施氮對(duì)苜蓿初花期光合日變化、葉片形態(tài)及干物質(zhì)產(chǎn)量的影響

孫延亮，趙俊威，劉選帥，李生儀，馬春暉，王旭哲，張前兵

（石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆 石河子 832003）

氮素是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，植物生長所需要的主要礦物質(zhì)元素中，氮素占40%以上，且氮素是植物體內(nèi)核酸、氨基酸和蛋白質(zhì)等大分子有機(jī)氮化合物的重要組成元素，也是植物葉綠素、植物激素、光合酶及維生素的主要成分，因此氮在植物生命活動(dòng)中具有首要地位，被稱為“生命元素”［1-2］。目前為止，地球上可自由獲得的氮主要來源于大氣中的N2，但是大部分植物依賴其可利用的氮形式（主要為銨鹽和硝酸鹽）來生長，而這些氮基質(zhì)的可利用性則依賴于不同的氮轉(zhuǎn)化反應(yīng)，包括豆科植物的根瘤菌固氮作用，微生物的硝化作用、氨化作用和同化作用。此外，土壤有機(jī)物的分解和植物根系分泌物也是氮素輸入的重要部分［3-4］。研究表明，不施氮肥土壤可利用氮的生成不能滿足植物的吸收利用，會(huì)造成土壤氮的虧缺，而氮肥的過量施用，則會(huì)嚴(yán)重?cái)_亂土壤原有的氮素循環(huán)，影響土壤生產(chǎn)力，并導(dǎo)致嚴(yán)重的環(huán)境污染［5］。紫花苜蓿（Medicago sativa）是我國大規(guī)模種植的優(yōu)質(zhì)牧草植物，因其具有干物質(zhì)產(chǎn)量高、營養(yǎng)品質(zhì)好、適應(yīng)性強(qiáng)等特點(diǎn)，被譽(yù)為“牧草之王”［6］。新疆農(nóng)田土壤普遍缺氮，苜蓿與根瘤菌的共生固氮量又不能滿足植株生長需求，因此外源氮的添加對(duì)提高苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量和產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有不可替代的重要作用［7］。

植物的光合作用是干物質(zhì)積累和產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，較高的光合面積和光合速率是獲得高產(chǎn)的基礎(chǔ)［8］。葉片是植物進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，其結(jié)構(gòu)和功能與植物光合作用密切相關(guān)［9］。研究表明，不同氮素用量對(duì)植物葉片形態(tài)、光合速率及群體質(zhì)量影響顯著，施氮可以促進(jìn)葉面積的增大，進(jìn)而增加光的捕獲面積［10］；在低氮條件下，群體葉面積相對(duì)適宜，植物葉片傾角較小，且基角和開張角表現(xiàn)為下層葉＞中層葉＞上層葉，因此植物能夠獲得更多的光照進(jìn)行光合作用，最后群體光合生物量積累較高，在高氮條件下，上層葉片葉面積更大且葉片傾角增加，對(duì)中下層葉片造成明顯的遮蔭現(xiàn)象，導(dǎo)致中下層葉片光合速率的下降，進(jìn)而導(dǎo)致群體質(zhì)量的降低［11］。苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量還遠(yuǎn)未達(dá)到其生物學(xué)極限，光合作用是構(gòu)成植物生物量的最主要因素，營養(yǎng)元素的不足被認(rèn)為是植物光合和生長的潛在限制因素［12］。研究發(fā)現(xiàn)，適量的氮添加可以緩解苜蓿生長的氮限制，促進(jìn)苜蓿葉片的光合作用，但隨著氮肥施用量的增加，氮素添加的正向效應(yīng)發(fā)生了轉(zhuǎn)移，由于氮的施用量超過了苜蓿生長發(fā)育的需要，苜蓿的生長促進(jìn)作用不會(huì)進(jìn)一步增加，甚至?xí)种栖俎５纳L［13］。此外，當(dāng)土壤水分不足時(shí)，施氮量的增加有助于脫落酸（abscisic acid，ABA）的降低，從而促進(jìn)植物葉片氣孔導(dǎo)度和光合速率的增加［14］。

目前，關(guān)于紫花苜蓿光合特性的研究主要集中在品種間的比較以及水分脅迫、高溫脅迫、CO2濃度等環(huán)境因子方面，而關(guān)于紫花苜蓿葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)特征與光合日變化關(guān)系以及對(duì)外界環(huán)境的適應(yīng)性方面的研究較少，尤其是施氮對(duì)滴灌苜蓿葉片形態(tài)、光合日變化及干物質(zhì)產(chǎn)量的影響機(jī)制鮮見報(bào)道。因此，本研究設(shè)置了4個(gè)施氮水平，對(duì)紫花苜蓿光合日變化、葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)變化及產(chǎn)量構(gòu)成等指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，探討不同施氮水平下紫花苜蓿葉片結(jié)構(gòu)和光合特性的變化規(guī)律，分析葉片氮含量、葉片形態(tài)、光合日變化與干物質(zhì)產(chǎn)量之間的關(guān)系，以期進(jìn)一步明確施氮對(duì)紫花苜蓿干草產(chǎn)量形成的影響機(jī)制，進(jìn)而為優(yōu)化實(shí)際生產(chǎn)中紫花苜蓿的氮管理策略提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)地概況

試驗(yàn)地位于新疆石河子市石河子大學(xué)牧草實(shí)驗(yàn)站（44°20′N，86°30′E，海拔420 m），地處天山北麓中段，準(zhǔn)噶爾盆地南緣，屬于溫帶大陸性干旱氣候。全年降水稀少，氣候干燥，冬季長而嚴(yán)寒，夏季短而炎熱，試驗(yàn)區(qū)以灰漠土為主。土壤耕層（0～20 cm）含有機(jī)質(zhì)21.56 g·kg-1，全氮1.18 g·kg-1，全磷0.53 g·kg-1，速效鉀119.8 mg·kg-1。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)采用單因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)，設(shè)置4個(gè)施氮水平，分別為施氮肥：0（CK）、60（N1）、120（N2）和180 kg·hm-2（N3），重復(fù)3次，共12個(gè)小區(qū)。試驗(yàn)所用氮肥為尿素（含N 46%），通過滴灌系統(tǒng)采用“氮隨水走”的高效節(jié)水節(jié)肥方式，在苜蓿返青后分枝期及前3茬刈割后3～5 d隨水滴施。

供試紫花苜蓿品種為高產(chǎn)、抗鹽堿、耐低溫的WL366HQ，于2019年進(jìn)行人工條播，播種量為18 kg·hm-2，播種行距為20 cm，播種深度為2 cm，播前進(jìn)行土地深翻，為苜蓿根系的深入提供良好環(huán)境，播后及時(shí)進(jìn)行鎮(zhèn)壓，有利于種子和土壤的緊密結(jié)合以及土壤表層的保墑。滴灌帶淺埋至地表下10 cm，間距為60 cm，所用滴灌帶為內(nèi)鑲片式滴灌帶，其滴頭間距為20 cm。各小區(qū)面積均為24 m2（4 m×6 m），小區(qū)四周設(shè)置1 m的保護(hù)行，防止小區(qū)間養(yǎng)分、水分的滲透，田間管理措施除施肥外，其他灌溉、中耕除草、病蟲害防治等管理均按照當(dāng)?shù)馗弋a(chǎn)苜蓿田統(tǒng)一進(jìn)行。

1.3 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.3.1 光合特性測(cè)定 于紫花苜蓿第二茬初花期期間（2020年6月26日，苜蓿開花5%～10%），采用Li-6400便攜式光合作用測(cè)定系統(tǒng)，在晴朗無云的天氣進(jìn)行田間活體測(cè)定，隨機(jī)選擇生長良好的苜蓿植株，測(cè)定其倒數(shù)第3片完全展開的健康完整葉片，測(cè)定時(shí)間為10：00-20：00，每隔2 h測(cè)定1次，每個(gè)小區(qū)隨機(jī)選取6個(gè)葉片測(cè)定，測(cè)定 指 標(biāo) 包 括 凈 光 合 速 率（net photosynthetic rate，Pn，μmol CO2·m-2·s-1）、胞 間CO2濃 度（intercellular CO2concentration，Ci，μmol·mol-1）、氣孔導(dǎo)度（stomatal conductance，Gs，cm·s-1）、蒸騰速率（transpiration rate，Tr，mmol H2O·m-2·s-1）等生理因子，并記錄光合有效輻射（photosynthetically active radiation，PAR，μmol·m-2·s-1）、田間CO2濃 度（field CO2concentration，Ca，μmol·mol-1）、空 氣 相 對(duì) 濕 度（relative air humidity，RH，%）、氣 溫（atmospheric temperature，Ta，℃）、葉表飽和蒸汽壓（leaf surface saturated vapor pressure，Vpdl，Kpa）等環(huán)境因子。苜蓿葉片的氣孔限制值（stomatal limitation value，Ls）和瞬時(shí)水分利用效率（water use efficiency，WUE）分別采用以下公式計(jì)算：

1.3.2 葉片性狀 每個(gè)小區(qū)采集12個(gè)葉片（倒數(shù)第3片完全展開的健康完整葉片）帶回實(shí)驗(yàn)室，使用掃描儀（EpsonScan V700，日本）獲取葉片的圖像，采用Image Pro Plus軟件對(duì)葉長、葉寬和葉面積（leaf area，LA）進(jìn)行測(cè)量；每個(gè)小區(qū)選12株具有代表性的苜蓿植株，剪取苜蓿全株成熟葉片（未展開葉片和枯黃葉片除外），通過Image Pro Plus軟件測(cè)定其總面積，然后烘干稱重，比葉重（specific leaf weight，SLW）通過葉片烘干總重與總面積的比值計(jì)算；葉片氮含量采用凱氏定氮法測(cè)定。

1.3.3 干物質(zhì)產(chǎn)量及莖葉比 采用樣方法測(cè)定，在光合測(cè)定結(jié)束后隨機(jī)選取長勢(shì)一致且能夠代表本小區(qū)長勢(shì)的苜蓿樣方（1 m×1 m）進(jìn)行刈割，重復(fù)3次，留茬5 cm左右，另取400 g左右?guī)Щ貙?shí)驗(yàn)室，于105℃下殺青30 min后65℃烘干至恒重，計(jì)算出苜蓿含水率并進(jìn)一步折算出苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量；將烘干后的苜蓿樣品進(jìn)行莖葉分離，并分別稱重，莖葉比通過莖稈的重量和葉片的重量的比值計(jì)算。

1.3.4 光合產(chǎn)物測(cè)定 將烘干粉碎后的全株苜蓿樣品通過蒽酮比色法對(duì)淀粉和可溶性糖含量進(jìn)行測(cè)定［15］。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Microsoft Excel 2016整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，采用SPSS 22（SPSS Inc.，美國）進(jìn)行方差分析、數(shù)據(jù)的z-score標(biāo)準(zhǔn)化，采用Origin Pro 2021（Origin Lab，美國）進(jìn)行主成分分析（principal component analysis，PCA）和繪圖，采用Image Pro Plus 6.1（Media Cybernetics，美國）對(duì)掃描苜蓿葉片獲得的圖像進(jìn)行葉長、葉寬、葉面積的測(cè)量；采用IBM SPSS AMOS 24（SPSS Inc.，美國）進(jìn)行結(jié)構(gòu)方程模型的計(jì)算，分析主要環(huán)境因子與凈光合速率和蒸騰速率的關(guān)系，以及葉片氮含量、主要光合性能和葉片形態(tài)指標(biāo)與干物質(zhì)產(chǎn)量的關(guān)系，采用多個(gè)模型適配性參數(shù)對(duì)模型進(jìn)行合理的評(píng)價(jià)，主要包括卡方值與自由度之比小于3、顯著性概率值大于0.05、近似誤差平方根小于0.1、比較模型指數(shù)大于0.9、Tucker-Lewis指數(shù)大于0.9、擬合優(yōu)度指數(shù)大于0.9、規(guī)范擬合指數(shù)大于0.9，當(dāng)模型符合各個(gè)評(píng)價(jià)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，說明該模型適配度較好。采用Microsoft PowerPoint 2016進(jìn)行結(jié)構(gòu)方程模型的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 田間環(huán)境因子日變化

在10：00-20：00，光合有效輻射（PAR）日變化呈“單峰”曲線，從10：00開始，隨著時(shí)間的推移，PAR逐漸增加，至14：00時(shí)達(dá)到最大值，之后逐漸下降，至20：00達(dá)到最低值（圖1）。田間CO2濃度（Ca）的變化規(guī)律為“V”型，早上10：00為最大值，隨后緩慢下降，在16：00降至最低值，隨后又逐漸回升。在光合日變化測(cè)定期間，空氣相對(duì)濕度（RH）的變化幅度為12.85%～28.95%，在10：00左右時(shí)為最高，此后隨著溫度的迅速升高而快速下降，在16：00降至最低值，之后隨著大氣溫度的降低又有所回升。大氣溫度（Ta）在一天當(dāng)中為10：00最低，此后隨著光合有效輻射的增加而逐漸升高，在16：00達(dá)到最高點(diǎn)，為41.05℃，其峰值相對(duì)PAR略有滯后，之后隨著光合有效輻射的降低而緩慢下降。葉表飽和蒸汽壓（Vpd）l的變化規(guī)律和Ta的變化趨勢(shì)一致。

圖1 田間環(huán)境因子日變化Fig.1 Daily variation of environmental factors in the field

2.2 不同施氮水平對(duì)苜蓿葉片光合日變化的影響

2.2.1 紫花苜蓿葉片凈光合速率日變化特征 施氮處理（N1、N2、N3處理）凈光合速率（Pn）日均值均極顯著大于不施氮處理（P＜0.01），不同施氮水平下，紫花苜蓿葉片凈光合速率日變化趨勢(shì)均呈典型的“雙峰”曲線（圖2），光合測(cè)定期間，N2處理的Pn均高于其他處理，上午10：00-12：00呈快速上升趨勢(shì)，12：00出現(xiàn)第一峰值，且為全天最大值，隨后在14：00各處理紫花苜蓿均出現(xiàn)不同程度的“光合午休”，隨后又呈上升趨勢(shì)，在16：00左右出現(xiàn)第二峰值，此后又緩慢下降，至20：00降至一天中最低值。各處理紫花苜蓿的日平均凈光合速率N2處理最高，其次分別為N3、N1、CK處理（圖3a）。

圖2 不同施氮水平下苜蓿葉片凈光合速率日變化Fig.2 Daily variation of net photosynthetic rate of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.2.2 紫花苜蓿葉片蒸騰速率日變化特征 不同施氮水平下，紫花苜蓿葉片蒸騰速率（Tr）日變化進(jìn)程與凈光合速率基本一致，均為不對(duì)稱“雙峰”曲線，但其峰值出現(xiàn)時(shí)間相對(duì)凈光合速率滯后2 h左右（圖4）。光合測(cè)定期間，N2處理的Tr均高于其他處理，上午10：00-14：00呈快速上升趨勢(shì)，14：00出現(xiàn)第一峰值，且為全天最大值，隨后在16：00時(shí)各個(gè)處理均處在谷底，第二峰值出現(xiàn)在18：00左右，此后Tr急速下降，至20：00達(dá)到一天中最低值。各處理紫花苜蓿的日平均蒸騰速率由大到小的順序依次為N2＞N3＞N1＞CK處理，且N2、N3處理之間差異不顯著，但施氮處理均顯著大于不施氮處理（P＜0.05）（圖3b）。

圖3 不同施氮水平下苜蓿葉片光合參數(shù)日均值Fig.3 Daily average values of photosynthetic parameters of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

圖4 不同施氮水平下苜蓿葉片蒸騰速率日變化Fig.4 Daily variation of transpiration rate of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.2.3 紫花苜蓿葉片胞間CO2濃度日變化特征 不同施氮水平下，紫花苜蓿葉片胞間CO2濃度（Ci）日變化進(jìn)程呈現(xiàn)“V”型的變化（圖5），上午10：00為全天的最大值，隨著時(shí)間的推移，苜蓿葉片Ci逐漸下降，在14：00達(dá)到一天中最低值，此后，在20：00又快速回升至“V”型另一個(gè)高點(diǎn)。各處理紫花苜蓿的日平均Ci中N2處理最低，其次分別為N3、N1、CK處理且施氮處理均顯著小于不施氮處理（P＜0.05）（圖3c）。

圖5 不同施氮水平下苜蓿葉片胞間CO2濃度日變化Fig.5 Daily variation of intercellular CO2 concentration in alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.2.4 紫花苜蓿葉片氣孔限制值日變化特征 不同施氮水平下，紫花苜蓿葉片氣孔限制值（Ls）日變化進(jìn)程呈現(xiàn)“倒V”型的變化趨勢(shì)，整體變化規(guī)律與胞間CO2濃度相反（圖6）。上午10：00和下午20：00為氣孔限制值較低的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，由于溫度的升高，上午10：00-14：00為快速增長階段，14：00到達(dá)全天最大值，隨后緩慢降低。其中施氮處理紫花苜蓿的日平均氣孔限制值均顯著大于不施氮處理（圖3d）。

圖6 不同施氮水平下苜蓿葉片氣孔限制值日變化Fig.6 Daily variation of stomatal limitation value of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.2 .5紫花苜蓿葉片水分利用效率日變化特征

不同施氮水平下，紫花苜蓿葉片水分利用效率（WUE）日變化進(jìn)程均呈不對(duì)稱“雙峰”曲線（圖7），苜蓿葉片水分利用效率在上午的10：00-12：00為一天中最高的時(shí)段，其中12：00出現(xiàn)第一個(gè)峰值，隨后快速下降，于14：00達(dá)到谷值，這是由于苜?！肮夂衔缧荨睂?dǎo)致凈光合速率下降，16：00達(dá)到第二個(gè)峰值，但第二個(gè)峰值明顯低于第一個(gè)峰值。各處理紫花苜蓿的日平均水分利用效率由大到小的順序依次為N2＞N3＞N1＞CK處理（圖3e）。

圖7 不同施氮水平下苜蓿葉片水分利用效率日變化Fig.7 Daily variation of water use efficiency of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.3 不同施氮水平對(duì)苜蓿葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

紫花苜蓿葉面積、葉長、葉寬、比葉重均隨著施氮水平的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)（表1）。N2處理下紫花苜蓿的葉面積和比葉重顯著高于其他各處理（P＜0.05），N2和N3處理間的葉長和葉寬差異不顯著（P＞0.05），但N2和N3處理均顯著高于CK和N1處理（P＜0.05）。施氮水平對(duì)初花期紫花苜蓿葉面積、葉長、葉寬、比葉重均具有極顯著的影響（P＜0.01）。由F值可知，施氮水平對(duì)紫花苜蓿葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響最大的為葉面積，其次為比葉重、葉長和葉寬。

表1 不同施氮水平下苜蓿葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)變化Table 1 Changes in morphological structure of alfalfa leaves under different levels of nitrogen application

2.4 不同施氮水平對(duì)苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量構(gòu)成、光合產(chǎn)物以及葉片氮含量的影響

隨施氮量的增加，紫花苜蓿的干物質(zhì)產(chǎn)量、葉干重、莖干重、葉片氮含量、淀粉、可溶性糖含量均呈先增加后降低的趨勢(shì)，而莖葉比則呈先降低后增加的趨勢(shì)（表2）。紫花苜蓿的干物質(zhì)產(chǎn)量、葉干重、可溶性糖含量為N2處理顯著高于CK和N3處理（P＜0.05），施氮處理間紫花苜蓿的莖干重和莖葉比差異不顯著（P＞0.05），但施氮處理的莖干重顯著大于不施氮處理（P＜0.05），莖葉比顯著小于不施氮處理（P＜0.05），且N2處理的葉片氮含量、淀粉含量顯著大于其他各處理（P＜0.05）。施氮水平對(duì)初花期紫花苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量、葉干重、莖干重、葉片氮含量和淀粉均具有極顯著影響（P＜0.01），對(duì)莖葉比和可溶性糖具有顯著影響（P＜0.05）。由F值可知，施氮水平對(duì)葉片氮含量影響最大，其次分別為葉干重、干物質(zhì)產(chǎn)量、淀粉、莖干重、可溶性糖、莖葉比。

表2 不同施氮水平下苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量構(gòu)成、光合產(chǎn)物和葉片氮含量Table 2 Dry matter yield components，photosynthetic products and nitrogen content of leaves of alfalfa at different nitrogen application levels

2.5 不同施氮水平下紫花苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量、葉片形態(tài)以及光合作用的主成分分析及綜合評(píng)價(jià)

通過主成分分析對(duì)不同施氮水平下苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量、葉片形態(tài)以及光合作用進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)（圖8），綜合特征值大于1且累計(jì)方差貢獻(xiàn)率大于90%來確定最佳的主成分?jǐn)?shù)。結(jié)果表明，第1主成分對(duì)總方差貢獻(xiàn)率達(dá)89.5%，其中比葉重、干物質(zhì)產(chǎn)量、葉面積、葉寬、葉片氮含量、凈光合速率、蒸騰速率、胞間CO2濃度、水分利用率貢獻(xiàn)較大，第2主成分對(duì)總方差貢獻(xiàn)率達(dá)8.0%，其中可溶性糖和淀粉貢獻(xiàn)較大，而比葉重貢獻(xiàn)最小，主成分1和主成分2累計(jì)貢獻(xiàn)率達(dá)到97.5%，可以代表紫花苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量、葉片形態(tài)以及光合作用的絕大部分信息。不同處理下，第1主成分得分由高到低依次為N2＞N3＞N1＞CK處理，第2主成分得分由高到低依次為N1＞N2＞CK＞N3處理，綜合主成分1和2可知，不同施氮處理下干物質(zhì)產(chǎn)量、葉片形態(tài)以及光合作用綜合得分最高的為N2處理，其次分別為N3、N1和CK處理。

圖8 不同施氮水平下苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量、葉片形態(tài)以及光合作用的主成分分析Fig.8 Principal component analysis of dry matter yield，leaf morphology and photosynthesis of alfalfa under different levels of nitrogen application

2.6 基于結(jié)構(gòu)方程模型綜合分析主要環(huán)境因子與凈光合速率和蒸騰速率的關(guān)系

4個(gè)環(huán)境因子共解釋了凈光合速率84%的差異，通過標(biāo)準(zhǔn)化影響柱狀圖可以發(fā)現(xiàn)（圖9），葉表飽和蒸汽壓（rd=-0.31，rd：直接回歸權(quán)重系數(shù)）對(duì)凈光合速率有直接影響；空氣相對(duì)濕度直接（rd=0.33）和間接（ri=0.26，ri：間接回歸權(quán)重系數(shù)）通過葉表飽和蒸汽壓影響凈光合速率；光合有效輻射直接（rd=0.96）或間接（ri=-0.23）通過空氣相對(duì)濕度（r=0.01，r：回歸權(quán)重系數(shù)）、大氣溫度（r=0.54）以及葉表飽和蒸汽壓（r=-0.26）影響凈光合速率；大氣溫度直接（rd=0.03）或間接（ri=-0.61）通過空氣相對(duì)濕度（r=-0.90）和葉表飽和蒸汽壓（r=0.01）影響凈光合速率。4個(gè)環(huán)境因子還解釋了蒸騰速率73%的差異，通過標(biāo)準(zhǔn)化影響柱狀圖可以發(fā)現(xiàn)，葉表飽和蒸汽壓（rd=-0.61）對(duì)蒸騰速率有直接影響；空氣相對(duì)濕度直接（rd=-0.76）和間接（ri=0.51）通過葉表飽和蒸汽壓影響蒸騰速率；光合有效輻射直接（rd=0.67）或間接（ri=0.17）通過空氣相對(duì)濕度（r=0.01）、大氣溫度（r=0.54）以及葉表飽和蒸汽壓（r=-0.26）影響蒸騰速率；大氣溫度直接（rd=-0.03）或間接（ri=-0.06）通過空氣相對(duì)濕度（r=-0.90）和葉表飽和蒸汽壓（r=0.01）影響蒸騰速率。

圖9 基于結(jié)構(gòu)方程模型綜合分析主要環(huán)境因子與凈光合速率和蒸騰速率的關(guān)系Fig.9 Integrated analysis of the relationship between major environmental factors and net photosynthetic rate and transpiration rate based on structural equation model

2.7 基于結(jié)構(gòu)方程模型綜合分析葉片氮含量、主要光合性能和葉片形態(tài)指標(biāo)與干物質(zhì)產(chǎn)量的關(guān)系

葉片氮含量、葉面積、比葉重、凈光合速率、蒸騰速率共解釋了干物質(zhì)產(chǎn)量88%的變異，通過標(biāo)準(zhǔn)化影響柱狀圖可以發(fā)現(xiàn)（圖10），凈光合速率（rd=0.60）對(duì)干物質(zhì)產(chǎn)量有直接影響；蒸騰速率直接（rd=-0.02）或間接（ri=0.53）通過凈光合速率（r=0.89）影響干物質(zhì)產(chǎn)量的形成；葉面積直接（rd=-0.07）或間接（ri=0.59）通過比葉重（r=0.65）和蒸騰速率（r=0.90）影響干物質(zhì)產(chǎn)量的形成；比葉重直接（rd=0.18）或間接（ri=0.02）通過蒸騰速率（r=0.05）影響干物質(zhì)產(chǎn)量的形成；葉片氮含量直接（rd=0.30）或間接（ri=0.56）通過葉面積（r=0.84）、比葉重（r=0.27）、凈光合速率（r=0.09）和蒸騰速率（r=0.03）影響干物質(zhì)產(chǎn)量的形成。

圖10 基于結(jié)構(gòu)方程模型綜合分析葉片氮含量、主要光合性能和葉片形態(tài)指標(biāo)與干物質(zhì)產(chǎn)量的關(guān)系Fig.10 Integrated analysis of leaf nitrogen content，major photosynthetic properties and leaf morphological indicators in relation to dry matter yield based on structural equation model

3 討論

3.1 不同氮素水平對(duì)紫花苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量的影響

土壤氮含量和生物固氮是紫花苜蓿兩個(gè)可供選擇的氮獲取策略，外源氮的添加能夠有效地增加土壤氮資源有效性，而土壤氮有效性能夠?qū)④俎Ｖ仓觊g競(jìng)爭(zhēng)的壓力從地下轉(zhuǎn)移到地上，以誘導(dǎo)更多的資源分配到以葉片為主的地上部分［16］。本研究中，苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量隨著施氮量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，對(duì)比不施氮處理，氮添加顯著提高了干物質(zhì)產(chǎn)量，目前關(guān)于苜蓿在種植過程中是否需要額外的氮肥添加或者氮肥添加量的大小以提高其干物質(zhì)產(chǎn)量這一關(guān)鍵問題上仍存在較大爭(zhēng)議，有一部分觀點(diǎn)認(rèn)為苜?？梢耘c根瘤菌共生固氮，將大氣中的氮?dú)廪D(zhuǎn)化為可以供植物吸收利用的形態(tài)以滿足自身植株生長的需要，因此，氮肥的添加并不會(huì)對(duì)苜蓿的生長有促進(jìn)作用［17］，也有一部分觀點(diǎn)認(rèn)為施少量的氮能夠促進(jìn)苜蓿的生長，在苜蓿生長初期及衰老期苜蓿根瘤菌固氮酶活性較弱，外源氮的添加能夠顯著的提高苜蓿的干物質(zhì)產(chǎn)量［13］。相反，氮肥的過量施入則會(huì)抑制苜蓿的生長發(fā)育，過量的氮添加會(huì)破壞土壤微環(huán)境，土壤本身具有一定的緩沖能力，其所含有的銨態(tài)氮和硝態(tài)氮在被植物吸收時(shí)向土壤釋放的H+和OH-能夠相互中和，當(dāng)外界添加銨態(tài)氮或硝態(tài)氮的任意一種就會(huì)打破這種平衡［18］，同時(shí)，土壤的酸化和堿化并不利于微生物的活動(dòng)與繁殖，進(jìn)而影響苜蓿田的生物固氮以及土壤養(yǎng)分平衡和可持續(xù)利用能力［19］。對(duì)于氮肥添加是否促進(jìn)或者抑制苜蓿的生長，或是沒有影響，本研究認(rèn)為，除了可能由上述的根瘤菌固氮、土壤pH值和微生物數(shù)量的變化造成的影響外，還可能與苜蓿品種特性、地區(qū)間環(huán)境差異及土壤基礎(chǔ)養(yǎng)分含量密不可分，因此，施氮對(duì)苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量的作用效果因不同的研究地區(qū)而導(dǎo)致研究結(jié)果不同。本研究中，對(duì)比不施氮處理，施氮處理苜蓿葉片干重增加了7.83%～11.98%，莖稈干重增加了3.6%～6.4%，葉片干重增加幅度更大，說明施氮處理下苜蓿植株會(huì)將更多的生物量向葉片分配，同時(shí)，本研究中施氮處理莖葉比的下降也能夠反映這一點(diǎn)。

3.2 不同氮素水平對(duì)紫花苜蓿光合作用的影響

植物光合作用是維持自身生命活動(dòng)的主要能量來源，實(shí)際光能轉(zhuǎn)化效率僅為理論值的25%左右，仍有很大的提升空間，進(jìn)一步地提高光能轉(zhuǎn)化效率已成為大幅度提高作物干物質(zhì)產(chǎn)量的重要甚至是唯一可行的途徑［20］。本研究中，在光合日變化測(cè)定期間，施氮處理的凈光合速率、蒸騰速率和水分利用效率均高于不施氮處理，這說明施氮能夠促進(jìn)苜蓿的光合作用。研究表明，葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要物質(zhì)基礎(chǔ)，氮素能夠提高苜蓿葉片的葉綠素含量，并延緩葉片的衰老速度，進(jìn)而提高苜蓿生長后期的葉片氮含量和凈光合速率［21］，此外，施氮能夠促進(jìn)葉片柵欄組織和海綿組織的發(fā)育，高度發(fā)達(dá)的柵欄組織既能夠最大限度利用衍射光進(jìn)行光合作用，又能夠促進(jìn)葉片水分的高效運(yùn)輸，并避免葉肉組織被強(qiáng)光照灼燒，而海綿組織的增厚能夠?yàn)楣夂线^程中氣體的交換提供足夠的空間，柵欄組織和海綿組織的協(xié)同優(yōu)化可以更有效地促進(jìn)苜蓿光合作用的提高［22］。在本研究中，施氮處理下的胞間CO2濃度低于不施氮處理，這可能是由于施氮條件下苜蓿凈光合速率增加，同時(shí)葉片內(nèi)的CO2消耗加快，氣體交換的速度并不能達(dá)到葉片同化CO2的速率，從而導(dǎo)致胞間CO2濃度的下降。

逆境常常抑制植物光合作用，使得植物光合作用能力明顯降低［23］。大多數(shù)植物在夏季中午均有光合“午休”的現(xiàn)象，特別是在干旱脅迫以及營養(yǎng)供給不足等逆境條件下。本研究中，不同施氮水平下，紫花苜蓿凈光合速率日變化均呈不對(duì)稱“雙峰”曲線，中午14：00出現(xiàn)光合“午休”，此時(shí)光抑制程度最嚴(yán)重。與前人的研究結(jié)果相比［24］，本研究中的光合“午休”出現(xiàn)的時(shí)間延遲了1～2 h，導(dǎo)致光合午休出現(xiàn)時(shí)間不一致，一部分原因可能是試驗(yàn)地點(diǎn)處于不同的時(shí)區(qū)，具有2 h左右的時(shí)差，還可能是因?yàn)檐俎ＩL的年限不同，本研究是在苜蓿種植的第2年進(jìn)行，對(duì)強(qiáng)光照和高溫具有很好的適應(yīng)性，而前人的研究中苜蓿生長年限在4年以上，這時(shí)苜蓿的生長性能及光合能力均有所下降，進(jìn)而導(dǎo)致光合作用的高峰和低谷出現(xiàn)時(shí)間有所差異［25］。另有研究認(rèn)為，苜蓿并不全會(huì)出現(xiàn)光合“午休”現(xiàn)象，本研究結(jié)果與此不一致，可能是由于未出現(xiàn)光合午休的苜蓿品種具有較強(qiáng)的光合能力和應(yīng)對(duì)高溫環(huán)境的適應(yīng)能力，以及灌溉方式、光照輻射和空氣濕度的高低不同等［26］。

植物葉片光合作用的氣體交換主要受氣孔因素和非氣孔因素的影響［27］，本研究中，苜蓿葉片凈光合速率和氣孔限制值隨著施氮量的增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，而胞間CO2濃度呈先降低后增加的趨勢(shì)，不同施氮條件下苜蓿葉片凈光合速率和胞間CO2濃度呈負(fù)相關(guān)，這說明低氮和高氮條件下苜蓿光合作用主要受到非氣孔因素的影響，這可能是由于低氮和高氮均會(huì)對(duì)苜蓿造成脅迫，導(dǎo)致苜蓿光合酶受到抑制從而使光合能力下降［27］。本研究中，在10：00-12：00，苜蓿凈光合速率和氣孔限制值呈上升的趨勢(shì)，而胞間CO2濃度呈下降的趨勢(shì)，這說明在這個(gè)時(shí)間段凈光合速率主要受到環(huán)境因子和光合活性的影響，與胞間CO2濃度的變化關(guān)系不大；在12：00-16：00，苜蓿葉片的凈光合速率和胞間CO2濃度均呈先降低后增加的趨勢(shì)，氣孔限制值呈相反的趨勢(shì)，凈光合速率和胞間CO2濃度呈正相關(guān)，這說明光合“午休”的出現(xiàn)主要受到胞間CO2濃度的限制，這可能是由于中午光照強(qiáng)，氣溫高，苜蓿葉片水分蒸發(fā)快，為了適應(yīng)外界環(huán)境變化，苜蓿葉片部分氣孔關(guān)閉，導(dǎo)致葉片氣孔導(dǎo)度下降［24］，從而影響苜蓿葉片內(nèi)CO2的交換；在16：00-20：00，這個(gè)時(shí)間段與上午12：00之前規(guī)律一致，凈光合速率和氣孔限制值與胞間CO2濃度均呈負(fù)相關(guān)，說明這個(gè)時(shí)間段限制凈光合速率的主要是光照強(qiáng)度和光合活性的下降。

3.3 不同氮素水平對(duì)紫花苜蓿葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響

葉片是苜蓿進(jìn)行光合作用的主要場(chǎng)所，光合作用是苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量形成的基礎(chǔ)，葉片形態(tài)作為苜蓿生產(chǎn)最重要的生長指標(biāo)，是除單葉光合速率以外決定最終干物質(zhì)產(chǎn)量的重要參數(shù)［28-29］。植物葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)變化與其生理功能和外界環(huán)境密切相關(guān)，在長期氮肥添加的影響下，葉片的形態(tài)結(jié)構(gòu)會(huì)發(fā)生一定的生理性適應(yīng)［19］。氮素對(duì)苜蓿葉片形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響是多方面因素綜合作用的結(jié)果，研究表明，氮素對(duì)植物葉片柵欄細(xì)胞的分裂和發(fā)育以及海綿細(xì)胞的發(fā)育有促進(jìn)作用，尤其是在植物生長中后期，隨著氮含量的增加這種促進(jìn)作用逐漸增強(qiáng)［2］。氮還是光合色素合成的必要成分，施氮可以提高光合色素含量，進(jìn)一步提高葉片的光合固碳能力，在葉片氮限制的條件下，添加適宜的氮肥有助于提高植物的光能利用效率［23］。本研究中，施氮處理苜蓿葉長、葉寬、葉面積均顯著高于不施氮處理，這與前人的研究相一致［30］。氮是葉綠素和光合蛋白質(zhì)的重要組成部分，能夠有效地促進(jìn)葉片的生長［31］。葉面積的增大能有效增加植物葉片的捕光面積，提高植物的生長速率，但是，葉面積的增大會(huì)升高植物的蒸騰速率，造成細(xì)胞水勢(shì)和膨壓的升高。而當(dāng)?shù)蔬^量時(shí)會(huì)造成葉片CO2同化能力降低，不利于中后期葉片光合同化物的積累與運(yùn)輸，進(jìn)而抑制苜蓿的葉片生長。氮素除了直接作用于植物葉片面積的增加，還能夠延緩葉片的衰老。研究表明，葉片衰老與植物體自身的生命周期有關(guān)，并受到葉片氮缺乏的誘導(dǎo)，葉片氮缺乏最先出現(xiàn)在下層葉片上，從葉尖沿著葉片中脈向著葉片基部逐漸失綠干枯［22］。有研究表明，ORE1是調(diào)控?cái)M南芥（Arabidopsis thaliana）葉片自然衰老的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，過量表達(dá)會(huì)誘導(dǎo)葉片提前出現(xiàn)衰老，其中ORE1是缺氮誘導(dǎo)葉片衰老的主要因素，并受到NLA/PHO2的調(diào)節(jié)［8］。此外，施氮還能夠促進(jìn)比葉重的增加，升高的比葉重主要是由于柵欄葉肉層的增加或者柵欄細(xì)胞的延伸，與此同時(shí)，葉片韌性和密度會(huì)影響葉片色素的含量和分布，從而說明比葉重和光合作用密切相關(guān)［22］。

4 結(jié)論

施氮能夠增加紫花苜蓿的凈光合速率、蒸騰速率和水分利用效率，降低胞間CO2濃度。隨著施氮量的增加，紫花苜蓿的葉長、葉寬、葉面積、比葉重，以及葉片干重、莖稈干重、干物質(zhì)產(chǎn)量、葉片氮含量、淀粉和可溶性糖含量均呈先增加后降低的趨勢(shì)。綜合來看，增施氮肥有助于苜蓿光合面積和光合速率的協(xié)同改進(jìn)，有利于光合產(chǎn)物的合成，從而促進(jìn)苜蓿干物質(zhì)產(chǎn)量的提高，當(dāng)施氮量為120 kg·hm-2時(shí)提升效果最為明顯。