jìn)作用，消除了鹽堿脅迫對苜蓿生長的抑制作用，擴寬了苜蓿在鹽堿脅迫下生長的生態(tài)幅，增加了鹽堿地種植苜蓿的可行性。本研究利用實驗室前期從大慶鹽堿土上生長的堿蓬根內(nèi)（JG1）、莖內(nèi)（JJ5）和根際土壤內(nèi)（JT4）篩選出來的3株促生細(xì)菌處理鹽堿脅迫的紫花苜蓿，說明菌株對混合鹽堿具有良好的適應(yīng)能力，具有一定的應(yīng)用價值。

3.2 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿生理特性的影響

鹽堿脅迫下紫花苜蓿的SOD、POD活性和脯氨酸含量下降，MDA含量升高，對植株造成了嚴(yán)重傷害致使產(chǎn)量下降。植物的抗氧化酶系統(tǒng)可以有效清除植物體內(nèi)代謝活動產(chǎn)生的活性氧以減少不同程度的氧化損傷。SOD是植物細(xì)胞清除氧自由基傷害的第一道防線，是生物體內(nèi)一種很重要的抗氧化酶類，對于保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷有十分重要的作用，SOD活性可以不同程度地反映出植物對環(huán)境脅迫的抗逆情況［22-23］。POD是植物在逆境條件下酶促防御的關(guān)鍵酶之一，與SOD和過氧化氫酶（catalase，CAT）相互協(xié)調(diào)配合，以提高植物的抗逆性［24］。接種JG1、JT4、JJ5后苜蓿根系的SOD和POD活性均升高，減輕了鹽堿對紫花苜蓿生長的不利影響。說明3株促生細(xì)菌菌株誘導(dǎo)抗氧化酶（SOD和POD）活性，高活性的抗氧化酶與氧化應(yīng)激耐受性有關(guān)，植物的耐受性與抗氧化劑的產(chǎn)生有關(guān)。MDA一般作為植物逆境指標(biāo)，MDA含量的多少反映了膜損傷程度的大小，是常用的膜脂過氧化指標(biāo)之一［25］。高于150 mmol·L-1鹽堿脅迫下，接種堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌后可減弱根系MDA含量增加的趨勢，苜蓿損傷程度減小。脯氨酸含量被認(rèn)為是研究植物抗逆性的重要指標(biāo)，脯氨酸積累在逆境中對植物有保護(hù)作用［26］，經(jīng)堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌處理后苜蓿脯氨酸的含量升高，可見堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌可以提高苜蓿的耐鹽堿脅迫能力。鹽堿土種植的紫花苜蓿接種促生細(xì)菌后，紫花苜蓿的脯氨酸含量顯著增加，MDA含量降低，抗氧化酶SOD、POD活性顯著增強，與紫花苜蓿株高和生物量的增加相對應(yīng)，表明促生細(xì)菌菌株可以通過增加保護(hù)物質(zhì)的積累和提高抗氧化酶的活性來緩解鹽堿脅迫對紫花苜蓿造成的影響［14］。

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的主要物質(zhì)，苜蓿葉片光合特性、生理代謝和光合產(chǎn)物代謝的變化可共同影響植株生長發(fā)育。接種促生細(xì)菌可增加促進(jìn)苜蓿幼苗光合色素和葉片葉綠素含量，導(dǎo)致光合能力增強，從而積累更多的有機物，同時運輸?shù)降叵虏浚?7］，故本研究中添加3株菌株后苜蓿幼苗地上部和地下部生物量顯著增加，進(jìn)而提高紫花苜蓿的生產(chǎn)性能。說明選用的3株堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌在促進(jìn)植物適應(yīng)逆境脅迫方面具有良好的應(yīng)用潛力，但對鹽堿脅迫下苜蓿整個生長周期的生長和產(chǎn)量等的影響及其機理等方面還有待更進(jìn)一步的研究。目前高通量測序技術(shù)比較普及，后續(xù)試驗應(yīng)通過借助高通量測序技術(shù)探索3株菌株促進(jìn)植物生長及增強植物抗鹽堿性的作用機理。

3.3 堿蓬根際促生細(xì)菌和內(nèi)生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿的隸屬函數(shù)值排序及耐鹽堿性綜合評價

植物耐鹽堿性是由多種因素間的交互影響及協(xié)同作用而決定的，選取單一指標(biāo)進(jìn)行耐鹽堿性評定具有一定的局限性。因此本研究采用模糊隸屬函數(shù)及主成分分析法綜合評價促生細(xì)菌對苜蓿的耐鹽堿性影響。通過生長指標(biāo)和生理指標(biāo)共9個成分進(jìn)行主成分分析并結(jié)合隸屬函數(shù)值排序，表明不同促生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿促生效果為JT4＞JG1＞JJ5。從堿蓬根內(nèi)篩選的促生細(xì)菌JG1和從堿蓬根際土壤篩選的JT4對緩解苜蓿耐鹽堿性效果優(yōu)于從莖內(nèi)篩選的JJ5。由于土壤和植物根內(nèi)微環(huán)境比莖內(nèi)復(fù)雜，微生物通過復(fù)雜的環(huán)境選擇壓力而存活，因此根際細(xì)菌比植物內(nèi)生細(xì)菌效果好。而高潔云［28］發(fā)現(xiàn)根際中的細(xì)菌其ACC脫氨酶活性高于植物體內(nèi)的細(xì)菌，能提高植物的抗鹽性，本試驗結(jié)果與其基本一致。JG1和JJ5屬于沙雷氏桿菌，謝金宏［29］研究了水稻（Oryza sativa）根際微生物對改良鹽堿地的作用，發(fā)現(xiàn)在沙雷氏桿菌的作用下，鹽堿土地的pH有所降低，土壤有機質(zhì)含量增加，是因為其分泌物幾丁質(zhì)酶可以分解土壤中昆蟲骨骼的幾丁質(zhì)，從而增加了土壤有機質(zhì)含量和降低了土壤pH。促生細(xì)菌JT4屬于嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)領(lǐng)域有著巨大的應(yīng)用前景，一些寡養(yǎng)單胞菌屬菌株可以分泌合成抵抗致病性的酶，降低植物患病的概率［30］，單胞菌屬菌含有重金屬抗性基因，對重金屬有強耐受性和強還原力，以及對氯化農(nóng)藥有強降解能力［31］，因此可以提高植物的抗性。

4 結(jié)論

3株促生細(xì)菌均能緩解鹽堿脅迫對紫花苜蓿的抑制作用，促進(jìn)紫花苜蓿生長，不同促生細(xì)菌對鹽堿脅迫下苜蓿促生效果為JT4＞JG1＞JJ5。